制造方差减小的植物材料的方法与流程

制造方差减小的植物材料的方法
1.描述
2.本发明涉及一种在使用混合计算器的情况下，特别是用药用植物制造标准化或定量的、植物成分的方差减小的植物材料的方法。
3.药用植物含有(视情况而定在诸如根、叶、花或果实的植物部分中富含)具有药理作用的成分，并构成相当数量的药物的基础。为了获得这些成分，有不同的方法可供使用，其中的大部分均依据某种萃取原理进行，包括以适当的萃取剂或溶剂对植物进行的浸渍或者渗滤，并且，或多或少地产生特定的植物有效物质或有效物质组在萃取剂或提取物中的选择性溶解和富集。提取物可以是液态、半固态或者固态的，并且特别是为干提取物(extracta sicca)，其中，例如将萃取残余物、获得的流体提取物(extracta fluida)或获得的酊剂(tincturae)浓缩成干燥状态。可借助流化层干燥来进行干燥，或者，借助随后的真空带式干燥或托盘干燥浓缩成稠提取物(粘稠的提取物，extracta spissa)，例如另见本案申请人的ep 0 753 306b1。
4.图解：
[0005][0006]
本案申请人生产和销售例如这类药用植物的提取物，如sinupret等，亦或基于药材
[0007]
所述及的提取物是注册的或须经批准的药物，即所谓的传统或合理的植物药(包括完善的医药用途(well established medicinal use))，其需要在权衡风险
‑
收益比的情况下具备适当的剂量和对症的处方。
[0008]
专著(也称：药典条例(德国药典(dab)、欧洲药典(euab或ph.eur.，代表pharmacopoea europaea))描述了作为药物提供的植物及其制造，特别是有关其决定功效的成分、作用、应用范围、禁忌症、副作用、相互作用、剂量和剂型。kommission e(德国bfarm的认可和处理委员会)或者ema的“committee on herbal medicinal products(hmpc，草药产品委员会)”能够在现有研究的基础上充分证明功效和安全性的植物进入专论。
[0009]
根据ph.eur.，以及在本发明的范围内，提取物是由通常经干燥的植物药材制成的液态、半固态或固态的制剂。
[0010]
所谓的标准化提取物在允许的限值内被调节至决定功效的成分(引导物质(leitsubstanzen))的预定含量。可通过将提取物批次(extraktchargen)混合和/或通过添加助剂来进行调节。
[0011]
所谓的定量提取物被调节至决定功效的成分(引导物质)的定义范围。可通过将提取物批次混合来进行调节。
[0012]
可通过混合装置来将提取物或批次混合，其中使用混合计算器(mischungsrechner)，其借助电脑辅助的计算器调节提取物的混合比。
[0013]
然而，植物提取物或者药材批次由大量植物成分构成。基于各种参数，如生长地
区、气候条件、护理、收获方法、收获时间点等，这类植物成分的含量可能有很大差异。
[0014]
因此，视产地、历史、收获时间、制造方案和其他参数而定，植物提取物或药材批次的植物成分含量有所不同，这可能导致个体的品质差异，或由经处理之个体的总体构成的一个批次中的品质差异，以及批次之间的品质差异。
[0015]
因此，植物提取物和经粉末化的药材均具有植物化学方面的批次差异性的问题。为了在用植物药进行治疗时保证一致的疗效，各批次的提取物或植物药的植物成分的组成需要尽可能保持不变或稳定，亦即，存在对较低的批次差异性的需求。
[0016]
归根结底，这是因为提取物或批次的植物成分具有天然的生物方差(生物学空间(“biological space”))。
[0017]
植物成分特别是为次生植物物质。次生植物物质或次生代谢物源自尤其是碳水化合物和氨基酸的合成代谢和分解代谢的产物。对于药用植物而言，次生植物物质是是否适合作为有效物质的决定性因素。次生植物物质特别是包括酚类、异戊二烯和生物碱化合物，如酚、多酚、黄酮类化合物、咖啡酸衍生物、呫吨酮、萜、类固醇和其他天然物质。特别是，次生植物物质在个体或批次中的存在和含量可能有很大的差异。
