PPAR作用物质及其制造方法与流程

juice,13
‑
oxo
‑
9,11
‑
octadecadienoic acid,decreases plasma and hepatic triglyceride in obese diabetic mice”plos one 7(2)，e31317；
16.非专利文献2：bio l.pharm.bull.第四十二卷，937
‑
943，(2019)。
17.在日本特开2020
‑
92697中，仅记载了包括在还原剂的存在下和溶解氧降低的情况下使脂氧合酶作用于脂肪酸的、含氧脂肪酸或含氧脂肪酸的组合物的制造方法，完全没有关于使用干燥植物类的记述。
18.在日本专利第6661121号中，叙述了使由干燥大豆、枸杞、大枣、姜黄等干燥植物、蜂蜜生成的发酵培养基在发酵罐中发酵而生成发酵液的方法。该方法需要大量的发酵液，且废液还需要进行后处理。
19.在日本专利第6008983号中，叙述了使圆大豆或圆大豆加工品等发酵而制造酮十八碳二烯酸的方法。需要大量的发酵液和废液后处理。
20.在日本特开2019
‑
17370中，叙述了对啤酒粕进行碱处理而得到碱性的提取物，将其酸化，然后制造含有不饱和脂肪酸的羟基衍生物的组合物的方法。产生大量的废弃物。
21.在日本特开2017
‑
209053中，叙述了使具有特定结构的不饱和脂肪酸与至少1种植物的水提取物接触而由不饱和脂肪酸的过氧化物等构成的不饱和脂肪酸的氧化衍生物的制造方法。产生大量的废弃物。
22.在日本专利第4700601号中，叙述了从粉碎后的谷粒中提取β
‑
葡聚糖及其纯化方法。β
‑
葡聚糖为目标物。
23.在非专利文献1中，阐明了oxo
‑
ode是ppar激动剂及其在脂肪燃烧中的作用。
24.在非专利文献2中，对9
‑
hode对各种癌细胞的作用进行研究而阐明了杀癌细胞活性。


技术实现要素：

25.本发明的主要目的在于提供一种ppar作用物质及其制造方法，以解决现有技术中的ppar作用物质的制造方法存在需要纯化、提取等步骤繁琐的问题。
26.为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种ppar作用物质的制造方法，制造方法包括：提供含有脂代谢酶的干燥物质，脂代谢酶包括环氧合酶、脂氧合酶和细胞色素p450中的任意一种或多种，干燥物质为粉末状干燥植物或粉末状干燥食品；将干燥物的粉末质置于水中或缓冲液中，使脂代谢酶在底物多元不饱和脂肪酸和/或多元不饱和脂肪酸酯的作用下活化发生酶促反应，生成含ppar作用物质，从而获得含ppar作用物质的组合物。
27.进一步地，提供含有脂代谢酶的干燥物质包括：对含有脂代谢酶的植物进行非加热干燥后进行破碎，得到粉末状的干燥植物；或者对含有脂代谢酶的植物进行破碎后再进行非加热干燥，得到粉末状的干燥植物；或者将干燥食品进行破碎，得到粉末状的干燥食品。
28.进一步地，多元不饱和脂肪酸和/或多元不饱和脂肪酸酯为干燥物质内源性的或外源添加的；优选地，多元不饱和脂肪酸为由亚油酸、亚麻酸及花生四烯酸组成的组中的至少一种；优选地，多元不饱和脂肪酸酯为甘油三酯。
29.进一步地，将干燥物质置于含还原性物质的水或缓冲液。
30.进一步地，还原性物质为从由还原糖、抗坏血酸、生育酚及虾青素组成的组中选择的至少一种或多种；优选地，还原糖为葡萄糖；进一步地，水或者缓冲液中还原性物质的浓度为1.5～2.5mg/ml。
31.进一步地，粉末状的干燥物质与水或缓冲液的质量体积比以mg:μl计为1:10～1:3；优选地，酶促反应的时间为30min～300min，更优选为30min～90min；优选地，酶促反应的ph值为6～10。
