靶向刺激体液免疫和细胞免疫的新冠病毒mrna疫苗
技术领域
1.本技术涉及免疫技术领域，尤其是涉及一种靶向刺激体液免疫和细胞免疫的新冠病毒mrna疫苗。
背景技术：
2.mrna疫苗与其它传统疫苗相比，具有研发周期短、研发成本相对较低的优势，同时其溶解度等理化性质适合药物研发，安全性高；而且副作用低，不存在整合、诱导基因突变和外源性病毒感染的风险，因而成为目前疫苗研发的一大热点。在目的抗原基因设计上，依据所靶向诱导的保护性免疫应答类型，选择不同抗原序列进行构建，理想的疫苗设计可以有效诱导病原特异性的体液免疫和细胞免疫应答。
3.然而，目前的mrna疫苗主要还存在以下两方面的问题：一方面，目前成功上市的两款新冠病毒mrna疫苗均倾向以诱导中和抗体以发挥保护性免疫应答，尚未在探索靶向性诱导t细胞免疫应答开展特定设计。另一方面，新冠病毒在流行过程中不断突变而产生的一些优势变种，包括alpha变种（b.1.1.7）、beta变种（b.1.351）、gamma变种（p.1）、delta变种（b.1.617.2）等，对于目前mrna疫苗诱导的抗体可能会发生严重的免疫逃逸。因此，有必要提供一种能够同时靶向刺激体液免疫和细胞免疫，且能够有效诱导产生交叉中和抗体的mrna疫苗。
技术实现要素：
4.本技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本技术提出一种分离的dna分子组合，利用该dna分子组合可以制备得到一种能够同时靶向刺激体液免疫和细胞免疫，且能够有效诱导产生交叉中和抗体的mrna疫苗。
5.本技术的第一方面，提供分离的dna分子组合，该dna分子组合包括：a.第一dna分子，和b.第二dna分子和第三dna分子中的至少一种；其中，第一dna分子包括第一编码区，第一编码区包括编码信号肽的如seq id no.1所示的序列和编码rbd
‑
sa片段的如seq id no.3所示的序列；第二dna分子包括第二编码区，第二编码区包括如seq id no.2所示的泛素化序列和编码rmn片段的如seq id no.6所示的序列；第三dna分子包括第三编码区，第三编码区包括如seq id no.2所示的泛素化序列和编码nsps片段的如seq id no.8所示的序列。
6.根据本技术实施例的分离的dna分子组合，至少具有如下有益效果：（1）第一dna分子上具有编码tpa信号肽的序列和编码rbd
‑
sa片段的序列，以该dna分子为模板合成的mrna在递送到机体内后，利用信号肽介导rbd
‑
sa片段的中和抗原的表达分泌。该rbd
‑
sa片段包括新冠病毒spike蛋白的331
‑
524位氨基酸，并同时融合了突变株的一些关键氨基酸突变位点，从而可以诱导高滴度的中和抗体，具有良好的交叉中和作用，使
得中和抗体水平在针对不同突变病毒株时，不发生显著下降。
7.（2）第二dna分子上具有泛素化序列和编码rmn片段的序列，以该dna分子为模板合成的mrna在递送到机体内后，表达的rmn片段由于抗原的泛素化而发生降解并形成t细胞表位。该rmn片段包括新冠病毒m蛋白和n蛋白的表位富集区的片段并经过重排处理，在防止结构蛋白m、n发挥正常生物学功能促进病毒复制的前提下，保留了其中的ctls表位，能够促进抗原的降解和高效提呈，同时有效排除抗体依赖增强（ade）效应。
8.（3）第三dna分子上具有泛素化序列和编码nsps片段的序列，以该dna分子为模板合成的mrna在递送到机体内后，表达的nsps片段由于抗原的泛素化而发生降解并形成t细胞表位。该nsps片段包括新冠病毒nsp3、nsp4、nsp6等nsp蛋白的表位富集区的片段并经过重排处理，在防止非结构蛋白nsp发挥正常生物学功能促进病毒复制的前提下，保留了其中的ctls表位，能够促进抗原的降解和高效提呈，同时有效排除抗体依赖增强（ade）效应。
9.（4）通过第一dna分子以及第二dna分子和/或第三dna分子的组合，利用第一dna分子最终合成的mrna诱导高滴度的交叉中和抗体，利用第二dna分子和/或第三dna分子最终合成的mrna诱导新冠病毒特异性的细胞毒性t淋巴细胞，从而高效地同时激活相对独立的体液免疫应答和细胞免疫应答，应对新冠病毒在流行传播过程中产生的突变毒株所引发的突破性感染。
10.其中，编码信号肽的核苷酸序列如下：atggacgccatgaagagggggctgtgctgcgtgctgctgctgtgcggagccgtgttcgtgagcgcctcc（seq id no.1）。该信号肽为tpa信号肽，是目前应用最广泛的信号肽之一。在第一dna分子转录形成mrna后，tpa信号肽可以提高中和抗原的可翻译性，从而有效提高中和抗原的表达和分泌的水平，增强免疫应答。
11.泛素化序列如下：atgcagattttcgtgaaaaccctgaccgggaaaaccatcaccctggaagtcgagcccagcgacaccatcgagaacgtcaaggccaaaatccaggacaaggagggcatcccccccgaccagcagaggctgatcttcgccggcaagcagctggaagacggcagaacactgagcgactacaacatccagaaggaaagcaccctgcacctggtgctgagactgagaggcgcc（seq id no.2）。高效表达的t细胞抗原通过泛素化能够促进自身的降解以及t细胞表位的形成。
12.编码rbd
‑
sa片段的核苷酸序列如下：aacatcaccaacctgtgccccttcggcgaggtgttcaacgccaccagattcgccagtgtgtacgcctggaacagaaagaggatctccaactgcgtggccgattactctgtgctgtataatagcgcctccttctctaccttcaaatgctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgatctgtgttttaccaacgtgtacgccgactccttcgtgatcagaggcgacgaggtgaggcagatcgcccccggacagaccggaaatatcgccgattacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgcgtgatcgcctggaactccaacaacctggacagtaaggtggggggaaactacaactacctgtaccggctgttccgcaagagcaacctgaagccctttgagagagacatcagcacagagatttatcaggccggcagcaccccctgcaacggagtgaaaggattcaactgctacttcccactgcaaagctacggcttccagcccacctatggcgtgggataccagccctacagagtggtggtgctgtcttttgagctgctgcacgcccccgccaccgtg（seq id no.3）。
13.rbd
‑
sa片段的氨基酸序列如下所示：nitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgniadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyq
agstpcngvkgfncyfplqsygfqptygvgyqpyrvvvlsfellhapatv（seq id no.4）。该rbd
‑
sa片段利用新冠病毒s蛋白的331
‑
524氨基酸区段，并引入新冠病毒关键氨基酸突变位点k417n、e484k、n501y。
14.大片段重排抗原rmn片段包含细胞毒性t淋巴细胞表位，其氨基酸序列如下所示：ghlriaghhlgrcdikdlpkeitvatsrtlsyyklgasqrvagdsgfaaysryrignyklntdhssssdniallvqaayliflwllwpvtlacfvlaavyrinwitggiaiamaclvglmwlsyfiasfrlfartrsmwsfnpetnillnvplhgtiltrplleselvigavilrghlriaghhlaaymadsngtitveelkklleqwnlvigflfltwicllqfayanrnrflyiikliflwllwpvaayqelirqgtdykhwpqiaqfapsasaffgmsrigmevtpsgtwltytgaiklddkdpnfkdqvillnkhidayktfpptepkkdkkkkadetqalpqrqkkqqtvtllpaadlddfskqlqqsmssadstqaaayirggdgkmkdlsprwyfyylgtgpeaglpygankdgiiwvategalntpkdhigtrnpannaaivlqlpqgttlpkgfyaegsrggsqassrsssrsrnssrnstpgsaaymsdngpqnqrnapritfggpsdstgsnqngersgarskqrrpqglpnntaswftaltqhgkedlkfprgqgvpintnsspddqigyyrratrrirggdgkmkdaaynssrnstpgssrgtsparmagnggdaalalllldrlnqleskmsgkgqqqqgqtvtkksaaeaskkprqkrtatkaynvtqafgrrgpeqtqgnfgdqelirqgtdyaaygkpipnpllgldst（seq id no.5）。其中rmn对新冠病毒m蛋白和n蛋白的抗原富集区进行分段重排，各片段间由aay连接。