[0018]
可通过分析方法对植物材料中的植物成分进行定性和定量表征(例如化学分类学)。主要是将气相色谱和/或液相色谱与质谱仪相结合，如gc
‑
ms或lc
‑
ms。通常展示信号(峰值[m/z])随保留时间的变化(色谱图)。借此，也可以通过获得的峰面积测定药材中或提取物中或植物材料中的植物成分含量(例如w/w或者v/v)。
[0019]
在现有技术中尚未描述过用以制造植物提取物或者药物批次或植物材料，其中减小植物成分含量方差的技术。
[0020]
因此，本发明的目的在于提供植物材料，所述植物材料中的植物成分含量的方差(差异性)有所减小，尤其是批次差异性有所减小。
[0021]
通过提供植物成分方差(同义词：差异性)减小的植物材料，能够改善批次同质性。通过经优化的批次，能够改善批次的可重复性，进而确保新的品质标准。这对于批准而言同样具有重要意义。例如，fda(美国)迄今为止尚未批准充当多物质混合物的植物提取物或者经粉末化的药材。此外，能够减小比较研究中的公差，借此改善研究品质，并可与合成药物进行比较。
[0022]
因此，本发明用以达成上述目的的解决方案为一种制造植物成分含量的方差减小的植物材料的方法，其中使用至少一个方差标志物，并且借助混合计算器将至少两个批次混合。
[0023]
在一个优选实施方式中，上述目的通过具有下列步骤的本发明的制造植物成分含量的方差减小的植物材料的方法实现(另见实例b)：
[0024]
i.)借助检测器，特别是gc
‑
ms和/或lc
‑
ms，测定针对两个或两个以上的批次中的植物成分的信号强度，
[0025]
ii.)识别至少一个植物成分，其对方差有贡献、优选有最大贡献，并且测定其天然跨度(nat
ü
rlichen spannweite)(下文和上文中称作方差标志物)，
[0026]
iii.)确定一或数个限值，其小于ii.)中的相应的天然跨度，
[0027]
iv.)将至少两个批次混合，其中借助混合计算器将iii.)中的至少一个限值考虑在内，v.)可选地，重复所述步骤i.)至iv.)。
[0028]
在步骤ii.)的范围内，可测定植物成分的含量的方差。
[0029]
因此，借助本发明的方法能够有利地制造稳定的或相同的、同质的批次，从而特别是确保批次的可重复性。这特别是因为，基于识别出的至少一个方差标志物，植物成分的方差减小，借助所述方差标志物能够将植物成分的总方差最大程度地减小。根据本发明识别的所述方差标志物为离散性的主要贡献因素，并且，通过本发明的方法将此方差标志物对整体差异性的影响减小。
[0030]
术语“植物成分的含量”(gehalt an pflanzeninhaltsstoffe)表示一或数个植物成分的相对或绝对的量(质量，重量)，或者其相对或绝对的浓度(w/w)(v/v)。
[0031]
在另一优选实施方式中，本发明的制造植物成分含量的方差减小的植物材料的方法具有下列步骤(另见实例c)：
[0032]
i.)借助检测器，特别是gc
‑
ms和/或lc
‑
ms，测定针对两个或两个以上的批次中的植物成分的信号强度，
[0033]
ii.)将所述信号划分成两个或两个以上的分区，以及，将每个分区内的植物成分的信号强度累加，
[0034]
iii.)识别至少一个分区，其对方差有贡献、优选有最大贡献，并且测定其天然跨度(下文和上文中称作方差标志物)，
[0035]
iv.)确定一或数个限值，其小于iii.)中的相应的天然跨度，
[0036]
v.)将至少两个批次混合，其中借助混合计算器将iv.)中的至少一个限值考虑在内，vi.)可选地，重复所述步骤i.)至v.)。
[0037]
在步骤iii.)的范围内，可测定植物成分的含量的方差。
[0038]
借助此实施方式能够特别有利地提供由复合的植物材料构成的植物材料，其具有大量植物成分，特别是超过300个植物成分，特别是次生植物物质。借助本发明的分区，通过将相应的信号强度累加，能够系统性地展示复合的信号强度。
