一种靶向P-选择素的工程化细胞外囊泡组合物及其制备方法和应用与流程

一种靶向p
‑
选择素的工程化细胞外囊泡组合物及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学技术领域，尤其是涉及一种靶向p
‑
选择素的工程化细胞外囊泡组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.内皮细胞是血管内壁一层扁平的细胞，位于血浆与血管组织之间，它不仅能完成血浆和组织液的代谢交换，还能合成和分泌一系列的血管活性物质参与多种生理病理学过程。在生理状态下，内皮细胞可以调节血管壁紧张度，并具有抗炎症细胞粘附、抗血小板粘附激活等保护作用。当其受到炎症因子、凝血酶、高血糖、活性氧等刺激时，内皮细胞发生损伤，从而导致血管紧张度改变、炎症细胞粘附浸润、血栓形成等病理学改变。因此，内皮细胞损伤与肿瘤、心血管疾病、缺血再灌注相关疾病、糖尿病导致的微血管病变相关疾病、自身免疫性相关疾病、炎症相关疾病的发生发展均有密切关系。
3.p
‑
选择素(p
‑
selectin)是选择素家族的重要粘附分子，在生理状态下主要存在于内皮细胞怀布尔
‑
帕拉德体(weible
‑
palade body，简称w
‑
p小体)中。在内皮细胞损伤后，p
‑
选择素在内皮细胞中迅速表达并被转移至内皮细胞膜上，通过介导炎症细胞、血小板的募集与粘附，参与了包括炎症反应和血栓形成等多种病理生理起始过程。这些特征表明，p
‑
选择素是指示内皮细胞损伤程度的指标分子，同时也是实现损伤内皮细胞靶向治疗的良好靶点。但是，目前没有以p
‑
选择素为靶点，用于诊断、治疗内皮细胞损伤相关疾病的可视化诊疗策略。
4.因此，设计可以精准靶向p
‑
选择素的治疗手段和药物递送系统，同时实现通过定量p
‑
选择素表达量指示组织损伤程度的可视化诊疗，具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种靶向p
‑
选择素的工程化细胞外囊泡组合物及其制备方法和应用，工程化细胞外囊泡以p
‑
选择素作为靶点靶向损伤内皮细胞，实现了靶向内皮细胞损伤相关疾病的目的，填补了现有技术中没有可通用的靶向诊疗损伤内皮相关疾病的技术手段的空白，可广泛应用于多种内皮细胞损伤相关疾病的诊断、治疗中。
6.为实现上述目的，本发明提供了一种靶向p
‑
选择素的工程化细胞外囊泡组合物，包括细胞外囊泡、特异性靶向p
‑
选择素的配体分子、分子成像造影剂和细胞外囊泡内携带的内源性或外源性功能成分；
7.工程化细胞外囊泡用于特异性识别并结合损伤内皮细胞表面的p
‑
选择素，并通过分子成像造影剂信号强度指示p
‑
选择素的表达量，并将携带的内源性或外源性功能成分递送至损伤部位。
8.优选的，细胞外囊泡来源于人类细胞或血小板的囊泡，包括外泌体、微泡、血小板碎片；
9.所述人类细胞是人来源干细胞或人来源免疫细胞，人来源干细胞包括但不限于人胎盘来源间充质干细胞、人脐带来源间充质干细胞、人骨髓来源间充质干细胞、人脂肪来源间充质干细胞、人来源诱导多能干细胞；人来源免疫细胞，包括但不限于人t细胞、人巨噬细胞、人中性粒细胞、人自然杀伤细胞。
10.优选的，特异性靶向p
‑
选择素的配体分子是p
‑
选择素糖蛋白配体1、p
‑
选择素结合肽、单克隆抗体、岩藻多糖中的一种或两种以上的组合。
11.优选的，所述p
‑
选择素结合肽为含有ewvdv五肽核心基序的特异性结合p
‑
选择素的多肽。
12.优选的，分子成像造影剂是放射性核素分子成像探针、光学分子成像探针、核磁共振分子成像探针中的一种或两种以上的组合。
13.优选的，所述光学分子成像探针，包括但不限于荧光染料、纳米荧光材料、量子点、荧光蛋白、荧光素酶。
14.优选的，所述细胞外囊泡内携带的功能性成分是细胞外囊泡携带的来源于其供体细胞的天然活性分子或负载的外源性功能分子，供体细胞的天然活性分子包括蛋白质、核酸、脂类分子，负载的外源性功能分子是外源加载的小分子药物、小干扰rna、microrna或蛋白质。
15.一种靶向p
‑
选择素的工程化细胞外囊泡组合物的制备方法，步骤如下：
16.s1、分离提取人类细胞或血小板来源的细胞外囊泡；
17.s2、在细胞外囊泡中负载内源性或外源性功能成分；
18.s3、在细胞外囊泡表面修饰特异性靶向p
‑
选择素的配体分子，使细胞外囊泡具有靶向p
‑
选择素的能力；
19.s4、在细胞外囊泡或配体分子上修饰分子成像造影剂，使细胞外囊泡具有分子成像功能，得到所述的靶向p
‑
选择素的工程化细胞外囊泡组合物。
20.优选的，分离提取细胞外囊泡的方法可以是差速离心法、密度梯度离心法、尺寸排阻色谱法、超滤离心法、基于聚合物沉淀法、免疫分离技术。
21.优选的，细胞外囊泡中负载内源性或外源性功能分子的方法，可以是通过间接改造供体细胞的方法和直接改造细胞外囊泡的方法。