32.进一步地，在生成含ppar作用物质的组合物之后，制造方法还包括：使组合物中的脂代谢酶及酶抑制性物质的活力丧失。
33.进一步地，通过加热的方式使组合物中的脂代谢酶及酶抑制性物质的活力丧失。
34.为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种ppar作用物质，ppar作用物质为上述制造方法制造的含有ppar作用物质的组合物；或者含组合物的混合物。
35.应用本发明的技术方案，本技术改进的ppar作用物质的制造方法，突破现有的改进思路，并未从植物体内纯化或分离酶，而是利用植物内体的酶直接与植物中所含的或者外源添加的多元不饱和脂肪酸/酯反应生成hode和oxo
‑
ode，从而获得含此类ppar作用物质的组合物。而且，通过采用干燥的植物并以粉末状态用水或缓冲液溶解，能够提高水的渗透性从而使植物体内的酶在高度浓缩的状态下被激活，提高反应速度，同时还可以抑制副反应，有效促进酶与多元不饱和脂肪酸/酯之间进行反应，从而增加hode和oxo
‑
ode的生成量。
36.本技术的制造方法，通过利用植物本身作为反应介质来制造生成hode和oxo
‑
ode，在优选的实施例中，该制造方法在不涉及纯化分离hode和oxo
‑
ode的情况下调节保健品中的补品成分，而是充分利用可食用植物原本的可食用性，在获得含hode和oxo
‑
ode的ppar作用物质的组合物之后，直接进行干燥即可变成食用的产品，因而既不产生废物，也不存在原料的浪费，是一种环保的制造方法。
附图说明
37.构成本技术的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
38.图1示出了本发明的实施例2中不同处理条件下的hplc检测结果图；
39.图2示出了本发明的实施例10中不同样品添加亚油酸与否对hode生成的影响；
40.图3示出了本发明的实施例10中不同样品添加亚油酸与否对oxo
‑
ode生成的影响；
41.图4示出了本发明的实施例10中ph差异对hode生成的影响；
42.图5示出了本发明的实施例10中ph差异对oxo
‑
ode生成的影响。
具体实施方式
43.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
44.术语解释：
45.ppar作用物质：本技术中指含羟十八碳二烯酸(hode)、酮十八碳二烯酸(oxo
‑
ode)的组合物。其中，hode和oxo
‑
ode为已知的ppar的配体，与ppar结合后能够激活ppar，从而表现出广泛的药理作用，因而许多保健食品或补品中添加有该成分。
46.如

背景技术：
中提到的，现有技术中，hode之类的ppar作用物质的制造方法通常需要用植物提取物中粗酶或纯化的脂氧合酶或过氧化物酶处理亚油酸以形成羟基hode，并使在脱氢酶的作用下制备得到含氧衍生物oxo
‑
ode，然后再纯化和分离hode。该方法比较繁琐，使得此类ppar作用物质的制造成本比较昂贵。
47.为了改善上述状况，在本技术一种典型的实施方式中，提供了一种改进的ppar作用物质的制造方法，该制造方法包括：提供含有脂代谢酶的干燥物质，其中脂代谢酶包括环氧合酶、脂氧合酶和细胞色素p450中的任意一种或多种，干燥物质为粉末状干燥植物或粉末状干燥食品；将干燥物质置于水中或缓冲液中，使脂代谢酶在多元不饱和脂肪酸和/或多元不饱和脂肪酸酯的作用下活化发生酶促反应，生成含ppar作用物质，从而获得含ppar作用物质的组合物。
48.本技术改进的ppar作用物质的制造方法，突破现有的改进思路，并未从植物体内纯化或分离酶，而是利用植物内体的酶直接与植物中所含的或者外源添加的多元不饱和脂肪酸(比如，植物本身含有的亚油酸，或者添加的亚油酸)和/或多元不饱和脂肪酸酯(比如，植物内源性的甘油三酯，或添加的甘油三酯)反应生成hode和oxo
‑
ode，从而获得含此类ppar作用物质的组合物。而且，通过采用干燥的植物并以粉末状态用水或缓冲液溶解，能够提高水的渗透性从而使植物体内的酶在高度浓缩的状态下被激活，提高反应速度，同时还可以抑制副反应，有效促进酶与多元不饱和脂肪酸/酯之间进行反应，从而增加hode和oxo
‑
ode的生成量。
49.本技术的制造方法，通过利用植物本身作为反应介质来制造生成hode和oxo
‑
ode，在优选的实施例中，该制造方法不涉及在纯化分离hode和oxo
‑
ode的情况下调节保健品中的补品成分，而是充分利用可食用植物原本的可食用性，在获得含hode和oxo
‑
ode的ppar作用物质的组合物之后，直接进行干燥即可变成食用的产品，因而既不产生废物，也不存在原料的浪费，是一种环保的制造方法。
50.为在本技术的制造方法中使用的植物/食品，只要是豆类、大麦类、大米类、小麦类、茄科、葫芦科、十字花科、伞形科、蕈类等含有脂氧合酶的植物、菌类，都可以使用。优选是可食用的植物或食品，比如干蔬菜(新鲜蔬菜干燥得到，或者已经经过干燥制备成食品)，如大豆、香菇、萝卜、彩椒、枸杞、番茄以及大麦等。具体的干燥粉末是从干燥蔬菜群中选择的至少一种或混合物。
51.在一种优选的实施例中，本技术的制造方法所制造的含hode和oxo
‑
ode的ppar作用物质的组合物，还可以通过干燥后直接作为保健食品，或者作为保健品的添加成分(比如，将本技术的含有ppar作用物质的组合物与其他成分混合)。
52.上述制造方法中，采用干燥植物或食品的粉末能有效促进反应，其获得方式包括但不限于以下几种：对含有脂代谢酶的植物进行非加热干燥后进行破碎，得到粉末状干燥植物；或者对含有脂代谢酶的植物进行破碎后再进行非加热干燥，得到粉末状干燥植物；或者将干燥食品进行破碎，得到粉末状干燥食品。
53.此外，可以在加入生理盐水(或缓冲溶液)的同时在搅拌状态下粉碎干燥的样品。另外，也可以均质化、冷冻干燥，但最理想的是冷冻干燥后通过各种粉碎方法制成粉末使用。
54.上述非加热干燥，是考虑到大多数植物含有丰富的脂代谢酶，比如脂氧合酶，其氧
化反应的最佳温度在20℃到30℃之间，而在90℃下会失活。因而，当加热干燥时容易使酶类活性降低，甚至失活。而采用非加热方式干燥，比如冷冻干燥或自然干燥，有助于保留酶活性。当在组织中干燥时，酶是稳定的。而将其破碎成粉末时，压碎和轧制等操作会破坏组织结构，提高水的渗透性。此外，从可作为保健品中的添加成分的角度考虑，更推荐使用冷冻干燥的方式进行干燥，这样有利于保留色调和香味等。
55.如前述，本技术的制造方法利用植物自身的酶与自身或外源添加的多元不饱和脂肪酸和/或多元不饱和脂肪酸酯进行反应。与仅利用自身的多元不饱和脂肪酸和/或多元不饱和脂肪酸酯相比，通过添加的外源亚油酸或甘油三酯等多元不饱和脂肪酸和/或多元不饱和脂肪酸酯能显著增加hode和oxo
‑
ode的生成量。多元不饱和脂肪酸包括但不仅限于亚油酸、亚麻酸及花生四烯酸，多元不饱和脂肪酸包括但不仅限于甘油单酯、甘油三酯等。
56.对于上述干燥植物或干燥食品，考虑到其经过了干燥处理，与新鲜来源的植物相比，其中所含的抗氧化性物质的含量较低，为进一步避免在反应过程中、后期对ppar作用物质的组合物进行干燥的过程中或长期保存过程中发生氧化，在本技术一种优选的实施例中，上述环氧合酶、脂氧合酶和细胞色素p450等脂代谢酶在进行上述酶促反应时，将上述干燥物质置于含还原性物质的水或缓冲液。将干燥物质溶于含还原物质的水或缓冲液中，能够去除油溶性和/或水溶性的氧化物质，进一步提高酶活性。