[0039]
然而，根据本发明，分区的范围可或宽或窄，亦即，每个分区可包含仅一个植物成分的信号。因此，这个实施方式也将所述方法的第一实施方式(上文)涵盖在内。
[0040]
下面对本发明进行详细阐述。
[0041]
优选地，“借助检测器，特别是gc
‑
ms和/或lc
‑
ms，测定针对两个或两个以上的批次中的植物成分的信号强度”包含使用液相色谱法(lc)、优选hplc，结合诸如飞行时间(time of flight，tof)的高分辨质谱法，特别是使用高分辨hplc
‑
tof
‑
ms。前述概念gc
‑
ms和/或lc
‑
ms并不构成限制，并且涵盖适用于此的装置的任何实施方式。特别是可以采用任何检测器，如uv
‑
vis、热传导检测器(wld)、火焰离子化检测器(fid)等。要求仅为：使用的植物材料能够在借助检测器的测定过程中、特别是gc
‑
ms和/或lc
‑
ms，所谓的色谱图，中呈现对应的信号(峰值[m/z])或信号强度随保留时间的变化。
[0042]
因此，本发明亦涵盖在色谱图中展示信号强度随保留时间的变化的检测器。
[0043]
必要时，针对优选通过gc
‑
ms和/或lc
‑
ms识别的，或相应地以本发明的分区展示的本发明的方差标志物，可增添其他定性分析方法(例如：ir光谱法、nir光谱法、拉曼光谱法、原子吸收光谱法、湿化学检定(例如依据folin
‑
ciocalteu法的多酚测定)、片段质谱技术(ms
n
))。
[0044]
优选地，至少在一个批次中，测定至少100、200或300个或更多的信号(或信号强
mining)”技术，其在简化数据集的同时仍尽可能多地保留信息内容。
[0055]
pca的结果为至少两个信息块：一个所谓的“得分图”和一个与之关联的“载荷图”。在得分图中，将试样基于其“特性”(根据本发明为测得的(lc/ms)信号的强度值的特性)分组。所有特性均非常相似的试样被紧密地归在一起，区别较大的试样则彼此远离。此外，试样的点云在分数图中的相对延伸(例如在将未经混合的试样与经混合的试样进行比较的情况下)一定程度上体现出其基本差异性。紧凑的点云的内在方差小于伸展开的点云。
[0056]
载荷图则展示了哪些特性(或者在此：lc/ms信号)对对象在分数图中的定位有决定性意义。在载荷图中远离坐标原点的信号对定位的贡献较大(且进而对试样差异性有较大影响)，因此，这些信号在混合计算中是可靠的优化标准。
[0057]
术语“确定一或数个限值，其小于相应的天然跨度”表示，确定一个限值或者含量范围，其小于所述至少一个方差标志物的天然跨度。在此包括值0。如果测定了方差标志物，则可能根据测得的信号强度测定此方差标志物的天然跨度。
[0058]
句子“将至少两个批次混合，其中借助混合计算器将至少一个确定的限值考虑在内”表示，提供一个算法，其借助电脑辅助的混合计算器计算出需要以何比例将至少两个或两个以上的批次混合，使得至少一个方差标志物处于新选择的受限的区间或(分)区域内。
[0059]
在计算时，在考虑到约束条件的情况下，求解一个线性不等式系统(例如lay,david c.(2005年8月22日)，linear algebra and its applications(第3版)，addison wesley)。如果批次存在于混合池中，并且将限值区间考虑在内，则可将此作为书写(fn1)。在此为具有行和列的矩阵。每个行包含针对每个批次测得的待优化的单个参数，其中行具有正号，并且行具有负号。矢量包含混合区间的界限，其中条目包含下限值，并且包含上限值，也需要为这些设置负号。在求解这个不等式系统时，还需要将一个具有约束条件的矩阵同时考虑在内并求解。在这个矩阵中计算百分比份额，并且视需要而定使用各批次。其被表述为其中是一个具有行(包含)和列的矩阵。此外，矢量也具有条目，其总是具有值1。的第一行同样仅具有1作为条目，在其他行中则可额外地定义，是否需要为部分批次将特定选择的混合份额考虑在内，以及是否需要特意排除各批次。