22.优选的，通过间接改造供体细胞在细胞外囊泡中负载功能分子的方法，可以是利用基因工程改造供体细胞、利用代谢掺入改造供体细胞、利用生物活性材料改造供体细胞、低氧预处理改造供体细胞等方法。
23.优选的，通过直接改造细胞外囊泡在细胞外囊泡中负载功能分子的方法，可以是电穿孔法、膜表面化学修饰法、疏水插入法、共孵育法。
24.优选的，细胞外囊泡表面修饰特异性靶向p
‑
选择素配体分子的方法，可以是通过两亲性化合物将靶向p
‑
选择素的配体分子疏水插入细胞外囊泡膜上的方法、通过基因工程将靶向p
‑
选择素的配体分子展示在细胞外囊泡膜表面的方法。
25.优选的，两亲性化合物可以是二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇(dmpe
‑
peg)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇(dspe
‑
peg)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇(dppe
‑
peg)、二油酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇(dope
‑
peg)、二芥酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇(depe
‑
peg)、1
‑
棕榈酰基
‑2‑
油酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇(dlpe
‑
peg)。
26.优选的，在细胞外囊泡或配体分子上修饰分子成像造影剂的方法，可以是通过在细胞外囊泡上修饰成像分子的方法和在特异性靶向p
‑
选择素的配体分子上修饰成像分子的方法。
27.优选的，在细胞外囊泡上修饰成像分子的方法，可以是利用基因工程将荧光蛋白或荧光素酶与细胞外囊泡膜蛋白融合表达在细胞外囊泡上修饰成像分子的方法、利用亲脂性荧光染料标记细胞外囊泡的方法、利用代谢掺入在细胞外囊泡上修饰放射性同位素的方法、利用静电吸附原理在细胞外囊泡膜表面吸附纳米荧光材料的方法、利用共孵育或电穿孔将量子点或纳米荧光材料负载到细胞外囊泡中的方法。
28.优选的，在靶向p
‑
选择素的配体分子上修饰成像分子的方法，可以是利用点击化学反应在配体分子氨基酸残基侧链上耦连荧光染料的方法。
29.一种靶向p
‑
选择素的工程化细胞外囊泡组合物的应用，在诊断、治疗内皮细胞损伤相关疾病试剂中的应用。
30.优选的，内皮细胞损伤相关疾病可以是肿瘤、心血管疾病、缺血再灌注相关疾病、糖尿病导致的微血管病变相关疾病、自身免疫性相关疾病、炎症相关疾病。
31.因此，本发明采用上述一种靶向p
‑
选择素的工程化细胞外囊泡组合物及其制备方法和应用，技术优势如下：
32.本发明中在靶向p
‑
选择素的工程化细胞外囊泡中细胞外囊泡来源于人类细胞或血小板，与现有脂质体或纳米材料相比，细胞外囊泡由天然的脂质和表面蛋白组成，具有免疫原性低、血液半衰期长和生物安全性高等优势；同时，细胞外囊泡的产生方式及其组成成分，赋予了其易于通过多种方式修饰改造、可以修饰多种功能基团的特性；此外，细胞外囊泡具有的脂膜包裹的囊泡结构，使其能够像“特洛伊木马”一样，在内腔中负载不同的亲水性功能成分，或在其磷脂双分子层中负载疏水性功能成分，并将外源性功能成分递送到损伤部位。
33.本发明提供的靶向p
‑
选择素的工程化细胞外囊泡同时具有多种功能，通过负载分子成像造影剂，可以基于量化p
‑
选择素表达量来反应内皮细胞损伤程度，进一步指示组织损伤程度；此外，通过将细胞外囊泡内携带的内源性或外源性功能成分靶向递送至p
‑
选择素高表达的损伤部位，可以实现对内皮细胞损伤相关疾病的靶向治疗；通过将分子影像技术与基于细胞外囊泡的靶向治疗策略相结合，实现了内皮细胞损伤相关疾病的诊疗一体化。
34.下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
35.图1是靶向p
‑
选择素的工程化细胞外囊泡的制备流程图；
36.图2是实施例四中二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇
‑
p
‑
选择素结合肽(dmpe
‑
peg
‑
pbp，dpp)的合成路线；
37.图3是实施例四中合成的dpp的一维h谱核磁共振检测结果；
38.图4是实施例四中p
‑
选择素结合肽修饰的工程化细胞外囊泡(pbp
‑
evs)的制备流程示意图；
39.图5是实施例一、四、五、六中细胞外囊泡不同状态的示意图，其中a是细胞外囊泡
(evs)、b是pbp
‑
evs、c是gaussia荧光素酶(gluc)修饰的pbp