15.编码rmn片段的核苷酸序列如下所示：ggccacctgcgcatcgccggccatcacctgggcagatgcgacatcaaggatctgcctaaagaaatcaccgtggccacgagccggaccctgtcttactacaaactgggcgcctcccagagagtggccggcgatagcggatttgccgcctattctagataccggatcggcaactacaagctgaacaccgatcacagcagcagcagcgacaacatcgccctgctggtccaggccgcctacctgatcttcctgtggctgctgtggcctgtgaccctggcctgttttgtgcttgctgctgtctacagaatcaactggatcaccggcggcatcgccatcgccatggcctgcctggtgggcctgatgtggctgagctacttcatcgcatcatttagactgttcgccagaacccggtccatgtggagcttcaaccccgagacaaacatcctgctcaatgtgccgctgcacggaaccatcctgacacggcctctgcttgagagcgagctggttatcggagctgtgatcctgagaggccacctgagaatcgccggacaccacctggctgcctatatggctgatagcaacggcaccatcacagtggaggaattaaagaaactgctggaacagtggaacctggtgatcggatttctgttcttgacatggatctgcctgctgcagttcgcctatgccaatagaaatagattcctgtacatcatcaaactgatctttctgtggctgctctggcccgtggctgcctatcaggagctgattcgccagggcaccgactacaagcactggcctcaaatagcccagtttgcccctagcgccagcgccttcttcggaatgagcagaatcggcatggaagtgactcctagcggcacatggctcacatacacaggcgccatcaagctcgacgataaggaccccaacttcaaggatcaggtgatcctgctgaacaagcacatcgacgcctacaagacattcccccccaccgagcccaagaaggacaagaagaagaaggccgacgagacacaggccctgccccagcggcaaaagaagcagcaaacagtgaccctgcttcctgccgccgacctggacgacttcagcaagcagctgcagcaaagcatgagctccgccgacagcacccaagccgctgcctacatccggggcggagacggcaagatgaaggacctgagccccagatggtacttctactacctgggcaccggcccagaggccggcctgccatacggagccaacaaggatggcatcatctgggtggccacagaaggcgccctgaatacccctaaggaccacatcggcacccggaaccctgctaataacgccgcaatcgtgctgcaactgccacaaggcacgaccctgcctaaaggcttctacgccgagggatcccggggaggcagccaggcctctagcagaagctcttctcggagccgtaacagctctcgcaacagcacacccggctccgccgcctacatgagcgataacggccctcagaaccagagaaatgctcctcggatcaccttcggcggcccttctgacagcaccggtagcaaccagaacggcgagagaagtggagctagaagcaagcaaagaaggcctcagggcctgcctaacaacacagcctcttggttcaccgccctgacacagcacgggaaagaggacctgaagttccctagaggccagggggtgcctattaacaccaacagctctccagacgaccagatc
ggctactacagacgcgccaccagacgaatcagaggcggagacggcaagatgaaagatgccgcttacaattctagccggaatagcacacccggcagctctagaggaacaagccctgctagaatggccggaaacggcggcgacgccgctctggccctgctgttgctggatagactgaaccagctggaatccaagatgagcggcaagggccagcagcagcagggccagaccgtgacaaagaaatctgctgccgaggcctctaagaaacctagacagaaaagaacagccaccaaggcctacaacgtgacccaggctttcggcagacggggccccgagcagacccagggcaacttcggggaccaggagctgatcagacagggcaccgactacgccgcttacggcaagcccatccccaatcctctgctgggcctggacagcacctga（seq id no.6）。
16.大片段重排抗原nsps包含细胞毒性t淋巴细胞表位，其氨基酸序列如下所示：syctgyregylnstnvtiatyctgsipcsvclsgldsldtypsletiqitissfkwdltafglvaewflayilftrffyvlglaaimqlffsyfavhfisnswlmwliinlvqmapisamvrmyiffasfyyvwksyvhvvdgcnsstcmmcykrnratrvecaaygvcvstsgrwvlnndyyrslpgvfcgvdavnlltnmftpliqpigaldisasivaggivaivvtclayyfmrfrrafgeyshvvafntllflmsftvlcltpvysflpgvysviylyltfyltndvsflahiqwmvmftplvpfwitiayiicistkhfywffsnylkrrvvfngvsfstfeeaalctfllnkemylklrsdvllpltqynryaaysavkrtikgthhwllltiltsllvlvqstqwslffflyenaflpfamgiiamsafammfvkhkhaflclfllpslatvayfnmvympaswvmrimtwldmvdtslsgfklkdcvmyasavvllilmtartvyddgarrvwtlmnvltlvykvyygnaldqaismwaliisvtsnysgvvttvmflargivfmcveycpiff（seq id no.7）。其中nsps片段对nsp3、nsp4、nsp6等非结构蛋白的抗原富集区进行分段重排，各片段间由aay连接。
17.编码nsps片段的核苷酸序列如下所示：agctactgcaccggatacagagagggatatctgaacagcacaaacgtgaccatcgccacctactgcacaggcagcatcccctgcagcgtgtgcctgagcggcctggattcactggatacctacccctcactggagaccatccagatcaccatcagcagcttcaagtgggacctgaccgcctttggcctggtggccgagtggttcctggcctatatcctgttcacccgcttcttttacgtcctgggcctggccgccatcatgcagctgttcttctcctacttcgccgtgcacttcatcagcaattcctggctgatgtggctgatcattaacctggtgcagatggcccctatcagcgccatggtgagaatgtacatcttcttcgcctccttctactacgtgtggaagtcctacgtccacgtggtggacggctgcaactcctctacctgcatgatgtgctacaagagaaacagagccaccagagtggagtgcgccgcctatggagtgtgtgtgagcaccagcgggcgctgggtgctgaataatgactattacaggtccctgcccggagtgttctgcggcgtggacgcagtgaatctgctgaccaacatgttcacccccctgattcagcctatcggagccctggacatttctgccagcatcgtggccggcggaatcgtggctattgtggtgacctgtctggcttactatttcatgagattcagaagggccttcggcgagtacagccacgtggtggcctttaacaccctgctgttcctgatgtcctttaccgtgctgtgtctgactcccgtgtattctttcctgcccggcgtgtacagcgtgatctatctgtatctgaccttctacctgaccaatgacgtgagcttcctggcccacatccagtggatggtgatgtttacccccctggtccccttctggatcaccatcgcctacatcatctgcatctccaccaaacacttctactggttcttctccaactacctgaaaagacgcgtggtcttcaacggcgtgtccttctccaccttcgaggaggccgccctgtgcaccttcctgctgaacaaggagatgtacctgaagctgcggtccgacgtcctgctgcccctgacacagtataatagatacgctgcttactccgccgtgaagagaacaatcaagggcacccaccactggctgctgctgaccatcctgacctccctgctggtgctggtgcagagcacccagtggagcctgttcttctttctgtatgagaacgcctttctgcccttcgccatgggcatcatcgccatgtccgccttcgccatgatgttcgtgaagcataagcacgccttcctgtgcctgtttctgctgccctccctggctaccgtggcctacttcaacatggtgtacatgcccgccagctgggtgatgagaatcatgacctggctggatatggtggacacctccctgtccggcttcaagctgaaagactgcgtgatgtatgcttccgccgtggtgctgctgatcctgatgactgcccggaccgtgtacgacgacggcgctagaagagtgtggaccctgatgaacgtcctgaccc
tggtgtacaaagtgtattacggcaatgccctggatcaggccatttccatgtgggccctgattatctccgtgacctccaattacagcggagtggtgaccaccgtgatgttcctggcccggggcatcgtgttcatgtgcgtggagtattgccccatctttttc（seq id no.8）。
18.在本技术的一些实施方式中，第一编码区、第二编码区和第三编码区的上下游还分别具有5
′
端非翻译区（5
′‑
utr）和3
′
端非翻译区（3
′‑
utr）。
19.在本技术的一些实施方式中，第一编码区、第二编码区和第三编码区的下游还具有多聚腺苷酸（polya）。
20.mrna一直以来面临不稳定、半衰期短等问题，为了解决该问题，在其dna模板上加入修饰作用的结构元件，如5
′
端非翻译区（5
′‑
utr）、3
′
端非编码区（3
′‑
utr）和多聚腺苷酸（polya）等，使得最终合成的mrna保持完整结构，有利于其稳定性，延长其半衰期并提高mrna的表达能力。
21.在本技术的一些实施方式中，多聚腺苷酸的腺苷酸数量在100个以上。
22.在本技术的一些实施方式中，dna分子的编码区的上游还具有启动子，启动子选自t7启动子、sp6启动子中的任一种。
23.在本技术的一些实施方式中，编码区还包括报告基因。为了明确不同抗原的表达情况或其它目的，在抗原编码区内还可以插入报告基因从而方便检测。
24.在本技术的一些实施方式中，报告基因选自荧光蛋白、荧光素酶、蛋白标签中的至少一种。
25.在本技术的一些实施方式中，蛋白标签选自ha标签、flag标签、his标签或v5标签中的至少一种。
26.本技术的第二方面，提供抗原表达载体组合，该抗原表达载体组合包括：a.第一抗原表达载体，和b.第二抗原表达载体和第三抗原表达载体中的至少一种；其中，第一抗原表达载体包括前述的dna分子组合中的第一dna分子；第二抗原表达载体包括前述的dna分子组合中的第二dna分子；第三抗原表达载体包括前述的dna分子组合中的第三dna分子。
27.本技术的第三方面，提供分离的mrna分子组合，该mrna分子组合由前述的抗原表达载体组合制备得到。
28.由上述的抗原表达载体经体外转录而成的mrna分子组合，在进入到体内后，一方面能够利用信号肽介导中和结构域抗原的表达分泌，从而诱导高滴度的中和抗体，且中和抗体水平在针对不同突变病毒株时，不发生显著下降；而另一方面泛素化的融合t细胞表位富集性抗原表达，促进其降解，以及t细胞表位的形成；从而同时诱导产生相对独立的中和抗体和t细胞免疫应答。
29.本技术的第四方面，提供新冠病毒mrna疫苗，该新冠病毒mrna疫苗包括前述的mrna分子组合。
30.在本技术的一些实施方式中，还包括药学上可接受的载体。
31.在本技术的一些实施方式中，载体为脂质载体。脂质载体的非限制性实例包括脂质体，如脂质纳米颗粒（lnp），采用包括但不限于薄膜水化法、逆向蒸发法、挤出法、均质法等方式制备得到的脂质纳米颗粒与mrna疫苗混匀孵育即得到该疫苗。可以理解的是，其它
如阳离子脂质复合物（lpx）、脂质多聚复合物（lpp）、聚合物纳米颗粒（pnp）、无机纳米颗粒（inp）、阳离子纳米乳（cne）等也同样可以作为mrna的载体进行递送。
32.在本技术的一些实施方式中，脂质载体为阳离子脂质纳米颗粒。
33.本技术的第五方面，提供制剂，该制剂包括前述的新冠病毒mrna疫苗。
34.综上可以看到，本方案公开了上述分离的dna分子组合、抗原表达载体组合、分离的mrna分子组合、疫苗、制剂，利用这些材料，可以应用到制备新冠病毒的预防和/或治疗的产品中，从而高效地同时激活相对独立的体液免疫应答和细胞免疫应答，应对新冠病毒在流行传播过程中产生的突变毒株所引发的突破性感染。
35.本技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本技术的实践了解到。
附图说明
36.图1是本技术的实施例1中的pca
‑
rbd
‑
sa抗原表达载体的图谱。
37.图2是本技术的实施例1中的pca
‑
ub
‑
rmn抗原表达载体的图谱。
38.图3是本技术的实施例1中的pca
‑
ub
‑
nsps抗原表达载体的图谱。
39.图4是本技术的蛋白表达验证实验中抗原表达水平的western blot检测结果。
40.图5是本技术的蛋白表达验证实验中抗原表达水平的流式细胞仪的检测结果。
41.图6是本技术的mrna疫苗免疫评价安全性实验的检测结果。其中，a为活体成像的荧光结果，b和c为不同组织分布的计数结果。
42.图7是本技术的mrna疫苗免疫评价实验的不同突变株的中和抗体elisa检测结果。
43.图8是本技术的mrna疫苗免疫评价实验的不同突变株的假病毒中和检测结果。
44.图9是本技术的mrna疫苗免疫评价实验的不同突变株的ifn
‑
γ分泌检测结果。
45.图10是本技术的mrna疫苗免疫评价实验的保护性评价的检测结果。
具体实施方式
46.以下将结合实施例对本技术的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本技术的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本技术的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本技术的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本技术保护的范围。
47.下面详细描述本技术的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本技术，而不能理解为对本技术的限制。
48.在本技术的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
49.本技术的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本技术的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点
可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
50.实施例1本实施例提供一种新冠病毒mrna疫苗的抗原表达载体的组合。该抗原表达载体的组合包括三个抗原表达载体，分别是pca
‑
rbd
‑
sa、pca
‑
ub
‑
rmn和pca
‑
ub
‑
nsps。
51.这些抗原表达载体分别参考图1~3，其中，pca
‑
rbd
‑
sa质粒上具有一抗原编码区，抗原编码区内包括依次连接的编码tpa信号肽的序列和编码rbd
‑
sa片段的序列，在编码rbd
‑
sa片段的序列的3
′
端还插入有编码flag标签的序列和终止密码子（flag序列和终止密码子图中未示出）。在抗原编码区的上下游还分别连接有t7启动子、5
′
端非翻译区（5
′‑
utr）以及3
′
端非编码区（3
′‑
utr）、多聚腺苷酸（polya）。
52.pca
‑
ub
‑
rmn质粒上具有一抗原编码区，抗原编码区内包括依次连接的泛素化序列和编码rmn片段的序列，而在编码rmn片段的序列的3
′
端还有编码v5标签的序列和终止密码子（v5序列和终止密码子图中未示出）。而在抗原编码区的上下游还分别连接有t7启动子、5
′
端非翻译区（5
′‑
utr）以及3
′
端非编码区（3
′‑
utr）、多聚腺苷酸（polya）。
53.pca
‑
ub
‑
nsps质粒上具有一抗原编码区，抗原编码区内包括依次连接的泛素化序列和编码nsps片段的序列，在编码nsps片段的序列的3