[0060]
借助对应的用于线性优化的算法解决如此表述的混合问题，并且给出待混合的比例。
[0061]
在另一优选实施方式中，优选借助主成分分析(principal component analysis(pca))展示数据集中的方差。在另一优选实施方式中，特别是可根据质量亏损图的分区的信号强度和获得pca。在质量亏损图中，绘示特定信号(m/z)相对质量亏损的关系。质量亏损的计算方式是用测得的质量的小数位除以测得的质量的总质量(另见实例c)。具有相似质量和相似原子组成的植物成分在图中相互靠近(参见图11：质量亏损图)。根据已揭示的优选实施方式，可以将分区指定为部分面。特别有利地，在通过质量亏损图进行展示的过程中，这类部分面能够代表次生植物物质，如酚、黄酮类化合物等，并且易于为此分区或部分面识别出方差标志物。
membranaceus)、茺蔚(leonurus japonicus)、丹参(salvia miltiorrhiza)、防风(saposhnikovia divaricata)、黄芩(scutellaria baicalensis)、豨莶草(siegesbeckia pubescens)、辣根(armoracia rusticana)、辣椒(capsicum sp.)、百瑞木(cistus incanus)、狭叶紫锥菊(echinacea angustifolia)、金英树(galphimia glauca)、洋常春藤(hedera helix)、川楝子(melia toosendan)、油橄榄(olea europaea)、洋葵(pelargonium sp.)、美商陆(phytolacca americana)、黄花九轮草(primula veris)、柳(salix sp.)、百里香(thymus l.)、穗花牡荆(vitex agnus castus)、葡萄(vitis vinifera)、酸模草(rumicis herba)、马鞭草(verbena officinalis)、西洋接骨木(sambucus nigra)、黄龙胆(gentiana lutea)、大麻(cannabis sativa)、水飞蓟(silybum marianum)。
[0072]
本发明同样涵盖上述属和/或种的混合物。
[0073]
实例和附图：
[0074]
下列实例用于对本发明作详细阐释，但本发明并不局限于这些实例。
[0075]
对图1
‑
12的说明参见上文和下文。
[0076]
图13将在实例b、c和d中列出的用于测定方差标志物的方案汇总。本发明不局限于这些实施方式。
[0077]
实例a
[0078]
针对混合结果的实例
[0079]
黄花九轮草(primula veris)
[0080]
针对黄花九轮草(primula veris)药材，首先借助hplc/tof
‑
ms测量30个未经混合的批次，测定其天然方差(即rsdx(上文))，随后依据上述方法测定方差标志物。之后，基于此信息，为数个配方进行混合计算，在实验室中具体地制造这些配方，并且重新借助hplc/tof
‑
ms测量。针对混合计算和之后的测量，使用具有最高绝对累加载荷值的5个方差标志物。在图5中示出了如此得到的针对rsdx的值的对比。此外，对于黄花九轮草(primula veris)的实例而言，还以经混合和未经混合的试样的数据计算pca，并且使得每个试样组均被一个置信椭圆围绕(图4)。此椭圆的面积越小，方差便越小，在此，方差如同期望的那样在经混合的试样中最小。作为rsdx(上文)的替代方式，借此将相同的内容可视化。
[0081]
皱叶酸模(rumex crispus)
[0082]
针对皱叶酸模(rumex crispus)药材，亦首先对40个未经混合的批次进行测量，随后如针对黄花九轮草(primula veris)那样操作。在图6中示出了得到的针对rsdx的值的对比。
[0083]
西洋接骨木(sambuccus nigra)
[0084]