‑
evs、d是cyanine5.5荧光染料(cy5.5)修饰的pbp
‑
evs；
40.图6是实施例七中表征鉴定制备的pbp
‑
evs的结果，a是合成的pbp
‑
evs标记效率的流式细胞仪检测结果、b是evs和pbp
‑
evs粒径分布结果、c是evs和pbp
‑
evs膜电位检测结果、d是evs和pbp
‑
evs透射电镜图片(标尺为100nm)、e是间充质干细胞细胞裂解液、分离提取的evs和制备的pbp
‑
evs中细胞外囊泡标志蛋白alix、tsg101和cd63的蛋白免疫印迹条带；
41.图7是实施例八中制备的pbp
‑
evs在4℃存放1、3、7天后的稳定性检测结果；
42.图8是实施例九中利用gluc生物发光成像检测pbp
‑
evs靶向损伤内皮细胞能力的图像及gluc信号强度统计，*表示与evs注射组对应时间点相比，p<0.05；
43.图9是实施例九中利用cy5.5荧光成像检测pbp
‑
evs靶向损伤内皮细胞能力的图像及cy5.5信号强度统计，*表示与evs注射组对应时间点相比，p<0.05；
44.图10是实施例十中利用gluc生物发光成像检测pbp
‑
evs靶向缺血再灌注损伤肾脏能力的图像及gluc信号强度统计，*表示与evs注射组对应时间点相比，p<0.05；
45.图11是实施例十中利用cy5.5荧光成像检测pbp
‑
evs靶向缺血再灌注损伤肾脏能力的图像及cy5.5信号强度统计，*表示与evs注射组对应时间点相比，p<0.05；
46.图12是实施例十一中利用gluc生物发光成像检测pbp
‑
evs信号强度指示不同肾损伤程度的图像及gluc信号强度统计，*表示p<0.05；
47.图13是实施例十一中经evs和pbp
‑
evs治疗后的肾脏功能和组织结构的检测结果，a是单侧缺血再灌注肾损伤小鼠在损伤后第3天和第7天的血清肌酐和尿素氮含量，*表示与pbs组相比，p<0.05；#表示与evs组相比，p<0.05；b
‑
c是缺血再灌注损伤肾脏组织在损伤后第3天的苏木素&伊红染色图片及对其中蛋白管型和刷状缘丢失小管数量统计，标尺为100μm；*表示与pbs组相比，p<0.05；#表示与evs组相比，p<0.05。
具体实施方式
48.以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，本发明可以用本领域技术人员已知或未来发展的任何技术方法制备。还要理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，且并非旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
49.如本领域技术人员阅读本发明之后将清楚的，本文描述并示例的个体实施例中的每个具有离散的组件和特征，其可容易地与其他若干实施例中的任一个实施例的特征分离或组合而不偏离本发明的范围或精神。任何所提及的方法可以以事件提及的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序来进行。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
50.除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
51.下面结合若干优选实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，以下实施例中采用的实施条件可以根据实际需要而做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件，所用试剂均可以从商业途径获得。虽然在本发明的实践或测试中还可以使用与本文描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，现在描述优选的方法和材料。除
非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属的领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。
52.在提供值的范围的情况下，应当理解，除非上下文另外清楚地指示，否则该范围的上限和下限之间的每个中间值(至下限的单位的十分之一)，和在所陈述的范围中的任何其他陈述的值或中间值被包括在本发明内。这些较小的范围的上限和下限可独立地被包括在所述较小的范围内，并且还被包括在本发明内，服从所陈述的范围中的任何特定的排除性限制。在陈述的范围包括限值之一或两者的情况下，排除所述包括的限值中的任一个或两者的范围也被包括在本发明中。
53.实施例一
54.一种人胎盘来源间充质干细胞分泌的细胞外囊泡的提取方法如下：