′
端还有编码v5标签的序列和终止密码子（v5序列和终止密码子图中未示出）。在抗原编码区的上下游还分别连接有t7启动子、5
′
端非翻译区（5
′‑
utr）以及3
′
端非编码区（3
′‑
utr）、多聚腺苷酸（polya）。
54.上述抗原表达载体质粒的构建方法如下：（1）酶切pcaggs载体，使用限制性内切酶xho
ꢀⅰ
和kpn
ꢀⅰ
双酶切载体，回收大片段（载体）。
55.（2）交由生物公司合成如下三段基因序列：序列一：包括tpa信号肽序列（seq id no.1）和sars
‑
cov
‑
2的spike蛋白的受体结合域片段（rbd，seq id no.3），另外在3
′
端还插入有flag标签和终止密码子。
56.序列二：包括泛素化序列（seq id no.2）和rmn序列（seq id no.6），另外在3
′
端还插入有v5标签和终止密码子。
57.序列三：包括泛素化序列（seq id no.2）和nsps序列（seq id no.8），另外在3
′
端还插入有v5标签和终止密码子。
58.根据上述的序列，合成时两端设置限制性酶切位点xho1和kpn1，电泳并胶回收特异性片段，利用t4 dna连接酶方法，连接各片段与载体。
59.（3）按常规方法进行大肠杆菌转化，次日挑选克隆菌，小提质粒，测序公司测序。
60.（4）序列比对正确后，利用大提质粒试剂盒进行质粒大提，nanodrop测量质粒浓度和纯度备用，并将上述三种质粒命名为pca
‑
rbd
‑
sa, pca
‑
ub
‑
rmn和pca
‑
ub
‑
nsps。
61.mrna转录验证实验（1）利用bsa i限制性内切酶对实施例1中构建得到的抗原表达载体进行线性化后电泳鉴定，电泳位移相对较小。回收后蛋白激酶k处理，酚氯仿抽提，溶解于无rna酶水中，分光光度计检测浓度。
62.（2）利用生物公司购买的体外转录试剂盒及加帽试剂盒，按说明书操作合成含有50% pseudoutp的mrna，氯化锂沉淀纯化，75%乙醇洗涤一次，晾干，溶于无rna酶水中，分光光度计检测浓度。
63.（3）配置变性rna凝胶，将rna样品与2
×
rna上样缓冲液1：1混合，70℃金属浴热变性10分钟，冰浴5分钟，电泳（120v，20min）。结果与预期相符。
64.蛋白表达验证实验参考图1~3和上述实验方法构建包含中和抗原或细胞抗原的质粒，分别将命名为rbd
‑
sa、rmn和nsps的质粒线性化后进行体外转录。利用rna转染试剂将rbd
‑
sa、rmn和nsps质粒转录出的mrna分别转染hek 293t细胞，鉴定相关基因元件的功能。其中，对照组为未转染相应mrna的细胞，rbd
rmn
组为同时转染对应的rbd
‑
sa、rmn两种质粒转录出的两条mrna的细胞，rbd
nsps
组为同时转染对应的rbd
‑
sa、nsps两种质粒转录出的两条mrna的细胞，rbd
组、rmn
组和nsps
组为分别转染对应的其中一种质粒转录出的一条mrna的细胞。
65.转染后40小时，向细胞培养基中添加蛋白酶体抑制剂mg132（50μm)，并设置对照，8小时后，对细胞进行处理：（1）western blot：细胞裂解后收集蛋白进行sds
‑
page电泳，转膜封闭后，分别用抗flag标签抗体鉴定b细胞抗原（rbd）的表达，结果如图4。从图中可以看出，相比于对照组，rbd
‑
sa质粒组中出现了明显的rbd
‑
sa的条带。
66.（2）流式细胞术：由于t细胞抗原泛素化严重，wb检测不敏感，采用流式方法鉴定t细胞抗原的表达胰酶消化为单个细胞，破膜固定后，分别用fitc标记的抗v5标签抗体和alexa fluor
‑
555（af555）标记的抗flag标签抗体染色，利用流式细胞仪鉴定rbd和rmn、nsp346抗原的表达。结果如图5所示，从图中可以看出，三种mrna分别能够有效实现b细胞抗原和t细胞抗原的表达，而其中两种共同转染能够实现两种抗原组分的共同表达，提示可以作为疫苗的两种组分，进行疫苗有效性评价，符合设计预期。
67.免疫评价实验1.安全性参考实施例1，采用相同方法构建包含luciferase报告基因序列的质粒，将其线性化后体外转录、加帽得到对应的luc
‑
mrna分子，送生物公司装载到mrna脂质体纳米颗粒中制备形成mrna疫苗的制剂。免疫balb/c老鼠，每组2只，每只老鼠通过肌肉免疫途径注射10 μg，分析mrna的组织分布特性，能够反映mrna疫苗的安全性，免疫后4小时，每只老鼠腹腔注射150 μg荧光素酶底物，利用活体成像，鉴定组织分布。结果如图6，a为活体成像的荧光结果，左侧为luc
‑
mrna的实验组的活体荧光（上）和处死后的各器官的荧光（下），右侧为对照组空载体脂质体纳米颗粒的活体荧光（上）和处死后的各器官的荧光（下）；b和c为不同组织分布的计数结果。从图中可以看出，仅能够在注射部位的肌肉、附近淋巴结和脾中检测到荧光信号，该结果表明本技术实施例所提供的mrna疫苗的安全性。
68.2.免疫评价将三种不同的mrna送生物公司按照分组装载到mrna脂质体纳米颗粒中制备形成不同的mrna疫苗制剂，分别免疫balb/c老鼠，分组情况为：组1：rbd
‑
sa，组2：rbd
‑
sa rmn，组3：rbd
‑
sa nsps，组4：pbs对照。每组6只，免疫剂量为10 μg，通过肌肉免疫途径，免疫两次，间隔为3周。二次免疫后2周采血分析特异性抗体水平。二次免疫后3周，分离脾细胞，利用多肽刺激，检测脾细胞培养上清中ifn
‑
γ水平，分析细胞免疫抗原ctl表位特异性的细胞免疫应答。
69.（1）elisa：将5种voc新冠病毒（武汉株、英国株、南非株、巴西株、印度株
‑
delta）的
rbd重组蛋白（1 μg/ml）包被elisa板，将二次免疫后2周后所采血分离出免疫血清，倍比稀释，加入对应elisa板中，依次加入hrp
‑
anti
‑
mouse igg 二抗，及tmb，显色终止后a450检测od值，计算抗体滴度。结果如图7所示，从图中可以看出，本技术实施例1所提供的mrna疫苗的各实验组都能诱导产生rbd特异性的igg抗体，对于各个变异株都具有较高的中和抗体滴度水平，表明该mrna疫苗能够有效产生交叉反应能力的特异性抗体，可以有效地诱导机体产生体液免疫应答。
70.（2）假病毒中和：利用vsv假病毒系统，制备5种voc新冠病毒（武汉株、英国株、南非株、巴西株、印度株）的假病毒，将倍比稀释的血清与等量的假病毒37℃孵育1小时，后加入hace2
‑
293t细胞中，48小时后裂解细胞检测荧光强度，计算中和nt50。结果如图8所示，不同假病毒株中，各个疫苗组相对于pbs对照组的p值为图中所示p值，从图中同样可以看出，本技术实施例1所提供的mrna疫苗能够有效产生交叉反应能力的中和活性抗体，能够有效地诱导机体产生体液免疫应答。
71.（3）ifn
‑
γ分泌检测：将免疫后小鼠处死，取脾，分离脾细胞，采用不同的多肽（rbd多肽、mn多肽、nsps多肽以及dmso对照）刺激后，培养3天，利用检测试剂盒检测上清中ifn
‑
γ浓度，反映细胞毒性t淋巴细胞活性。结果如图9所示，从左到右4个为一组，分别是dmso对照组、rbd多肽刺激组、mn多肽刺激组和nsps多肽刺激组的检测结果。从图中可以看出，在rbd多肽实验组中，不同的mrna疫苗均能够对rbd多肽刺激物产生免疫应答反应，分泌ifn
‑
γ，但相对较低。而rbd
‑
sa rmn疫苗和rbd
‑
sa nsps疫苗能够分别对mn和nsp3、nsp4、nsp6的多肽刺激物产生免疫应答反应，分泌较高水平的ifn
‑
γ，证明泛素化的t细胞抗原能够在体内有效诱导产生较强的细胞免疫应答反应，符合设计预期。
72.3.保护性评价新冠病毒活病毒攻毒试验，使用新冠病毒南非突变株。各组疫苗（rbd
‑
sa，rbd
‑
sa rmn，rbd
‑
sa nsps和pbs）按前述实验中的程序免疫，二次免疫三周后，鼻腔感染攻毒（10
5 pfu/只），感染后3天，处死老鼠，分离肺组织及气管，利用q
‑
pcr方法检测组织中的病毒载量。结果如图10所示，a为不同组别肺组织的病毒载量结果，b为不同组别气管组织的病毒载量结果。从图中可以看出，与pbs对照相比，各疫苗组病毒载量均显著降低（相对于rbd
‑
sa组，肺组织的疫苗组p值均小于0.001，气管组织的疫苗组p值均小于0.01），同时，结合了细胞免疫和体液免疫的两个疫苗组（rbd
‑
sa rmn和rbd
‑
sa nsps）均无法检出病毒载量，证明细胞免疫应答能够促进疫苗的整体保护性。
73.综合上述实施例可以看到，本技术实施例所提供的mrna疫苗，一方面能够利用信号肽介导中和结构域抗原的表达分泌，从而诱导出高滴度的中和抗体，且中和抗体水平在针对不同突变病毒株时，不发生显著下降；另一方面通过泛素化的融合t细胞表位富集性抗原表达，促进其降解，以及t细胞表位的形成，从而同时诱导产生相对独立的体液免疫应答和t细胞免疫应答。
74.上面结合实施例对本技术作了详细说明，但是本技术不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本技术宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
技术领域