针对西洋接骨木(sambuccus nigra)药材，亦首先对40个未经混合的批次进行测量，随后如针对黄花九轮草(primula veris)那样操作。在图7中示出了得到的针对rsdx的值的对比。
[0085]
马鞭草(verbena officinalis)
[0086]
针对马鞭草(verbena officinalis)药材，亦首先对30个未经混合的批次进行测量，随后如针对黄花九轮草(primula veris)那样操作。在图8中示出了得到的针对rsdx的值的对比。
[0087]
实例b
[0088]
实例：针对皱叶酸模(rumex crispus)，通过混合计算减小植物材料方差时的操作示出了原始数据集的局部，其足以介绍本发明的操作。
[0089]
i)借助lc/ms为数个批次测定植物成分的信号
[0090]
结果通常为如下所示的表格，数字为例如以lc/ms测量测得的强度值。
[0091][0092]
ii)测定5个样本的总方差/标准偏差
[0093][0094][0095]
iii)识别对方差/标准偏差的贡献最大的信号
[0096]
借助主成分分析(pca)计算步骤i)中的表格的载荷(例如5个主成分)：
[0097][0098]
将所有信号的绝对值累加：
[0099][0100]
以从最大值到最小值的方式排序
–
识别出5个最重要的信号，以便后续优化(在此以橙色底色标示)：
[0101][0102]
测定识别的5的信号的天然跨度：
[0103][0104]
iv)测定方差标志物所基于的植物成分含量。
[0105]
此为可选操作，用于使得强度与具体含量(单位例如为mg/l或诸如此类)对应。为此，各种分析方法都有对应的定量方法。但是情况而定也可以(如在本实例中那样)跳过此步骤，因为其仅展示线性转换。
[0106]
v)确定减小的新跨度
[0107]
将允许的最小值增大，将允许的最大值降低，使得允许的混合物跨度减小(参见图14)：
[0108][0109]
vi)实施混合计算
[0110]
计算后，针对待混合的批次得到以下操作指示：
[0111][0112]
此混合示例的预期结果：
[0113][0114]
所有预期的信号强度均处于期望的减小的跨度内。
[0115]
vii)可相应地重复此计算，例如在将其他批次重新混合的情况下。
[0116]
实例c
[0117]
实例：针对皱叶酸模(rumex crispus)，通过混合计算减小植物原料方差时的操作示出了原始数据集的局部，其足以介绍本发明的操作。
[0118]
i)借助lc/ms为数个批次测定植物成分的信号
[0119]
结果通常为如下所示的表格，数字为例如以lc/ms测量测得的强度值。
[0120][0121]
ii)将信号划分成数个分区并且将这些分区累加
[0122]
1.1.为了将信号划分成数个分区，有各种策略可供使用。例如，可以依据lc/ms信号的保留时间或者依据质量进行排序以及相应的归总。
[0123][0124]
1.2.将分区中的信号累加，随后继续执行步骤iii)
[0125][0126]
2.1.另一方案为使用质量亏损图，借此能够基于信号的化学物质类别来将信号划分。每个信号的质量亏损如下计算：
[0127][0128]
md＝质量亏损
[0129]
mz＝m/z比例，精确到小数点后4位
[0130]
floor()＝函数，其将小数向下取整至最接近的整数
[0131]
一些m/z比例的示例计算
[0132][0133]
结果为如同图11的图表，其中每个信号均可以坐标系显示，其中x轴为m/z比例，y轴为对应的质量亏损。其中，对于信号所归属于的物质组(例如黄酮类化合物、萜类化合物等)而言，信号的位置通常具有特征性。
[0134]
2.2.随后例如可借助设置的网格(在此以灰色显示)，针对每个单元格，为每个批
次计算其中包含的信号的强度之和。
[0135]
2.3.为清楚起见，可以通过热力图显示每个单元格的信号数量(每个单元格可能包含数个不同强度的信号)(参见图12)。
[0136]