55.1)在实验前，将普通胎牛血清(fbs)在4℃条件下，120,000g离心18h，去除胎牛血清中的细胞外囊泡(evs)，并用0.22μm的针式滤器过滤，得到去除evs的胎牛血清(ev
‑
free fbs)；并使用上述ev
‑
free fbs配置无ev的完全培养基(包含10％的ev
‑
free fbs、1％的双抗、1％的谷氨酰胺，1％的非必须氨基酸，87％的dmem/f12培养基)，用于培养人胎盘来源间充质干细胞(hp
‑
mscs)；
56.2)当正常培养在75cm2细胞培养瓶中的hp
‑
mscs汇合度达到80％时，弃去旧培养基，加入10ml无ev的完全培养基，继续培养24h，随后收集该条件培养基用于梯度离心分离evs；
57.3)将收集的40ml含有hp
‑
mscs来源evs的条件培养基在500g离心10min，除去细胞碎片；收集上清，10,000g离心30min，去除直径较大的囊泡及凋亡小体；再次收集上清，移至超速离心管中100,000g离心70min，沉淀hp
‑
mscs来源evs；
58.4)弃上清，将管中的hp
‑
mscs来源evs用40ml无菌的pbs洗一次，100,000g离心120min，最终沉淀即为hp
‑
mscs来源evs(如附图5a示意图所示)；
59.5)hp
‑
mscs来源evs提取的所有步骤和整个过程均处于4℃无菌条件下；
60.6)通过bca蛋白定量试剂盒确认提取evs的蛋白浓度；并使用动态光散射仪确认提取evs的粒径分布，使用透射电子显微镜确认提取evs的形态特征。
61.实施例二
62.利用一氧化氮水凝胶培养人胎盘来源间充质干细胞，在其细胞外囊泡中负载内源性功能成分的方法如下：
63.1)将浓度为2μg/μl的一氧化氮水凝胶包被在75cm2细胞培养瓶的瓶底，置于37℃细胞培养箱中放置2h以上；
64.2)在包被了一氧化氮水凝胶的细胞培养瓶中培养hp
‑
mscs，并按照实施例1中的提取方法分离提取一氧化氮水凝胶上培养的hp
‑
mscs分泌的evs；
65.3)通过elisa及实时荧光定量pcr技术检测确认分离得到的evs中负载的内源性功能成分。
66.实施例三
67.通过共孵育在细胞外囊泡中负载外源性功能成分阿霉素的方法如下：
68.1)收集mda
‑
mb
‑
231细胞的条件培养基，按照实施例一中的提取方法分离提取mda
‑
mb
‑
231细胞分泌的evs；
69.2)在分离提取到的evs中加入1mmol/l的阿霉素(dox)，混合均匀后置于37℃细胞培养箱中孵育30min；
70.3)将共孵育后的evs/dox混合物移入超速离心管中，加入40ml无菌的pbs洗一次，100,000g离心120min，最终沉淀即为负载了dox的mda
‑
mb
‑
231细胞来源的evs；
71.4)通过检测dox在590nm波长的荧光信号来确认dox在evs中的负载效率。
72.实施例四
73.一种利用疏水插入法在细胞外囊泡上修饰特异性靶向p
‑
选择素的配体分子p
‑
选择素结合肽的方法如下：
74.1)合成p
‑
选择素结合肽(pbp)，其氨基酸序列为：cdaewvdvs，分子量为1028da，纯度大于99％；
75.2)准备分子量大小为5kda的两亲性化合物二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇
‑
马来酰亚胺(dmpe
‑
peg
‑
mal)；
76.3)将30mg dmpe
‑
peg
‑
mal和30mg pbp溶解于2ml二甲基甲酰胺中；
77.4)用三乙胺将溶液ph调至8.0；
78.5)将反应体系置于n2环境中室温搅拌24h(反应式如附图2所示)，得到反应产物dmpe
‑
peg
‑
pbp(dpp)；
79.6)将反应产物置于截留分子量为3kda的透析袋中，用去离子水4℃搅拌透析3天，去除反应过程中引入的杂质；
80.7)将透析后的反应产物进行冻干，得到dpp粉末；
81.8)将0.5mg dpp粉末溶于150μl d2o中，待样品完全溶解后移至核磁管中，以氘代丙酮为内标，在25℃条件下进行核磁共振一维氢谱检测，确认反应产物成分，结果显示反应产物中存在pbp所含吲哚环的特征峰(7.0
‑
7.6ppm区域)，表明按照上述实验步骤pbp被耦连在dmpe
‑
peg上合成了dpp(附图3)；
82.9)将3mg上述dpp(分子量为6028da)冻干粉末溶于1ml无菌pbs中得到浓度为500μm的dpp储存液；
83.10)在浓度为1μg/μl的evs溶液中按照100:1的比例加入dpp储存液，使dpp终浓度为5μm；
84.11)将上述体系混匀后在室温(25℃)下静置孵育30min；
85.12)将孵育后体系移入100kda超滤离心管中，13,000rpm室温离心20min去除未结合的dpp；