57.此处还原性物质理论上具有还原性且可食用的物质均可以用于本技术中。从已知的以及本技术实验验证的效果来看，优选的还原性物质为从由还原糖、抗坏血酸或生育酚、虾青素组成的组中选择的至少一种或多种；更优选地，还原糖为葡萄糖。
58.根据还原性物质的种类及物理性能(比如，脂溶性或水溶性)的不同，其在水或缓冲液中的具体浓度也有所差异。在本技术一种优选的实施例中，此类还原性物质在水中或者在缓冲液中的浓度为1.5～2.5mg/ml。
59.需要说明的是，本技术的制造方法中，酶促反应的温度和ph可以是产生羟基脂肪酸、含氧脂肪酸的温度和ph。例如若为大豆，则为0℃～60℃、优选为20℃～35℃、反应ph为4～11，具体可以根据产物的产量和后续用途而定。反应时间也可以根据干燥植物原料的种类、形态而进行适当选择。
60.干燥植物或食品中相关酶的浓度较高，而以粉末状的形态形式溶于水或缓冲液时，由于组织结构已破坏，提高了水或缓冲液的渗透性，从而便于内源或外源的多元不饱和脂肪酸/酯溶于水或缓冲液中，从而激活植物内的脂氧合酶等酶发生酶促反应。对所添加的加水或缓冲液的量进行优化，有助于进一步提高酶促反应效率，提高hode及oxo
‑
ode的生成量角。具体地，干燥物质与水或缓冲液的质量体积比以mg:μl计可以是1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1中的任意一种比例，在本技术一种优选的实施例中，控制干燥物质与水或缓冲液的质量体积比以mg:μl计为1:10～1:3，更优选为1:4～1:3，最优选为1:3，在干物质粉末质量3倍的体积下进行溶解，获得的hode和oxo
‑
ode的量也最高，进一步增加水量，与3倍水量相比，生成量有所降低。
61.进一步地，通过对不通过反应时长下hode和oxo
‑
ode的生成量进行比较发现，酶促反应的时间为30min～300min时量都相对较高，而进一步延长反应时间，比如延长至20个小时，产量也并未相应增加。更优选为30min～90min，最优选为60min。
62.此外，本技术中还对外源添加的多元不饱和脂肪酸以及水或缓冲液与干燥植物粉
末混合的顺序进行了研究，发现不同的添加顺序对产物的生成量的影响较小。而酶促反应的ph值条件，优选为6～10。根据植物品种或来源的不同，而有所不同，具体可以在反应中进行合理调整，得到最佳ph值。
63.前面已经提到，本技术的制造方法得到的ppar作用物质以组合物的形式存在，可以不经过分离纯化而直接食用，因而从可食用，便于长期保存的角度考虑，优选在生成含ppar作用物质的组合物之后，该制造方法还包括：使组合物中的脂代谢酶及酶抑制性物质的活力丧失，其目的在于便于维持ppar作用物质在该组合物中的长期稳定性，防止降解或发生其他反应而变质。在一种优选的实施例中，通过加热的方式使组合物中的脂代谢酶及还原性物质的活力丧失，这是一种简单方便且不破坏目的有效成分的失活方式，提高了该制造产物作为食用产品的安全性及可保存性。
64.在本技术第二种典型的实施方式中，提供了一种ppar作用物质，该ppar作用物质为上述制造方法制造的含有ppar作用物质的组合物；或者含组合物的混合物。该ppar作用物质为含hode和oxo
‑
ode的组合物，通过本技术的方法制造出的干燥食品的保存性、安全性更优异，因此可以添加到补充剂、饮食物、化妆品、准医药品、医药品或饲料等中发挥效果。
65.下面将结合具体的实施例来详细描述本技术的有益效果。需要说明的是，以下实施例中用到的植物原料均是市售产品(香菇、萝卜、辣椒粉、枸杞、西红柿等均购于镇上市场，具体的品种质量及贮藏情况尚不清楚)，不同品种或许产地或来源不同，但这并不对本技术的方案造成限定。以下实施例中，各原料的来源分别如下：