1.本技术涉及免疫技术领域，尤其是涉及一种靶向刺激体液免疫和细胞免疫的新冠病毒mrna疫苗。
背景技术：
2.mrna疫苗与其它传统疫苗相比，具有研发周期短、研发成本相对较低的优势，同时其溶解度等理化性质适合药物研发，安全性高；而且副作用低，不存在整合、诱导基因突变和外源性病毒感染的风险，因而成为目前疫苗研发的一大热点。在目的抗原基因设计上，依据所靶向诱导的保护性免疫应答类型，选择不同抗原序列进行构建，理想的疫苗设计可以有效诱导病原特异性的体液免疫和细胞免疫应答。
3.然而，目前的mrna疫苗主要还存在以下两方面的问题：一方面，目前成功上市的两款新冠病毒mrna疫苗均倾向以诱导中和抗体以发挥保护性免疫应答，尚未在探索靶向性诱导t细胞免疫应答开展特定设计。另一方面，新冠病毒在流行过程中不断突变而产生的一些优势变种，包括alpha变种（b.1.1.7）、beta变种（b.1.351）、gamma变种（p.1）、delta变种（b.1.617.2）等，对于目前mrna疫苗诱导的抗体可能会发生严重的免疫逃逸。因此，有必要提供一种能够同时靶向刺激体液免疫和细胞免疫，且能够有效诱导产生交叉中和抗体的mrna疫苗。
技术实现要素：
4.本技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本技术提出一种分离的dna分子组合，利用该dna分子组合可以制备得到一种能够同时靶向刺激体液免疫和细胞免疫，且能够有效诱导产生交叉中和抗体的mrna疫苗。
5.本技术的第一方面，提供分离的dna分子组合，该dna分子组合包括：a.第一dna分子，和b.第二dna分子和第三dna分子中的至少一种；其中，第一dna分子包括第一编码区，第一编码区包括编码信号肽的如seq id no.1所示的序列和编码rbd
‑
sa片段的如seq id no.3所示的序列；第二dna分子包括第二编码区，第二编码区包括如seq id no.2所示的泛素化序列和编码rmn片段的如seq id no.6所示的序列；第三dna分子包括第三编码区，第三编码区包括如seq id no.2所示的泛素化序列和编码nsps片段的如seq id no.8所示的序列。
6.根据本技术实施例的分离的dna分子组合，至少具有如下有益效果：（1）第一dna分子上具有编码tpa信号肽的序列和编码rbd
‑
sa片段的序列，以该dna分子为模板合成的mrna在递送到机体内后，利用信号肽介导rbd
‑
sa片段的中和抗原的表达分泌。该rbd
‑
sa片段包括新冠病毒spike蛋白的331
‑
524位氨基酸，并同时融合了突变株的一些关键氨基酸突变位点，从而可以诱导高滴度的中和抗体，具有良好的交叉中和作用，使
得中和抗体水平在针对不同突变病毒株时，不发生显著下降。
7.（2）第二dna分子上具有泛素化序列和编码rmn片段的序列，以该dna分子为模板合成的mrna在递送到机体内后，表达的rmn片段由于抗原的泛素化而发生降解并形成t细胞表位。该rmn片段包括新冠病毒m蛋白和n蛋白的表位富集区的片段并经过重排处理，在防止结构蛋白m、n发挥正常生物学功能促进病毒复制的前提下，保留了其中的ctls表位，能够促进抗原的降解和高效提呈，同时有效排除抗体依赖增强（ade）效应。
8.（3）第三dna分子上具有泛素化序列和编码nsps片段的序列，以该dna分子为模板合成的mrna在递送到机体内后，表达的nsps片段由于抗原的泛素化而发生降解并形成t细胞表位。该nsps片段包括新冠病毒nsp3、nsp4、nsp6等nsp蛋白的表位富集区的片段并经过重排处理，在防止非结构蛋白nsp发挥正常生物学功能促进病毒复制的前提下，保留了其中的ctls表位，能够促进抗原的降解和高效提呈，同时有效排除抗体依赖增强（ade）效应。
9.（4）通过第一dna分子以及第二dna分子和/或第三dna分子的组合，利用第一dna分子最终合成的mrna诱导高滴度的交叉中和抗体，利用第二dna分子和/或第三dna分子最终合成的mrna诱导新冠病毒特异性的细胞毒性t淋巴细胞，从而高效地同时激活相对独立的体液免疫应答和细胞免疫应答，应对新冠病毒在流行传播过程中产生的突变毒株所引发的突破性感染。
10.其中，编码信号肽的核苷酸序列如下：atggacgccatgaagagggggctgtgctgcgtgctgctgctgtgcggagccgtgttcgtgagcgcctcc（seq id no.1）。该信号肽为tpa信号肽，是目前应用最广泛的信号肽之一。在第一dna分子转录形成mrna后，tpa信号肽可以提高中和抗原的可翻译性，从而有效提高中和抗原的表达和分泌的水平，增强免疫应答。
11.泛素化序列如下：atgcagattttcgtgaaaaccctgaccgggaaaaccatcaccctggaagtcgagcccagcgacaccatcgagaacgtcaaggccaaaatccaggacaaggagggcatcccccccgaccagcagaggctgatcttcgccggcaagcagctggaagacggcagaacactgagcgactacaacatccagaaggaaagcaccctgcacctggtgctgagactgagaggcgcc（seq id no.2）。高效表达的t细胞抗原通过泛素化能够促进自身的降解以及t细胞表位的形成。
12.编码rbd
‑
sa片段的核苷酸序列如下：aacatcaccaacctgtgccccttcggcgaggtgttcaacgccaccagattcgccagtgtgtacgcctggaacagaaagaggatctccaactgcgtggccgattactctgtgctgtataatagcgcctccttctctaccttcaaatgctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgatctgtgttttaccaacgtgtacgccgactccttcgtgatcagaggcgacgaggtgaggcagatcgcccccggacagaccggaaatatcgccgattacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgcgtgatcgcctggaactccaacaacctggacagtaaggtggggggaaactacaactacctgtaccggctgttccgcaagagcaacctgaagccctttgagagagacatcagcacagagatttatcaggccggcagcaccccctgcaacggagtgaaaggattcaactgctacttcccactgcaaagctacggcttccagcccacctatggcgtgggataccagccctacagagtggtggtgctgtcttttgagctgctgcacgcccccgccaccgtg（seq id no.3）。
13.rbd
‑
sa片段的氨基酸序列如下所示：nitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgniadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyq
agstpcngvkgfncyfplqsygfqptygvgyqpyrvvvlsfellhapatv（seq id no.4）。该rbd
‑
sa片段利用新冠病毒s蛋白的331
‑
524氨基酸区段，并引入新冠病毒关键氨基酸突变位点k417n、e484k、n501y。
14.大片段重排抗原rmn片段包含细胞毒性t淋巴细胞表位，其氨基酸序列如下所示：ghlriaghhlgrcdikdlpkeitvatsrtlsyyklgasqrvagdsgfaaysryrignyklntdhssssdniallvqaayliflwllwpvtlacfvlaavyrinwitggiaiamaclvglmwlsyfiasfrlfartrsmwsfnpetnillnvplhgtiltrplleselvigavilrghlriaghhlaaymadsngtitveelkklleqwnlvigflfltwicllqfayanrnrflyiikliflwllwpvaayqelirqgtdykhwpqiaqfapsasaffgmsrigmevtpsgtwltytgaiklddkdpnfkdqvillnkhidayktfpptepkkdkkkkadetqalpqrqkkqqtvtllpaadlddfskqlqqsmssadstqaaayirggdgkmkdlsprwyfyylgtgpeaglpygankdgiiwvategalntpkdhigtrnpannaaivlqlpqgttlpkgfyaegsrggsqassrsssrsrnssrnstpgsaaymsdngpqnqrnapritfggpsdstgsnqngersgarskqrrpqglpnntaswftaltqhgkedlkfprgqgvpintnsspddqigyyrratrrirggdgkmkdaaynssrnstpgssrgtsparmagnggdaalalllldrlnqleskmsgkgqqqqgqtvtkksaaeaskkprqkrtatkaynvtqafgrrgpeqtqgnfgdqelirqgtdyaaygkpipnpllgldst（seq id no.5）。其中rmn对新冠病毒m蛋白和n蛋白的抗原富集区进行分段重排，各片段间由aay连接。