86.13)将离心后剩余液体及沉淀重悬于pbs中，得到pbp修饰的工程化evs(pbp
‑
evs)悬液(附图4和附图5b示意图所示)。
87.实施例五
88.一种在细胞外囊泡上标记分子成像造影剂荧光素酶的方法如下：
89.1)包装表达gaussia荧光素酶(gluc)
‑
乳粘素(lactadherin)融合蛋白(gluc
‑
lac)的慢病毒：
90.①
在包装病毒前一天，接种1
×
106个293t细胞于10cm的细胞培养皿中；
91.②
将45μl lipo2000轻柔滴加到1.5ml opti
‑
mem培养基中，上下颠倒混合均匀，室温孵育5min；同时将9μg目的基因质粒plv
‑
gluc
‑
lac及包装质粒pmdlg/prre(4.5μg)、prsv
‑
rev(1.8μg)及pmd2.g(2.7μg)加入另外1.5ml opti
‑
mem培养基中，轻轻吹打混匀；将上述质粒溶液轻柔滴加入lipo2000溶液中，轻柔颠倒混匀，避免用移液枪吹吸，室温孵育20min，得到质粒与lipo 2000混合物；
92.③
取出提前一天铺好的293t细胞，弃去旧培养基，轻柔加入5ml无双抗的培养基，并将上述质粒与lipo 2000混合物轻柔滴加入培养基中，混匀；整个过程需保持轻柔，防止293t细胞从培养皿底脱落；
93.④
在37℃细胞培养箱中孵育12h后，弃去含有质粒的培养基，在293t细胞中加入10ml新鲜的dmem完全培养基，置于37℃，5％co2、饱和湿度的细胞培养箱中继续培养48h；
94.⑤
收集含有病毒颗粒的293t培养基，移至离心管中，1,300rpm离心5min除去细胞碎片，得到含有表达gluc
‑
lac的病毒颗粒的病毒液；
95.2)制备稳定表达gluc
‑
lac的ev供体细胞：
96.①
准备细胞汇合度为50％的hp
‑
mscs于六孔板中，弃去旧培养基并加入1ml无双抗的培养基，随后加入1ml上述含有病毒颗粒的培养基及2μl浓度为8mg/ml的polybrene，轻轻混匀；
97.②
用封口膜密封孔板，置于离心机中，1,600rpm 37℃离心60min，随后去除封口膜，将孔板置于培养箱中孵育3
‑
6h；
98.③
弃去含有病毒颗粒的培养基，更换为新鲜的完全培养基置于细胞培养箱中继续培养，并随时观察细胞状态；
99.④
继续培养48h后，在细胞中加入2μg/ml的嘌呤霉素进行筛选；设置野生细胞加入等量的嘌呤霉素作为对照，待野生细胞全部死亡后，剩余转染后细胞则为稳定表达gluc
‑
lac的hp
‑
mscs；
100.3)分离提取荧光素酶gluc标记的evs：
101.①
将上述稳定表达gluc
‑
lac的hp
‑
mscs培养于75cm2细胞培养瓶中；
102.②
按照实施例一中的实验方法分离提取其条件培养基中的evs，得到的evs即为荧光素酶gluc标记的evs；
103.4)按照实施例四中的方法，在浓度为1μg/μl的gluc标记的evs中加入工作浓度为5μm的dpp，室温孵育30min，随后通过超滤离心将游离dpp洗去，并用pbs重悬，得到荧光素酶gluc标记的pbp
‑
evs(如附图5c示意图所示)。
104.实施例六
105.在靶向p
‑
选择素的配体分子上标记分子成像造影剂荧光染料的方法如下：
106.1)合成荧光染料cy5.5标记的dpp：
107.①
将1mg cy5.5
‑
nhs粉末溶于39.23μl dmso中得到cy5.5
‑
nhs溶液；
108.②
将4mg dpp粉末溶于162μl去离子水中得到dpp溶液，并用1mnahco3调节ph至8.5；
109.③
在dpp溶液中加入19.5μl cy5.5
‑
nhs溶液，于4℃条件下搅拌反应24h得到反应产物cy5.5标记的dpp(cy5.5
‑
dpp)；
110.④
将反应产物加入截留分子量为3kda的透析袋中，用去离子水4℃搅拌透析3天，冻干后得到cy5.5
‑
dpp粉末；
111.2)按照实施例四中实验方法，将5μm的cy5.5
‑
dpp与浓度为1μg/μl的evs室温孵育
30min，通过超滤离心管去除未结合的dpp，重悬后得到荧光染料cy5.5标记的pbp
‑
evs(如附图5d示意图所示)。
112.实施例七
113.鉴定表征pbp
‑
evs的方法
114.1.流式细胞仪检测cy5.5标记的pbp
‑
evs的标记效率
115.1)在1.5ml ep管中加入200μl浓度为1μg/μl的evs样品，随后在管中加入2μl浓度为500μm的cy5.5
‑
dpp储存液，室温孵育30min；随后通过超滤离心将游离cy5.5标记的dpp洗去，并用100μl pbs将剩余液体及沉淀重悬，得到cy5.5标记的pbp
‑
evs；
116.2)以未修饰evs作为空白对照，在apc通道下对cy5.5标记的pbp
‑