66.实施例1
67.基于干燥蔬菜或作物的hode的制备
68.干燥蔬菜包括：香菇、萝卜、彩椒、枸杞、番茄。干燥作物：大麦糯种、大豆。
69.将上述含有脂氧合酶的干燥蔬菜或干燥作物粉碎，分别取200mg粉末，向粉末中加入亚油酸200μl、纯水600μl并搅拌使其悬浊，然后在室温下反应1夜。取一部分，用etoh稀释10倍，用hplc检测hode的生成量。检测结果见下表：
70.结果发现了hodes的生成，具体产物有：fr1：13
‑
(z，e)
‑
hode，fr2：9
‑
(e，z)
‑
hode，fr3：13
‑
(z，z)
‑
hode，fr4：9
‑
(z，z)
‑
hode(此处z，e结构是指双键上的两个碳原子所连的两个较大基团在双键同侧的z，在双键两侧的为e)。同时还有p1，p2和p3。
71.此处需要说明的是，oxo
‑
ode是亚油酸的oxo衍生物，hode在脱氢酶的作用下
‑
oh变成o的化合物。ppar的作用物质具有抗肥胖作用。文献记载有4种oxo
‑
ode存在，本技术中检测到了3种的峰值，且它们在质谱中的平均分子量均为294，与oxo
‑
ode的分子量一致，uv吸收也被认定为吸收峰是280nm，而不是235nm，这一点与文献报道一致。将峰值进行分离纯化后，由于异构化，3个峰值的结构区分不明显，所以本技术用p
‑
1,p
‑
2和p
‑
3表示。文献中异构化的记载如下：13
‑
oxo
‑
ode,11
‑
oxo
‑
ode，9
‑
oxo
‑
ode(参见www.chemspider.com/chemical
‑
structure.8014803.html)。
72.同时还发现，当将干燥粉末与亚油酸、水混合而在室温下使它们反应1夜时，生成hode，但若未添加亚油酸，则hode生成量比较少(具体见实施例10)。
73.表1：
[0074][0075][0076]
实施例2
[0077]
研究原始大豆中就含有hode
[0078]
由于生大豆制成粉末与水混合后会检测到hode，为探究是否原始大豆中就含有hode，本实施例中，用咖啡豆研磨机将生大豆粉碎得到的大豆粉250mg与lml的纯水混合后，分别对不同的处理进行了研究。
[0079]
1：与1ml的纯水混合，加入etoh 1ml，立即提取，制成hplc试样。
[0080]
2：与1ml的纯水混合并加入etoh 1ml 4m naoh 150μl在90℃下水解60分钟制成hplc试样。
[0081]
3：与1ml的纯水混合反应1夜后，加入etoh 1ml，立即提取，制成hplc试样。
[0082]
4：与1ml的纯水混合反应1夜后，加入etoh 1ml，加入4m naoh 150μl在90℃下水解60分钟制成hplc试样。
[0083]
5：与2ml的50％etoh混合反应1夜后，加入4m naoh 150μl在90℃下水解60分钟制成hplc试样。
[0084]
取上述各种不同处理后的hplc试样进行hplc检测，其中hplc检测的条件如下：
[0085]
色谱柱：tsk ods 80tm 4.6x150mm，柱温为30℃；
[0086]
溶剂：m/100hcl：ch3cn：ch3oh(体积比46：41：13)(指每100体积的流动相中三种成分的体积比)，流速为1ml/min；
[0087]
检出：235nm 0.04aufs(aufs是absorbance units full scale的缩写,表示hplc的检测灵敏度)
[0088]