2.4.在将单元格中的信号强度累加时，例如会产生以下截取部分(因无信号而总和为0的单元格被排除。标记总是遵循样式“单元格(x轴坐标|y轴坐标)”)
[0137][0138]
借助此表格，能够类似得从下面的第iii)点起继续工作，进一步的操作相同。
[0139]
iii)识别对方差/标准偏差的贡献最大的分区
[0140]
借助主成分分析(pca)计算步骤1.2(或2.4)的表格的载荷(在此例如为4个主成分，可随时选择更多主成分)：
[0141][0142]
将所有区域的绝对值累加：
[0143][0144]
以从最大值到最小值的方式排序
–
识别出2个最重要的区域，以便后续优化(在此以下划线标示；也可为后续优化选择更多区域)：
[0145][0146]
iv)测定方差标志物所基于的植物成分含量。
[0147]
此为可选操作，用于使得强度与具体含量(单位例如为mg/l或诸如此类)对应。为此，各种分析方法都有对应的定量方法。但是情况而定也可以(如在本实例中那样)跳过此步骤，因为其仅展示线性转换。
[0148]
v)测定所选择的区域的天然跨度
[0149][0150]
vi)确定减小的跨度
[0151]
将允许的最小值增大，将允许的最大值降低，使得允许的混合物跨度减小(参见图15)：
[0152][0153]
vii)实施混合计算
[0154]
计算后，针对待混合的批次例如得到以下操作指示：
[0155][0156]
此混合示例的预期结果：
[0157][0158]
所有预期的信号强度均处于期望的减小的跨度内。
[0159]
viii)可相应地重复此计算，例如在将其他批次重新混合的情况下。
[0160]
实例d
[0161]
实例：在混合计算中识别可用于优化的lc/ms信号
[0162]
下面列出2个可能的实例：
[0163]
a)通过对药材的试样的lc/ms测量的主成分分析(pca)进行评估
[0164]
b)通过对药材的试样的测得的lc/ms测量的标准偏差进行评估
[0165]
出于空间原因，在此仅示出原始数据集的局部，目的在于阐释原理。
[0166]
针对a)：
[0167]
i)借助lc/ms为数个批次测定植物成分的信号
[0168]
结果通常为如下所示的表格，数字为例如以lc/ms测量测得的强度值。(在以下实例中测量40个批次并且测定363个信号，下表仅为局部)
[0169][0170]
ii)实施主成分分析(pca)
[0171]
展示分数和载荷(scores&loadings)
[0172]
在载荷中，在此特别是计算和展示6个主成分，其在本实例中对应约80％的总方差并足够好地描述数据集。但随时可使用更多主成分，以提升阐释的总方差。
[0173][0174]
如在实例a中描述的那样，从获得的载荷值计算出绝对值，通过选择的主成分累加，随后按照大小降序排列。在图10中选择了对方差的贡献最大的5个信号，并在载荷图(每
个图示出6个主成分中的2个)中以红色标示(可随时选择更多信号)。以红色标示的信号实际上总是为相同的信号，仅是在不同的主成分中表现。其覆盖信号的整个跨度，并且足够好地代表试样。
[0175]
随后可如在实例a中描述的那样，将如此选择的信号用于混合计算。
[0176]
针对b)：
[0177]
通过仅关注借助lc/ms测量的批次的信号强度的标准偏差，能够实现替代性的信号选择方案。据此，例如可以识别具有最高标准偏差的5个信号，并将其用于混合计算。
[0178]
i)借助lc/ms测量数个批次(在此：获得的信号表的局部)并为每个信号计算标准偏差
[0179][0180]
ii)对具有最高标准偏差的信号进行排序/识别
[0181]
在本实例中选择5个信号(可随时选择更多)并以下划线标示。
[0182][0183]
借助选择的这些信号也可以实施混合计算，如同在别处已描述的那样。此第二方法识别的信号与采用主成分分析(pca)的方法基本相同。
[0184]
如果通过这两个方法选择20个信号，而非5个信号，则在本实例中的选择中，仍然有17个信号是一致的(参见图9)。