evs进行流式检测；结果显示cy5.5标记的pbp
‑
evs的标记效率约为98.6％左右(附图6a)。
117.2.纳米粒径电位分析仪检测pbp
‑
evs粒径分布
118.1)在1.5ml ep管中加入300μl浓度为0.1μg/μl的evs样品，随后在管中加入3μl浓度为500μm的dpp储存液，室温孵育30min；
119.2)随后通过超滤离心将游离dpp洗去，并用1ml pbs重悬，得到pbp
‑
evs样品，置于冰上；
120.3)用0.2μm滤膜对样品除尘后，加入纳米粒径电位分析仪样品杯中，对evs及pbp
‑
evs样品粒径进行测定，结果显示未经修饰的evs与pbp
‑
evs的粒径主要分布在30
‑
200nm之间，evs粒径分布的峰值(78.81nm)在经过pbp工程化改造后稍向右移动，约为97.33nm左右(附图6b)。
121.3.纳米粒径电位分析仪检测pbp
‑
evs膜电位
122.1)在1.5ml ep管中加入300μl浓度为1μg/μl的evs样品，随后在管中加入3μl浓度为500μm的dpp储存液，室温孵育30min；
123.2)随后通过超滤离心将游离dpp洗去，并用0.5ml pbs重悬，得到pbp
‑
evs样品，置于冰上；
124.3)将evs及dpp
‑
evs样品加入u形样品杯中，插入纳米粒径电位分析仪样品槽中，对evs及pbp
‑
evs样品zeta电位进行测定，结果表明dpp修饰并未改变evs的膜电位，pbp
‑
evs与evs膜电位均带负电(附图6c)。
125.4.透射电镜检测pbp
‑
evs形态
126.1)在1.5ml ep管中加入200μl浓度为1μg/μl的evs样品，随后在管中加入2μl浓度为500μm的dpp储存液，室温孵育30min；随后通过超滤离心将游离dpp洗去，并用100μl pbs将pbp
‑
evs重悬，得到pbp
‑
evs样品，置于冰上；
127.2)将带有碳支持膜的200目铜网置于一张封口膜上，吸取10μl的evs或pbp
‑
evs样品滴于铜网上，室温静置5min，用滤纸从液滴边缘吸去多余液体；
128.3)在载有evs和pbp
‑
evs样品的铜网上滴加2％磷钨酸染液，染色1min，用滤纸吸干多余染液，室温晾干后于透射电子显微镜下观察，evs与pbp
‑
evs的透射电镜(tem)图片显示，pbp
‑
evs具有与evs一样的形态结构，均为经典的杯状囊泡结构(附图6d)。
129.5.蛋白免疫印迹实验鉴定pbp
‑
evs标志蛋白
130.1)在1.5ml ep管中加入200μl浓度为1μg/μl的evs样品，随后在管中加入2μl浓度为500μm的dpp储存液，室温孵育30min；随后通过超滤离心将游离dpp洗去，并用100μl pbs
将pbp
‑
evs重悬，得到pbp
‑
evs样品，置于冰上；
131.2)利用bca法测定hp
‑
msc裂解液、evs及pbp
‑
evs浓度，加入sds
‑
page上样缓冲液沸水浴10min，制备为hp
‑
msc裂解液、evs及pbp
‑
evs蛋白样品，并通过蛋白免疫印迹实验对hp
‑
msc裂解液、evs及pbp
‑
evs中的ev标志蛋白alix、tsg101和cd63进行检测，pbp
‑
evs中的蛋白组份与evs相似，pbp
‑
evs仍富含ev标志蛋白(附图6e)。
132.实施例八
133.检测pbp
‑
evs稳定性的方法：
134.1)在1.5ml ep管中加入200μl浓度为1μg/μl的evs样品，随后在管中加入2μl浓度为500μm的cy5.5标记的dpp储存液，室温孵育30min；随后通过超滤离心将游离cy5.5标记的dpp洗去，并用100μl pbs将cy5.5标记的pbp
‑
evs重悬，得到cy5.5标记的pbp
‑
evs样品；
135.2)将制备好的cy5.5标记的pbp
‑
evs样品静置于4℃，分别保存1、3、7天后，以未修饰evs作为空白对照，在apc通道下对各组evs样品进行流式检测；结果显示在4℃存放一周的pbp
‑
evs仍能保持99％左右的cy5.5阳性率，表明pbp
‑
evs在4℃环境中可以稳定保存1周以上的时间(附图7)。
136.实施例九
137.两种检测pbp
‑
evs靶向损伤内皮细胞能力的方法
138.1.gluc生物发光检测pbp
‑
evs对损伤内皮细胞的靶向能力
139.1)按照实施例五所述的实验方法制备gluc标记的pbp
‑
evs，gluc
‑
evs作为对照，置于4℃保存备用；
140.2)将人脐静脉内皮细胞(huvecs)接种于24孔板中，当细胞汇合度到60％左右时，将其中3个孔的细胞进行缺氧6h/复氧12h(h/r)损伤处理，诱导huvecs表达p
‑
选择素；另外3孔细胞正常培养；