检测结果见图1。从图1的结果可以看出，在干燥大豆粉中加入纯水使其反应1夜，则生成hodes。用etoh萃取能够萃取游离的hode，但不能萃取甘油酯结合的hode。因此，通过用naoh水解以产生游离的hode，即可通过etoh萃取得到。这也证实了教科书上记载的植物中脂氧合酶不仅作用于游离亚油酸，而且还作用于甘油三酯的事实。
[0089]
通过本实施例的检测结果，得出以下结论：1)起始原始大豆中并不含hodes；2)并非游离的hodes，而是脂氧合酶、过氧化物酶直接与甘油三酯作用生成的结合型的hodes。
[0090]
实施例3
[0091]
对于不同品种的大豆进行检测
[0092]
使用圆黄豆和长黄豆的100g大豆粉，比较用大豆油制备时的大豆粉中的hode(μg/g)。
[0093]
由于在etoh提取中没有发现，因此不是游离的hode而是以甘油酯的形式生成。根
据豆的种类不同，hode的生成不同。从下列结果来看，长黄豆的hode的生成量比圆黄豆高些。
[0094]
表2：在圆黄豆和长黄豆中用大豆油(大豆油含有多种脂肪酸，比如，亚油酸、亚麻酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸及花生酸等，其中油酸以甘油酯的形式存在最多)生成hode的生成量(μg/g)
[0095]
ꢀꢀ
fr1fr2fr3fr4圆黄豆无处理186910 水解460174141106长黄豆无处理2812910 水解993372216164
[0096]
实施例4
[0097]
大豆粉、大豆油(成分同上)与水的混合顺序的研究
[0098]
改变大豆粉100g(a)、水(ph)300g(b)、大豆油100g(c)的混合顺序，制备hode。具体如下：
[0099]
表3：
[0100][0101]
从上表结果可知，1)大豆油与缓冲液的添加顺序对反应产物生成量的影响较小。2)关于反应ph值，根据品种和原料酶状态(比如产地，鲜度)的不同，ph值在6—10中间有差异，可以在反应中进行最佳ph值的调整。
[0102]
实施例5
[0103]
反应时间的研究
[0104]
利用大豆粉200mg与亚油酸100μl、生理盐溶液600μl进行反应。
[0105]
表4：
[0106][0107]
hode在无处理的大豆粉200mg中没有检测到，但仅通过上述混合处理(即并未经过碱处理，检测的是游离hode；但当经过碱处理时，游离型与结合型hode均被提取检测。通常测量结合型hode时，是在etoh萃取后，用碱处理提取检测)，发现有相当量生成。反应时间增至60分钟时，生成量最高，以后大体呈减少趋势。而且反应时间达到300分钟和20小时，生成量大致相同。而oxo
‑
ode，与hode类似，同样也是反应时间为60分钟时增加较多，之后逐渐减少；20小时后与300分钟相比，生成量更少。
[0108]
实施例6
[0109]
大豆粉与大豆提取液中的反应性研究，以寻找最佳水量。
[0110]
将使用全部大豆粉和对大豆粉进行了提取的粗酶中的反应性以番茄的干燥物粉末为对照进行比较。
[0111]
1)将大豆粉置于10倍体积(即水的体积是大豆粉质量的10倍)的水分中反应60分钟；
[0112]
2)采用10倍体积的水溶解大豆粉后，离心得到大豆粗酶，再将大豆粗酶置于10倍体积的水分中反应60分钟；
[0113]
3)将大豆粉置于3倍体积的水分中反应60分钟，作为对照；
[0114]
4)以番茄的干燥物粉末为对照，将番茄粉末置于10倍体积的水分中反应60分钟。
[0115]
检测结果见下表：
[0116]
表5：
[0117][0118]
对于hode，与水分3倍量相比，大豆粉、大豆粗酶及番茄在10倍水分中反应60分钟，反应生成量降低，但3个试样间的生成量几乎不变。
[0119]
实施例7
[0120]
反应体系中添加抗坏血酸