15.编码rmn片段的核苷酸序列如下所示：ggccacctgcgcatcgccggccatcacctgggcagatgcgacatcaaggatctgcctaaagaaatcaccgtggccacgagccggaccctgtcttactacaaactgggcgcctcccagagagtggccggcgatagcggatttgccgcctattctagataccggatcggcaactacaagctgaacaccgatcacagcagcagcagcgacaacatcgccctgctggtccaggccgcctacctgatcttcctgtggctgctgtggcctgtgaccctggcctgttttgtgcttgctgctgtctacagaatcaactggatcaccggcggcatcgccatcgccatggcctgcctggtgggcctgatgtggctgagctacttcatcgcatcatttagactgttcgccagaacccggtccatgtggagcttcaaccccgagacaaacatcctgctcaatgtgccgctgcacggaaccatcctgacacggcctctgcttgagagcgagctggttatcggagctgtgatcctgagaggccacctgagaatcgccggacaccacctggctgcctatatggctgatagcaacggcaccatcacagtggaggaattaaagaaactgctggaacagtggaacctggtgatcggatttctgttcttgacatggatctgcctgctgcagttcgcctatgccaatagaaatagattcctgtacatcatcaaactgatctttctgtggctgctctggcccgtggctgcctatcaggagctgattcgccagggcaccgactacaagcactggcctcaaatagcccagtttgcccctagcgccagcgccttcttcggaatgagcagaatcggcatggaagtgactcctagcggcacatggctcacatacacaggcgccatcaagctcgacgataaggaccccaacttcaaggatcaggtgatcctgctgaacaagcacatcgacgcctacaagacattcccccccaccgagcccaagaaggacaagaagaagaaggccgacgagacacaggccctgccccagcggcaaaagaagcagcaaacagtgaccctgcttcctgccgccgacctggacgacttcagcaagcagctgcagcaaagcatgagctccgccgacagcacccaagccgctgcctacatccggggcggagacggcaagatgaaggacctgagccccagatggtacttctactacctgggcaccggcccagaggccggcctgccatacggagccaacaaggatggcatcatctgggtggccacagaaggcgccctgaatacccctaaggaccacatcggcacccggaaccctgctaataacgccgcaatcgtgctgcaactgccacaaggcacgaccctgcctaaaggcttctacgccgagggatcccggggaggcagccaggcctctagcagaagctcttctcggagccgtaacagctctcgcaacagcacacccggctccgccgcctacatgagcgataacggccctcagaaccagagaaatgctcctcggatcaccttcggcggcccttctgacagcaccggtagcaaccagaacggcgagagaagtggagctagaagcaagcaaagaaggcctcagggcctgcctaacaacacagcctcttggttcaccgccctgacacagcacgggaaagaggacctgaagttccctagaggccagggggtgcctattaacaccaacagctctccagacgaccagatc
ggctactacagacgcgccaccagacgaatcagaggcggagacggcaagatgaaagatgccgcttacaattctagccggaatagcacacccggcagctctagaggaacaagccctgctagaatggccggaaacggcggcgacgccgctctggccctgctgttgctggatagactgaaccagctggaatccaagatgagcggcaagggccagcagcagcagggccagaccgtgacaaagaaatctgctgccgaggcctctaagaaacctagacagaaaagaacagccaccaaggcctacaacgtgacccaggctttcggcagacggggccccgagcagacccagggcaacttcggggaccaggagctgatcagacagggcaccgactacgccgcttacggcaagcccatccccaatcctctgctgggcctggacagcacctga（seq id no.6）。
16.大片段重排抗原nsps包含细胞毒性t淋巴细胞表位，其氨基酸序列如下所示：syctgyregylnstnvtiatyctgsipcsvclsgldsldtypsletiqitissfkwdltafglvaewflayilftrffyvlglaaimqlffsyfavhfisnswlmwliinlvqmapisamvrmyiffasfyyvwksyvhvvdgcnsstcmmcykrnratrvecaaygvcvstsgrwvlnndyyrslpgvfcgvdavnlltnmftpliqpigaldisasivaggivaivvtclayyfmrfrrafgeyshvvafntllflmsftvlcltpvysflpgvysviylyltfyltndvsflahiqwmvmftplvpfwitiayiicistkhfywffsnylkrrvvfngvsfstfeeaalctfllnkemylklrsdvllpltqynryaaysavkrtikgthhwllltiltsllvlvqstqwslffflyenaflpfamgiiamsafammfvkhkhaflclfllpslatvayfnmvympaswvmrimtwldmvdtslsgfklkdcvmyasavvllilmtartvyddgarrvwtlmnvltlvykvyygnaldqaismwaliisvtsnysgvvttvmflargivfmcveycpiff（seq id no.7）。其中nsps片段对nsp3、nsp4、nsp6等非结构蛋白的抗原富集区进行分段重排，各片段间由aay连接。
17.编码nsps片段的核苷酸序列如下所示：agctactgcaccggatacagagagggatatctgaacagcacaaacgtgaccatcgccacctactgcacaggcagcatcccctgcagcgtgtgcctgagcggcctggattcactggatacctacccctcactggagaccatccagatcaccatcagcagcttcaagtgggacctgaccgcctttggcctggtggccgagtggttcctggcctatatcctgttcacccgcttcttttacgtcctgggcctggccgccatcatgcagctgttcttctcctacttcgccgtgcacttcatcagcaattcctggctgatgtggctgatcattaacctggtgcagatggcccctatcagcgccatggtgagaatgtacatcttcttcgcctccttctactacgtgtggaagtcctacgtccacgtggtggacggctgcaactcctctacctgcatgatgtgctacaagagaaacagagccaccagagtggagtgcgccgcctatggagtgtgtgtgagcaccagcgggcgctgggtgctgaataatgactattacaggtccctgcccggagtgttctgcggcgtggacgcagtgaatctgctgaccaacatgttcacccccctgattcagcctatcggagccctggacatttctgccagcatcgtggccggcggaatcgtggctattgtggtgacctgtctggcttactatttcatgagattcagaagggccttcggcgagtacagccacgtggtggcctttaacaccctgctgttcctgatgtcctttaccgtgctgtgtctgactcccgtgtattctttcctgcccggcgtgtacagcgtgatctatctgtatctgaccttctacctgaccaatgacgtgagcttcctggcccacatccagtggatggtgatgtttacccccctggtccccttctggatcaccatcgcctacatcatctgcatctccaccaaacacttctactggttcttctccaactacctgaaaagacgcgtggtcttcaacggcgtgtccttctccaccttcgaggaggccgccctgtgcaccttcctgctgaacaaggagatgtacctgaagctgcggtccgacgtcctgctgcccctgacacagtataatagatacgctgcttactccgccgtgaagagaacaatcaagggcacccaccactggctgctgctgaccatcctgacctccctgctggtgctggtgcagagcacccagtggagcctgttcttctttctgtatgagaacgcctttctgcccttcgccatgggcatcatcgccatgtccgccttcgccatgatgttcgtgaagcataagcacgccttcctgtgcctgtttctgctgccctccctggctaccgtggcctacttcaacatggtgtacatgcccgccagctgggtgatgagaatcatgacctggctggatatggtggacacctccctgtccggcttcaagctgaaagactgcgtgatgtatgcttccgccgtggtgctgctgatcctgatgactgcccggaccgtgtacgacgacggcgctagaagagtgtggaccctgatgaacgtcctgaccc
tggtgtacaaagtgtattacggcaatgccctggatcaggccatttccatgtgggccctgattatctccgtgacctccaattacagcggagtggtgaccaccgtgatgttcctggcccggggcatcgtgttcatgtgcgtggagtattgccccatctttttc（seq id no.8）。
18.在本技术的一些实施方式中，第一编码区、第二编码区和第三编码区的上下游还分别具有5
′
端非翻译区（5
′‑
utr）和3
′
端非翻译区（3
′‑
utr）。
19.在本技术的一些实施方式中，第一编码区、第二编码区和第三编码区的下游还具有多聚腺苷酸（polya）。
20.mrna一直以来面临不稳定、半衰期短等问题，为了解决该问题，在其dna模板上加入修饰作用的结构元件，如5
′
端非翻译区（5
′‑
utr）、3
′
端非编码区（3
′‑
utr）和多聚腺苷酸（polya）等，使得最终合成的mrna保持完整结构，有利于其稳定性，延长其半衰期并提高mrna的表达能力。
21.在本技术的一些实施方式中，多聚腺苷酸的腺苷酸数量在100个以上。
22.在本技术的一些实施方式中，dna分子的编码区的上游还具有启动子，启动子选自t7启动子、sp6启动子中的任一种。
23.在本技术的一些实施方式中，编码区还包括报告基因。为了明确不同抗原的表达情况或其它目的，在抗原编码区内还可以插入报告基因从而方便检测。
24.在本技术的一些实施方式中，报告基因选自荧光蛋白、荧光素酶、蛋白标签中的至少一种。
25.在本技术的一些实施方式中，蛋白标签选自ha标签、flag标签、his标签或v5标签中的至少一种。
26.本技术的第二方面，提供抗原表达载体组合，该抗原表达载体组合包括：a.第一抗原表达载体，和b.第二抗原表达载体和第三抗原表达载体中的至少一种；其中，第一抗原表达载体包括前述的dna分子组合中的第一dna分子；第二抗原表达载体包括前述的dna分子组合中的第二dna分子；第三抗原表达载体包括前述的dna分子组合中的第三dna分子。
27.本技术的第三方面，提供分离的mrna分子组合，该mrna分子组合由前述的抗原表达载体组合制备得到。
28.由上述的抗原表达载体经体外转录而成的mrna分子组合，在进入到体内后，一方面能够利用信号肽介导中和结构域抗原的表达分泌，从而诱导高滴度的中和抗体，且中和抗体水平在针对不同突变病毒株时，不发生显著下降；而另一方面泛素化的融合t细胞表位富集性抗原表达，促进其降解，以及t细胞表位的形成；从而同时诱导产生相对独立的中和抗体和t细胞免疫应答。
29.本技术的第四方面，提供新冠病毒mrna疫苗，该新冠病毒mrna疫苗包括前述的mrna分子组合。
30.在本技术的一些实施方式中，还包括药学上可接受的载体。
31.在本技术的一些实施方式中，载体为脂质载体。脂质载体的非限制性实例包括脂质体，如脂质纳米颗粒（lnp），采用包括但不限于薄膜水化法、逆向蒸发法、挤出法、均质法等方式制备得到的脂质纳米颗粒与mrna疫苗混匀孵育即得到该疫苗。可以理解的是，其它
如阳离子脂质复合物（lpx）、脂质多聚复合物（lpp）、聚合物纳米颗粒（pnp）、无机纳米颗粒（inp）、阳离子纳米乳（cne）等也同样可以作为mrna的载体进行递送。
32.在本技术的一些实施方式中，脂质载体为阳离子脂质纳米颗粒。
33.本技术的第五方面，提供制剂，该制剂包括前述的新冠病毒mrna疫苗。
34.综上可以看到，本方案公开了上述分离的dna分子组合、抗原表达载体组合、分离的mrna分子组合、疫苗、制剂，利用这些材料，可以应用到制备新冠病毒的预防和/或治疗的产品中，从而高效地同时激活相对独立的体液免疫应答和细胞免疫应答，应对新冠病毒在流行传播过程中产生的突变毒株所引发的突破性感染。
35.本技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本技术的实践了解到。
附图说明
36.图1是本技术的实施例1中的pca
‑
rbd
‑
sa抗原表达载体的图谱。
37.图2是本技术的实施例1中的pca
‑
ub
‑
rmn抗原表达载体的图谱。
38.图3是本技术的实施例1中的pca
‑
ub
‑
nsps抗原表达载体的图谱。
39.图4是本技术的蛋白表达验证实验中抗原表达水平的western blot检测结果。
40.图5是本技术的蛋白表达验证实验中抗原表达水平的流式细胞仪的检测结果。
41.图6是本技术的mrna疫苗免疫评价安全性实验的检测结果。其中，a为活体成像的荧光结果，b和c为不同组织分布的计数结果。
42.图7是本技术的mrna疫苗免疫评价实验的不同突变株的中和抗体elisa检测结果。
43.图8是本技术的mrna疫苗免疫评价实验的不同突变株的假病毒中和检测结果。
44.图9是本技术的mrna疫苗免疫评价实验的不同突变株的ifn
‑
γ分泌检测结果。
45.图10是本技术的mrna疫苗免疫评价实验的保护性评价的检测结果。
具体实施方式
46.以下将结合实施例对本技术的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本技术的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本技术的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本技术的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本技术保护的范围。
47.下面详细描述本技术的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本技术，而不能理解为对本技术的限制。
48.在本技术的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
49.本技术的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本技术的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点
可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
50.实施例1本实施例提供一种新冠病毒mrna疫苗的抗原表达载体的组合。该抗原表达载体的组合包括三个抗原表达载体，分别是pca
‑
rbd
‑
sa、pca
‑
ub
‑
rmn和pca
‑
ub
‑
nsps。
51.这些抗原表达载体分别参考图1~3，其中，pca
‑
rbd
‑
sa质粒上具有一抗原编码区，抗原编码区内包括依次连接的编码tpa信号肽的序列和编码rbd
‑
sa片段的序列，在编码rbd
‑
sa片段的序列的3
′
端还插入有编码flag标签的序列和终止密码子（flag序列和终止密码子图中未示出）。在抗原编码区的上下游还分别连接有t7启动子、5
′
端非翻译区（5
′‑
utr）以及3
′
端非编码区（3
′‑
utr）、多聚腺苷酸（polya）。
52.pca
‑
ub
‑
rmn质粒上具有一抗原编码区，抗原编码区内包括依次连接的泛素化序列和编码rmn片段的序列，而在编码rmn片段的序列的3
′
端还有编码v5标签的序列和终止密码子（v5序列和终止密码子图中未示出）。而在抗原编码区的上下游还分别连接有t7启动子、5
′
端非翻译区（5
′‑
utr）以及3
′
端非编码区（3
′‑
utr）、多聚腺苷酸（polya）。
53.pca
‑
ub
‑
nsps质粒上具有一抗原编码区，抗原编码区内包括依次连接的泛素化序列和编码nsps片段的序列，在编码nsps片段的序列的3
′