141.3)给每孔细胞更换500μl新鲜培养基，并在2孔正常培养和2孔h/r损伤处理的huvecs中各加入100μg/ml的gluc标记的evs和pbp
‑
evs；其余1孔正常培养和1孔h/r损伤处理的huvecs中加入等体积pbs作为对照，置于37℃细胞培养箱中继续培养2h；
142.4)用pbs将未结合的gluc标记的evs及pbp
‑
evs洗去，每孔细胞中加入500μl pbs及100ng/ml腔肠素，立即置于小动物成像仪中进行生物发光成像，并通过gluc信号强度量化各孔中内化的evs及pbp
‑
evs，结果表明pbp
‑
evs可以识别血管内皮细胞表面的p
‑
选择素，更多地结合、进入h/r损伤的huvecs中，对损伤后高表达p
‑
选择素的内皮细胞显示出明显的靶向性(附图8)。
143.2.cy5.5荧光成像检测pbp
‑
ev对损伤内皮细胞的靶向能力
144.1)按照实施例六所述的实验方法,在2个1.5ml ep管中各加入200μl浓度为1μg/μl的evs样品，随后在其中一个管中加入2μl浓度为500μm的cy5.5
‑
dpp储存液，另一个管中加入2μl浓度为500μm的dmpe
‑
peg
‑
cy5.5储存液，室温孵育30min；随后通过超滤离心将游离cy5.5
‑
dpp和dmpe
‑
peg
‑
cy5.5洗去，并用100μl pbs将2个管中evs样品重悬，得到cy5.5标记的evs和pbp
‑
evs样品，4℃闭光保存备用；
145.2)将细胞爬片铺于24孔板中，并接种huvecs，当细胞汇合度到60％左右时，将其中3个孔的细胞进行h/r损伤处理，另外3孔细胞正常培养；
146.3)给每孔细胞更换500μl新鲜培养基，并在2孔正常培养和2孔h/r损伤处理的
huvecs培养基中各加入50μl制备好的cy5.5标记的evs或pbp
‑
evs(终浓度为100μg/ml)，其余2孔细胞中加入等体积pbs作为对照，置于37℃细胞培养箱中继续培养2h；
147.4)随后用pbs将未结合的cy5.5标记的evs及pbp
‑
evs洗去，加入500μl 4％多聚甲醛室温固定10min，pbs洗2次；接着加入200μl浓度为1％的tritonx
‑
100进行破膜，室温孵育10min；
148.5)将细胞爬片取出至于载玻片上，在爬片上滴加10μl配制好的alexa fluor 488
‑
鬼笔环肽(1:500稀释)和dapi(1:2000稀释)复染液，室温染色30min；
149.6)pbs洗去多余染液，滴加抗荧光衰减封片剂封片，用激光共聚焦扫描显微镜采集图片，共聚焦图片显示，与其他处理组相比，h/r损伤的huvecs内化了大量的pbp
‑
evs，表明pbp
‑
evs对损伤内皮细胞具有出色的靶向能力，pbp
‑
evs可以通过高表达的p
‑
选择素粘附在损伤内皮细胞上并被其吞噬内化(附图9)。
150.实施例十
151.以小鼠单侧肾缺血再灌注损伤为例，提供两种检测pbp
‑
evs靶向内皮损伤组织能力的方法。
152.1.建立小鼠单侧肾缺血再灌注损伤(iri)模型
153.1)腹腔注射2.5％的阿佛丁(240mg/kg)麻醉小鼠，在小鼠眼球涂抹眼药膏使其保持湿润，同时脱净小鼠背部手术区域毛发，用碘伏消毒；
154.2)在小鼠背部左侧肾脏区域皮肤做一纵向切口，并切开腹膜，顿性分离肾后脂肪组织，暴露左侧肾脏；
155.3)用眼科镊分离肾蒂周围结缔组织，暴露肾动静脉，用显微血管夹夹闭肾动静脉造成损伤缺血，肾脏变成紫黑色，缺血45min后松开血管夹，肾脏在1min内恢复红色，表明再灌注完成；
156.4)使用6
‑
0缝合线将腹膜及皮肤依次缝合，将动物置于笼中，置于加热垫上直至苏醒；
157.5)将iri小鼠随机分入pbs组和evs治疗组，仅在肾脏区域皮肤及腹膜做切口并缝合，未缺血再灌注损伤的小鼠作为假手术组(sham)；
158.6)在iri后前3天，对两组小鼠分别通过尾静脉连续3次注射100μg/200μl evs或pbp
‑
evs，注射等体积pbs作为对照。
159.2.gluc生物发光成像检测pbp
‑
evs对缺血再灌注损伤肾脏的靶向能力
160.1)在小鼠肾缺血再灌注12h后，通过尾静脉注射100μg gluc标记的evs或pbp
‑
evs；
161.2)在注射后2、6、12、24h，分别对两组小鼠进行gluc活体成像，成像前首先开启并初始化小动物活体成像系统；同时腹腔注射阿佛丁(240mg/kg)麻醉小鼠；
162.3)腹腔注射gluc底物腔肠素(5mg/kg)后，立即将小鼠置于小动物成像仪仓内，使小鼠呈俯卧位并调整小鼠位置，随后进行生物发光成像，采集图片，并多次成像直至信号开始减弱；
163.4)在相应时间点，均按照此步骤对小鼠进行生物发光成像，并使用living image软件对图像进行分析处理。