[0121]
对为了防止反应中、干燥时及保存时的氧化，对在生理盐水中添加抗坏血酸时的hode的生成情况进行了比较。用大豆粉200mg、亚油酸100μl、生理盐水(含有抗坏血酸)600μl.进行反应60分钟，然后将抗坏血酸加入生理盐水中至浓度为0.5mg/ml至2.5mg/ml，检测hode的生成情况，结果见下表。
[0122]
表6：
[0123][0124]
从上表可以看出，抗坏血酸在生理盐水中的浓度达到1.5mg/ml以上时，生成量相对较大。
[0125]
实施例8
[0126]
研究添加抗坏血酸对反应时间的影响
[0127]
将大豆粉200mg、含有抗坏血酸2.5mg/m l的生理盐水600μl、亚油酸100μl下的反应时间和hode生成量(峰值高度)进行比较，结果见下表。
[0128]
表7：
[0129][0130]
从上表结果可以看出，即使添加抗坏血酸，对反应生成hode和oxo
‑
ode而言，反应时间也优选均为60分钟左右，即抗坏血酸的添加并未导致反应时间延长。
[0131]
实施例9
[0132]
生育酚的添加
[0133]
抗坏血酸是水溶性的抗氧化物质，脂溶性脂质的抗氧化作用的物质有生育酚，本实施例研究添加生育酚对hode生成的效果。
[0134]
在大豆粉200mg中用含有抗坏血酸2.5mg/ml的生理盐水、亚油酸50μl反应1小时时，比较分别加入1.0mg、2.5mg、5.0mg的生育酚所生成的hode、oxo
‑
ode。
[0135]
表8：
[0136][0137]
fr4与夹杂物重叠，不能测定。p
‑
3生成是痕迹。
[0138]
从上表可以看出，当在大豆粉200mg、亚油酸50μl的反应中加入5mg生育酚时，hode的生成得到增强。
[0139]
实施例8和9表明，通过加入水溶性的抗坏血酸和脂溶性的生育酚，可以防止由氧化引起的反应阻碍。
[0140]
需要说明的是，上述实施例中在每个实验中都是将大豆粉碎，并根据整体趋势来判断反应是在进行还是已停止。但并未统一某些具体条件，比如，大豆的具体来源(市售产品，均在室温下保存，但市场保存状态不清楚)、干燥方式及具体干燥程度、样品粉碎的粒径大小和搅拌速率及次数多少等诸多方面可能存在差异。因而，不同实施例中相同条件下检测的hode的生成量有所差异。
[0141]
实施例10
[0142]
检测除了大豆外，其他植物在添加和未添加多元不饱和脂肪酸的情况下，hode和oxo
‑
ode的生成量情况。
[0143]
1)样品干燥：
[0144]
大豆和大麦：直接使用天然干燥的大豆和大麦。
[0145]
猕猴桃、茄子、番茄都成熟了，无法形成切片，所以制成果汁冻干。
[0146]
其他样品被切成切片并冷冻干燥。
[0147]
2)干燥样品粉碎：
[0148]
干燥的样品在研钵中粉碎。尽管有些纤维粉碎困难，但尽可能将它们粉碎以使它们均匀储存在样品瓶中直至使用。
[0149]
3)干燥样品ppar激动剂制备
[0150]
将20种样品干燥成粉末后：将20μl亚油酸和30μl生育酚(100mg/mletoh溶液)加入50mg样品粉末中混合搅拌，然后加入125μl抗坏血酸(10mg/ml生理盐水)混匀，室温反应20小时后进行冷冻干燥。作为目标，将30μletoh加入到50mg样品粉末中并混合搅拌，加入125μl生理盐水并捏合，混合物在室温下反应20小时，然后冷冻干燥。在每个干燥样品中加入1mletoh，超声处理30分钟，然后以10000rpm离心10分钟，制备上清液作为hplc样品。
[0151]
4)hplc检测条件：
[0152]
色谱柱：tsk
‑
ods 80tm 4.6x150mm室温；
[0153]
