一种甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测方法与试剂盒与流程

技术特征：
1.一种甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测方法与试剂盒，其特征在于，分别采用甲型流感病毒特异性引物seq id no.1、seq id no.2和探针seq id no.3，乙型流感病毒特异性引物seq id no.4、seq id no.5和探针seq id no.6，新型冠状病毒orf1ab基因特异性引物seq id no.7、seq id no.8和探针seq id no.9，新型冠状病毒n基因特异性引物seq id no.10、seq id no.11和探针seq id no.12，要求taqman探针seq id no.3和seq id no.6 5’端标记fam基团、探针3’端标记荧光淬灭基团，要求taqman探针seq id no.9 5’端标记joe基团、探针3’端标记荧光淬灭基团，要求taqman探针seq id no.12 5’端标记rox基团、探针3’端标记荧光淬灭基团，通过多通道荧光pcr扩增技术在单管反应中实现甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测。2.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，所用甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测靶序列为seq id no.13、seq id no.14、seq id no.15、seq id no.16，设计的引物seq id no.1/seq id no.2、seq id no.4/seq id no.5、seq id no.7/seq id no.8、seq id no.10/seq id no.11分别能扩增seq id no. 13~ seq id no. 16靶序列连续130～180个核苷酸，根据序列优化设计后的引物能扩增其连续90-150个核苷酸。3.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，分别基于seq id no.13～seqidno.16靶序列设计的型特异性taqman探针seq id no.3、seq id no.6、seq id no.9、seq id no.12，长度为22～35个核苷酸， 5’端均标记不同的荧光发光基团、3’端标记荧光淬灭基团。4.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，试剂盒所用的甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒orf1ab基因和n基因引物序列可以为和seq id no.1、seq id no.2、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.10以及seq id no.11同源性大于85％以上的序列，taqman荧光探针可以为seq id no.3、seq id no.6、seq id no.9和seq id no.12同源性大于85％以上序列，探针5’端分别标记fam、joe/vic、rox/texas red荧光基团，3’端标记bhq淬灭基团。5.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，引入了一个内源性内参照系统用于避免检测结果假阴性，内参照系统包括内参引物seq id no.17和seq id no.18、内参探针seq id no.19，其中探针seq id no.19 5’端标记cy5荧光基团、3’端标记bhq2淬灭基团，内参探针也可以是和seq id no.19序列同源性大于85％以上的序列。6.如权利要求1所述方法与试剂盒，其特征在于，试剂盒包括flua/b/ncov反应液、rt-pcr酶、阴性对照、阳性对照。7.如权利要求1所述方法与试剂盒，其特征在于，按照以下浓度配制成的反应体系进行扩增反应：ph 8.3的tris-hcl 10mm，kcl 75mm，tritonx100 0.01%，datp、dgtp、dctp、dutp各2mm，mgcl
2 5.5mm，seq id no.1、seq id no.2、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.10、seq id no.11为0.3μm， seq id no.3、seq id no.6、seq id no.9、seq id no.12、 seq id no.17、seq id no.18、seq id no.19为0.1μm， taq dna聚合酶1.5u，ung酶0.3u、neoscript rtase 12u。8.如权利要求1所述试剂盒在人咽拭子、痰液样本中快速检测甲/乙型流感病毒、新型冠状病毒核酸中应用，包括以下步骤：(1)样本处理提取模板dna，样本为咽拭子、痰液样本；(2)模板rt-dna扩增检测，以荧光pcr仪上三个检测通道扩增模板的荧光信号强弱和循环阈
值来判断样品中甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒核酸的存在，所用荧光定量pcr反应程序为：50℃
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10 min95℃
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3 min93℃
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3 s60℃
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30 sgo to [3] ，5 cycles93℃
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30 sgo to [6] ，40 cycles，在第七步采集fam、joe、rox和cy5通道荧光信号end。

技术总结
本发明提供一种甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测方法与试剂盒，该方法采用多对引物、多条探针的荧光核酸扩增方法，可在单管中实现多种靶核酸序列检测。该发明分别以甲型流感病毒的M2基因、乙型流感病毒M2基因以及新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因为靶序列设计特异性引物和TaqMan探针，通过多通道荧光PCR扩增检测甲型/乙型流感病毒和新型冠状病毒。本发明优化引物探针设计、反应体系和扩增程序，~70分钟即可完成荧光检测，试剂盒灵敏度达到200copies/mL。200copies/mL。


技术研发人员：郭圣明 江永忠 夏懿
受保护的技术使用者：湖北省疾病预防控制中心
技术研发日：2020.04.27
技术公布日：2021/11/14