164.5)结果如附图10所示，evs经尾静脉注射后，损伤肾脏区域的gluc信号在注射后6h达到峰值，然后逐渐下降；而注射pbp
‑
evs组小鼠损伤肾脏区域的gluc信号在注射后逐渐升
高，直到12h时达到峰值，且在注射后6
‑
24h内信号强度均高于evs注射组，反应出pbp
‑
evs具有良好的损伤肾脏靶向能力。
165.3.cy5.5荧光成像检测pbp
‑
evs对缺血再灌注损伤肾脏的靶向能力
166.1)在小鼠肾缺血再灌注12h后，通过尾静脉注射100μg cy5.5标记的evs或pbp
‑
evs；
167.2)在对应时间点，腹腔注射过量阿佛丁深度麻醉小鼠，用40ml预冷pbs进行灌注，去除循环中游离的evs和pbp
‑
evs；将损伤侧肾脏及其他主要器官取出，浸没于4％多聚甲醛中固定；
168.3)待获得所有标本后，打开并初始化imaging system ivis lumina成像系统，将待检测的器官置于小动物成像仪中进行荧光成像，激发光选择640nm，发射光选择cy5.5，采集图片并用living image软件进行分析处理。
169.4)结果显示在注射后6、12、24h，pbp
‑
evs注射组损伤肾脏的cy5.5信号强度均高于evs组(附图11)，表明pbp
‑
evs可以靶向损伤肾脏，特异性富集在损伤肾脏中。
170.实施例十一
171.以不同程度的单侧肾脏缺血再灌注损伤为例，提供一种pbp
‑
evs在诊断、治疗缺血再灌注肾损伤中的应用。
172.1.建立不同损伤程度的单侧肾缺血再灌注损伤(iri)模型
173.建立不同损伤程度的单侧肾iri模型具体步骤如实施例十所述，通过夹闭小鼠左侧肾脏动静脉使肾脏缺血不同时间并再灌注，得到不同损伤程度的小鼠单侧肾iri模型；其中单侧肾脏缺血15min/再灌注为轻度iri模型，缺血30min/再灌注为中度iri模型，缺血45min/再灌注为重度iri模型。
174.2.gluc标记的pbp
‑
evs通过生物发光成像诊断肾缺血再灌注损伤程度
175.1)建立三种不同程度肾损伤(轻度iri、中度iri和重度iri)小鼠模型，再灌注12h后，分别经尾静脉注射100μg gluc标记的evs或pbp
‑
evs；
176.2)注射12h后，通过生物发光成像检测2组小鼠损伤肾脏区域gluc信号强度，成像前首先开启并初始化小动物活体成像系统；同时腹腔注射阿佛丁(240mg/kg)麻醉小鼠；
177.3)腹腔注射gluc底物腔肠素(5mg/kg)后，立即将小鼠置于小动物成像仪仓内，使小鼠呈俯卧位并调整小鼠位置，随后进行生物发光成像，采集图片，并多次成像直至信号开始减弱；
178.4)在相应时间点，均按照此步骤对小鼠进行生物发光成像，并使用living image软件对图像进行分析处理。
179.5)gluc成像结果显示，在随着肾脏损伤程度的加重，pbp
‑
evs在损伤肾脏中的累积量增加，并释放出与损伤程度呈正相关的gluc信号；而evs注射组中，仅有重度肾损伤小鼠损伤肾脏区域出现gluc信号增强(附图12)。结果表明，通过在pbp
‑
evs上负载分子成像造影剂，可以通过检测累积在损伤肾脏内pbp
‑
evs的造影剂信号强度来判断肾脏损伤程度，为早期诊断急性肾损伤提供参考指标。
180.3.pbp
‑
evs促进重度缺血再灌注损伤肾脏功能及结构的修复
181.1)建立重度iri肾损伤模型，在再灌注12h后，经尾静脉注射100μg evs或pbp
‑
evs，pbs作为对照；
182.2)重度iri后第3天和第7天，取小鼠血清样品，并检测其中肌酐和尿素氮含量，结果表明损伤后第3天血清中肌酐和尿素氮水平急剧升高随后略有所下降；evs治疗可以降低重度iri小鼠血清中肌酐和尿素氮水平；经pbp
‑
evs靶向治疗后，重度iri小鼠血清肌酐和尿素氮水平显著下降(附图13a)，表明pbp
‑
evs促进了损伤肾脏功能的修复；
183.3)对重度iri后第3天肾脏组织切片进行苏木素&伊红(h&e)染色，观察损伤肾脏结构修复情况。组织切片染色结果显示，在重度iri后，肾脏中大量肾小管损伤坏死，表现为大量的蛋白管型和刷状缘脱落；经evs治疗后，蛋白管型和刷状缘脱落数量有所减少；在pbp
‑
evs治疗后，仅有少部分肾小管表现为损伤状态(附图13b
‑
c)，表明pbp
‑
evs促进了损伤肾脏结构的修复。
184.因此，本发明采用上述一种靶向p
‑
选择素的工程化细胞外囊泡组合物及其制备方法和应用，工程化细胞外囊泡以p
‑
选择素作为靶点靶向损伤内皮细胞，实现了靶向内皮细胞损伤相关疾病的目的，填补了现有技术中没有可通用的靶向诊疗损伤内皮相关疾病的技术手段的空白，可广泛应用于多种内皮细胞损伤相关疾病的诊断、治疗中。
185.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。