溶剂：m/100hcl:ch3cn:ch3oh＝47:43:10，流速：0.8ml/min；
[0154]
检测：hode：235nm；oxo
‑
ode：280nm。
[0155]
5)结果见下表及图2和图3：
[0156]
hode比较：fr1:13
‑
(z,e)
–
hode，fr2:9
‑
(z,e)
‑
hode。13
‑
(e,e)
–
hode及9
‑
(e,e)
‑
hode因产量少、分离性差而省略。另外，在3个峰高处比较oxo
‑
ode。
[0157]
表9：有亚油酸和无亚油酸反应产生的hode量(μg/g)
[0158][0159][0160]
此外，大豆和茄子在ph 7.4和ph 11下以相同方式处理，并通过反应1小时进行比较，结果见下表及图4和图5。
[0161]
表10：
[0162]
根据ph的差异生成hode(反应时间1小时μg/g)
[0163] fr1fr2p
‑
1p
‑
2p
‑
3大豆ph117974440730163大豆ph7.42230217715143茄子ph11209837257152茄子ph7.42413362011225
[0164]
如上表9和10及图2
‑
3所示，hode的生成量因样品而异，大豆和茄子产生大量的hode。在不添加亚油酸的情况下，大部分产量低于添加量的10％。由此可见，hode的大量生成源于样品中酶所添加的多元不饱和脂肪酸。
[0165]
此外，本实施例明确了ph差异对fr1和fr2产生的影响。在大豆中，在ph11时fr1是主要产物，在ph7.4时fr1和fr2的产生率几乎相同。在茄子中，无论ph值如何，都会产生更多的fr2。
[0166]
对于oxo
‑
ode，显示了与hode类似的生成模式，oxo
‑
ode
‑
1(即p
‑
1)推定为13
‑
(z,
e)
‑
oxo
‑
ode，oxo
‑
ode
‑
2(即p
‑
2)为9
‑
(z,e)
‑
oxo
‑
ode。
[0167]
从本实施例的结果来看，由于可以单独使用或混合使用各个样品来调整fr1、fr2的含量，所以也加入了香味、味道等不同消费者嗜好的调味剂，因而可以实现各种各样的营养品、健康食品、食品改良剂等广泛的利用方法。
[0168]
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：通过利用含脂氧合酶等的植物/食品，经过冷冻干燥或自然干燥的，使得植物体内的酶得到浓缩，经过破碎或轧制等方式破坏组织后(或者先破碎再干燥)，将粉末与含有生育酚和/或抗坏血酸等还原性物质的水或缓冲液混合，去除或抑制水溶性或脂溶性的氧化物质，并在内源性或外源添加的亚油酸、亚麻酸、甘油三酯等多元不饱和脂肪酸/酯的作用下活化脂氧合酶等脂代谢酶，并使其与多元不饱和脂肪酸/酯发生酶促反应，生成结合型的hode和oxo
‑
ode，从而获得含有hode和oxo
‑
ode的组合物产品。由于采用的植物为可食用的，因而无需分离纯化即可直接作为食用产品。
[0169]
为提高作为食用产品的安全性及可长期保存性，可以在反应结束后，通过加热的方式使脂氧合酶等酶以及酶的抑制物的活力丧失，从而制得干燥食品。
[0170]
尽管本技术的产品可以直接食用，但并不排除从本技术的制造的产品中分离提取hode和oxo
‑
ode的其他特殊需要。如若需要将本技术利用植物自身作为反应介质并调整操作而获得的大量的hode和oxo
‑
ode提取出来进行后续应用(比如提取出来与其他有效成分复配成其他食品或保健品)，则可以采用如上述实施例中的方式进行提取分离，比如用碱水解后再用乙醇萃取。
[0171]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。