端还有编码v5标签的序列和终止密码子（v5序列和终止密码子图中未示出）。在抗原编码区的上下游还分别连接有t7启动子、5
′
端非翻译区（5
′‑
utr）以及3
′
端非编码区（3
′‑
utr）、多聚腺苷酸（polya）。
54.上述抗原表达载体质粒的构建方法如下：（1）酶切pcaggs载体，使用限制性内切酶xho
ꢀⅰ
和kpn
ꢀⅰ
双酶切载体，回收大片段（载体）。
55.（2）交由生物公司合成如下三段基因序列：序列一：包括tpa信号肽序列（seq id no.1）和sars
‑
cov
‑
2的spike蛋白的受体结合域片段（rbd，seq id no.3），另外在3
′
端还插入有flag标签和终止密码子。
56.序列二：包括泛素化序列（seq id no.2）和rmn序列（seq id no.6），另外在3
′
端还插入有v5标签和终止密码子。
57.序列三：包括泛素化序列（seq id no.2）和nsps序列（seq id no.8），另外在3
′
端还插入有v5标签和终止密码子。
58.根据上述的序列，合成时两端设置限制性酶切位点xho1和kpn1，电泳并胶回收特异性片段，利用t4 dna连接酶方法，连接各片段与载体。
59.（3）按常规方法进行大肠杆菌转化，次日挑选克隆菌，小提质粒，测序公司测序。
60.（4）序列比对正确后，利用大提质粒试剂盒进行质粒大提，nanodrop测量质粒浓度和纯度备用，并将上述三种质粒命名为pca
‑
rbd
‑
sa, pca
‑
ub
‑
rmn和pca
‑
ub
‑
nsps。
61.mrna转录验证实验（1）利用bsa i限制性内切酶对实施例1中构建得到的抗原表达载体进行线性化后电泳鉴定，电泳位移相对较小。回收后蛋白激酶k处理，酚氯仿抽提，溶解于无rna酶水中，分光光度计检测浓度。
62.（2）利用生物公司购买的体外转录试剂盒及加帽试剂盒，按说明书操作合成含有50% pseudoutp的mrna，氯化锂沉淀纯化，75%乙醇洗涤一次，晾干，溶于无rna酶水中，分光光度计检测浓度。
63.（3）配置变性rna凝胶，将rna样品与2
×
rna上样缓冲液1：1混合，70℃金属浴热变性10分钟，冰浴5分钟，电泳（120v，20min）。结果与预期相符。
64.蛋白表达验证实验参考图1~3和上述实验方法构建包含中和抗原或细胞抗原的质粒，分别将命名为rbd
‑
sa、rmn和nsps的质粒线性化后进行体外转录。利用rna转染试剂将rbd
‑
sa、rmn和nsps质粒转录出的mrna分别转染hek 293t细胞，鉴定相关基因元件的功能。其中，对照组为未转染相应mrna的细胞，rbd
rmn
组为同时转染对应的rbd
‑
sa、rmn两种质粒转录出的两条mrna的细胞，rbd
nsps
组为同时转染对应的rbd
‑
sa、nsps两种质粒转录出的两条mrna的细胞，rbd
组、rmn
组和nsps
组为分别转染对应的其中一种质粒转录出的一条mrna的细胞。
65.转染后40小时，向细胞培养基中添加蛋白酶体抑制剂mg132（50μm)，并设置对照，8小时后，对细胞进行处理：（1）western blot：细胞裂解后收集蛋白进行sds
‑
page电泳，转膜封闭后，分别用抗flag标签抗体鉴定b细胞抗原（rbd）的表达，结果如图4。从图中可以看出，相比于对照组，rbd
‑
sa质粒组中出现了明显的rbd
‑
sa的条带。
66.（2）流式细胞术：由于t细胞抗原泛素化严重，wb检测不敏感，采用流式方法鉴定t细胞抗原的表达胰酶消化为单个细胞，破膜固定后，分别用fitc标记的抗v5标签抗体和alexa fluor
‑
555（af555）标记的抗flag标签抗体染色，利用流式细胞仪鉴定rbd和rmn、nsp346抗原的表达。结果如图5所示，从图中可以看出，三种mrna分别能够有效实现b细胞抗原和t细胞抗原的表达，而其中两种共同转染能够实现两种抗原组分的共同表达，提示可以作为疫苗的两种组分，进行疫苗有效性评价，符合设计预期。
67.免疫评价实验1.安全性参考实施例1，采用相同方法构建包含luciferase报告基因序列的质粒，将其线性化后体外转录、加帽得到对应的luc
‑
mrna分子，送生物公司装载到mrna脂质体纳米颗粒中制备形成mrna疫苗的制剂。免疫balb/c老鼠，每组2只，每只老鼠通过肌肉免疫途径注射10 μg，分析mrna的组织分布特性，能够反映mrna疫苗的安全性，免疫后4小时，每只老鼠腹腔注射150 μg荧光素酶底物，利用活体成像，鉴定组织分布。结果如图6，a为活体成像的荧光结果，左侧为luc
‑
mrna的实验组的活体荧光（上）和处死后的各器官的荧光（下），右侧为对照组空载体脂质体纳米颗粒的活体荧光（上）和处死后的各器官的荧光（下）；b和c为不同组织分布的计数结果。从图中可以看出，仅能够在注射部位的肌肉、附近淋巴结和脾中检测到荧光信号，该结果表明本技术实施例所提供的mrna疫苗的安全性。
68.2.免疫评价将三种不同的mrna送生物公司按照分组装载到mrna脂质体纳米颗粒中制备形成不同的mrna疫苗制剂，分别免疫balb/c老鼠，分组情况为：组1：rbd
‑
sa，组2：rbd
‑
sa rmn，组3：rbd
‑
sa nsps，组4：pbs对照。每组6只，免疫剂量为10 μg，通过肌肉免疫途径，免疫两次，间隔为3周。二次免疫后2周采血分析特异性抗体水平。二次免疫后3周，分离脾细胞，利用多肽刺激，检测脾细胞培养上清中ifn
‑
γ水平，分析细胞免疫抗原ctl表位特异性的细胞免疫应答。
69.（1）elisa：将5种voc新冠病毒（武汉株、英国株、南非株、巴西株、印度株
‑
delta）的
rbd重组蛋白（1 μg/ml）包被elisa板，将二次免疫后2周后所采血分离出免疫血清，倍比稀释，加入对应elisa板中，依次加入hrp
‑
anti
‑
mouse igg 二抗，及tmb，显色终止后a450检测od值，计算抗体滴度。结果如图7所示，从图中可以看出，本技术实施例1所提供的mrna疫苗的各实验组都能诱导产生rbd特异性的igg抗体，对于各个变异株都具有较高的中和抗体滴度水平，表明该mrna疫苗能够有效产生交叉反应能力的特异性抗体，可以有效地诱导机体产生体液免疫应答。
70.（2）假病毒中和：利用vsv假病毒系统，制备5种voc新冠病毒（武汉株、英国株、南非株、巴西株、印度株）的假病毒，将倍比稀释的血清与等量的假病毒37℃孵育1小时，后加入hace2
‑
293t细胞中，48小时后裂解细胞检测荧光强度，计算中和nt50。结果如图8所示，不同假病毒株中，各个疫苗组相对于pbs对照组的p值为图中所示p值，从图中同样可以看出，本技术实施例1所提供的mrna疫苗能够有效产生交叉反应能力的中和活性抗体，能够有效地诱导机体产生体液免疫应答。
71.（3）ifn
‑
γ分泌检测：将免疫后小鼠处死，取脾，分离脾细胞，采用不同的多肽（rbd多肽、mn多肽、nsps多肽以及dmso对照）刺激后，培养3天，利用检测试剂盒检测上清中ifn
‑
γ浓度，反映细胞毒性t淋巴细胞活性。结果如图9所示，从左到右4个为一组，分别是dmso对照组、rbd多肽刺激组、mn多肽刺激组和nsps多肽刺激组的检测结果。从图中可以看出，在rbd多肽实验组中，不同的mrna疫苗均能够对rbd多肽刺激物产生免疫应答反应，分泌ifn
‑
γ，但相对较低。而rbd
‑
sa rmn疫苗和rbd
‑
sa nsps疫苗能够分别对mn和nsp3、nsp4、nsp6的多肽刺激物产生免疫应答反应，分泌较高水平的ifn
‑
γ，证明泛素化的t细胞抗原能够在体内有效诱导产生较强的细胞免疫应答反应，符合设计预期。
72.3.保护性评价新冠病毒活病毒攻毒试验，使用新冠病毒南非突变株。各组疫苗（rbd
‑
sa，rbd
‑
sa rmn，rbd
‑
sa nsps和pbs）按前述实验中的程序免疫，二次免疫三周后，鼻腔感染攻毒（10
5 pfu/只），感染后3天，处死老鼠，分离肺组织及气管，利用q
‑
pcr方法检测组织中的病毒载量。结果如图10所示，a为不同组别肺组织的病毒载量结果，b为不同组别气管组织的病毒载量结果。从图中可以看出，与pbs对照相比，各疫苗组病毒载量均显著降低（相对于rbd
‑
sa组，肺组织的疫苗组p值均小于0.001，气管组织的疫苗组p值均小于0.01），同时，结合了细胞免疫和体液免疫的两个疫苗组（rbd
‑
sa rmn和rbd
‑
sa nsps）均无法检出病毒载量，证明细胞免疫应答能够促进疫苗的整体保护性。
73.综合上述实施例可以看到，本技术实施例所提供的mrna疫苗，一方面能够利用信号肽介导中和结构域抗原的表达分泌，从而诱导出高滴度的中和抗体，且中和抗体水平在针对不同突变病毒株时，不发生显著下降；另一方面通过泛素化的融合t细胞表位富集性抗原表达，促进其降解，以及t细胞表位的形成，从而同时诱导产生相对独立的体液免疫应答和t细胞免疫应答。
74.上面结合实施例对本技术作了详细说明，但是本技术不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本技术宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
再多了解一些
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