一种菊花B病毒的RPA检测方法与流程

一种菊花b病毒的rpa检测方法
技术领域
1.本发明涉及园林植物分子生物学领域，特别是涉及一种菊花b病毒的rpa检测方法。


背景技术：

2.菊花b病毒在菊科植物中普遍存在，目前其检测技术主要有血清学检测法、pcr技术、多重pcr技术、环介导等温扩增技术等。现有技术需要pcr仪器，且反应时间很长，需要付出大量精力和时间，成本也较高。


技术实现要素：

3.本发明要解决的技术问题是提供一种操作简便、反应时间短的菊花b病毒的rpa检测方法。
4.一种菊花b病毒检测的rpa特异性引物对，其特征在于：核苷酸序列如序列表中seq id no:1和seq id no:2所示。
5.本发明所述的菊花b病毒检测的rpa特异性引物对在检测或辅助检测菊花b病毒，或制备检测或辅助检测菊花b病毒的产品中的应用。
6.一种用于菊花b病毒检测的试剂盒，包括本发明所述的菊花b病毒检测的rpa特异性引物对。
7.本发明所述的用于菊花b病毒检测的试剂盒，还包括rpa恒温扩增试剂、植物总rna提取试剂和反转录试剂。
8.本发明所述的用于菊花b病毒检测的试剂盒在检测或辅助检测菊花b病毒，或制备检测或辅助检测菊花b病毒的产品中的应用。
9.一种菊花b病毒的rpa检测方法，包括如下步骤：
10.(1)样品处理：从待测植物样品中提取总rna，然后将其反转录成cdna；
11.(2)rpa扩增：再以cdna为模板与本发明所述的引物对进行rpa扩增；
12.(3)结果判读：根据rpa扩增的结果判断待测植物样品是否感染菊花b病毒；
13.检测标准为：
14.若rpa扩增得到的rpa扩增产物含有大小为158bp的片段，则检测的植物样品感染菊花b病毒，若rpa扩增产物不含有大小为158bp的片段，则检测的植物样品未感染菊花b病毒。
15.本发明所述的菊花b病毒的rpa检测方法，其中，所述rpa扩增的反应体系及条件如下：
16.向已装有冻干酶粉的pcr试管中依次加入干粉溶解缓冲液29.5μl，ddh2o 11.2μl，权利要求1中所述的引物对中的上下游引物各2.4μl，引物的浓度为10μmol/l，模板cdna 2μl，用移液枪混匀后，加入浓度为280mmol/l的醋酸镁2.5μl，反应体系总体积50μl，离心，于40℃金属浴40min；反应结束后，加入50μl体积比为1：1的氯仿/苯酚溶液，充分混匀，
12000rpm离心5min，取5μl上清液进行2.5％的琼脂糖凝胶电泳。
17.本发明菊花b病毒的rpa检测方法与现有技术不同之处在于：
18.本发明建立了菊花b病毒的rpa检测方法，与pcr技术相比，该技术操作简便，灵敏度高，不需pcr仪，在水浴锅、金属浴等恒温装置内均可完成扩增，反应温度在35℃～40℃内即可扩增到清晰的目的条带。与其他核酸等温扩增技术相比，该方法仅需一对引物，不需要pcr仪，简化了检测流程，缩短了检测时间，适合于病毒的快速诊断和现场检测。
19.下面结合附图对本发明的菊花b病毒的rpa检测方法作进一步说明。
附图说明
20.图1为本发明rpa扩增体系获得的电泳图；
21.图2为本发明rpa扩增体系的反应温度优化结果图；
22.图3为本发明中单一pcr与rpa检测的灵敏度比较图。
具体实施方式
23.1、实验材料：
24.cvb阳性对照为经pcr鉴定为阳性的菊花叶片。
25.2、引物设计
26.根据ncbi数据库下载的cvb的cp蛋白的基因序列，利用clustal x软件进行序列多重比对，选择保守区域使用primer 5.0软件设计多对用于rpa扩增的特异性引物序列。引物设计要求如下：引物长度30～35bp，gc含量40％～60％，尽量避免引物二聚体、发卡环等结构，扩增产物的大小为150～300bp。具体的引物序列、产物大小见下表：
[0027][0028]
3、rna提取及反转录
[0029]
取0.1g叶片使用takara公司的mini best plant rna extraction kit试剂盒提取植物总rna，取1μg的总rna采用promega公司的reverse transcription system反转录试剂盒进行反转录，最终体积为100μl。
[0030]
4、rpa扩增引物的筛选
[0031]
50μl的rpa扩增体系：向已装有冻干酶粉的pcr试管中依次加入干粉溶解缓冲液(rehydration buffer)29.5μl，ddh2o 11.2μl，上下游引物(10μmol/l)各2.4μl，模板cdna2μl，用移液枪混匀后，加入醋酸镁(280mmol/l)2.5μl，离心，于40℃金属浴40min。反应结束后，加入50μl氯仿/苯酚(1:1)溶液，充分混匀，12000rpm离心5min，取5μl上清液进行2.5％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图1。所设计的cvb的rpa引物扩增到与预期条带大小相符的片段。说明，所设计的引物特异性良好，最终选用cvb
‑
r1
‑
f/r为cvb rpa扩增的引物。
[0032]
5、rpa扩增温度的优化
[0033]
在引物确定的基础上，对病毒的rpa反应温度进行优化，结果如图2。在cvb的rpa反应体系中，当反应温度为25℃时，条带亮度较弱，随反应温度的升高，条带亮度逐渐增加，当
反应温度达到为35℃、40℃时，条带清晰，其亮度无明显差距。说明反应温度在35℃～40℃内均可有效进行rpa扩增，选用40℃为反应温度进行后续试验。
[0034]
6、rpa扩增体系
[0035]
(1)根据rpa引物筛选、温度优化，最终确定cvb的rpa反应体系、反应条件如下：
[0036]
向装有冻干酶粉的pcr试管中加入以下试剂(50μl)：
[0037][0038][0039]
混匀，向pcr试管中滴加2.5μl醋酸镁mgoac溶液(280mmol/l)，于40℃金属浴40min。待反应完成，向rpa扩增产物中加入等体积的苯酚：氯仿溶液(体积比1:1)，混匀，于12000rpm离心5min，取5μl上清液，使用2.5％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
[0040]
7、单一pcr与rpa检测的灵敏度比较
[0041]
将cvb的cdna进行10倍梯度稀释，依次稀释至10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5和10
‑6，以稀释的cdna为模板，按上述rpa扩增条件进行灵敏度试验。为与普通pcr技术进行比较，本研究同时采用普通pcr进行灵敏度试验。20μl pcr扩增体系：2
×
taq plus master mix10μl，上下游引物(10μmol/l)各1μl，模板cdna 1μl，ddh2o 7μl。pcr反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，循环35次；72℃再延伸10min。反应产物经2.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0042]
结果如图3，当cdna稀释倍数为105时，cvb的rpa与pcr检测方法均可检测到158bp的目的条带，当cdna稀释倍数为106时，病毒的rpa方法仍可以检测到目的条带，但pcr方法均未能检测到目的条带。试验结果表明，cvb的rpa检测方法的灵敏度是单一pcr的10倍，更适合于微量病毒的检测。
[0043]
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。