一种癌症透析芯片的制作方法

1.本发明属于生物医学工程领域，具体是一种癌症透析芯片。


背景技术：

2.在生物医学工程中，实体肿瘤包含了固定在组织的肿瘤细胞和在体液里的移动肿瘤细胞；绝大部分的移动肿瘤细胞是以循环肿瘤细胞的形式在血液里流动循环，且其数量极少；循环肿瘤细胞是转移过程一个重要的媒介，这群细胞从原发肿瘤位置脱落进入血管，经过一定时间的循环后可在远方侵入新的组织，形成一个新的转移灶；因此，如何选择性地杀死血液内的循环肿瘤细胞来阻止转移的发生是临床肿瘤学的一个难题。
3.一个可针对循环肿瘤细胞的治疗方法必须符合几个条件。第一，此方法需要在合理的时间范围内处理大量的血液容量(人类大约有5l的血液)。第二，如同肾透析，此方法应可以连续性且长时间地处理血液，不会因为处理时间而导致治疗效率降低。第三，此方法应可以捕获或杀死不同表型的循环肿瘤细胞。最后，此方法不应该有严重的副作用；
4.目前最常见的癌症治疗方法如手术和放射治疗均只能杀死实体肿瘤，无法对循环肿瘤细胞起任何效果；化疗虽然可以杀死循环肿瘤细胞，但是化疗也会对正常细胞有影响，因此副作用较大；
5.体外分离循环肿瘤细胞是一种具有可行性的循环肿瘤细胞治疗方案；这种技术旨在将血液抽出并泵入一个可以捕获或杀死循环肿瘤细胞的体外装置，一旦肿瘤细胞被处理后，剩下的血液将返回病人体内；现有的体外分离循环肿瘤细胞技术主要是用表面修饰epcam抗体的某种捕获装置，当血液中的循环肿瘤细胞经过这些抗体时会与抗体发生相互作用，从而将循环肿瘤细胞捕获在装置的表面，其余的血细胞不会有影响；这种技术存在的问题是只能捕获上皮循环肿瘤细胞表型，会有高达50％的间充质和混合表型的循环肿瘤细胞无法被捕获；此外，现有技术中所使用的流速都比较慢，一般在于1ml/min的范围；倘若应用在人体上，所需的处理时间将会超过一天。


技术实现要素：

6.(一)产品的用途
7.针对现有技术的不足，本发明提供了一种癌症透析芯片，以高通量(流速为10ml/min)与连续性地从血液分离不同表型的循环肿瘤细胞，并且将无肿瘤细胞的血液返回体内。
8.(二)技术方案
9.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
10.一种癌症透析芯片，包括：
11.该透析芯片上设有四组入口和两组出口，分别为血液入口、磁珠入口、两组缓冲液入口、血液出口以及磁珠出口；
12.该透析芯片由两个单元组成，分别为微混合器单元和确定性侧向位移单元；
13.所述微混合器单元设有两个入口，用于将血液和磁珠溶液以10ml/min的流速打入透析芯片，且微混合器单元是由七个环形且带有突出物的混合单元组成，并且七个混合单元的排列方式为非对称式上下颠倒；
14.所述确定性侧向位移单元与微混合器单元的末端连接，且确定性侧向位移单元设有两个入口和两个出口，分别是两个以磷酸盐缓冲盐溶液为缓冲液的缓冲液入口，一个血液出口和一个磁珠出口；缓冲液是以14ml/min的流速进入透析芯片，所述确定性侧向位移单元可分成两个区域；第一个区域是将细胞
‑
磁珠复合体和磁珠从血液里往上或下位移的分离区域；第二个区域是用于阻挡磁珠进入血液出口的过滤区域。
15.进一步的，所述非对称上下颠倒即下一个混合单元是上一个单元的上下颠倒。
16.进一步的，每个所述混合单元可分成400微米宽的主要通道和200微米宽的次要通道，每个通道里都设有3个突出物。
17.进一步的，所述主要通道内的突出物高度和宽度分别为200微米和100微米，而次要通道内的突出物则分别为100微米和50微米。
18.进一步的，所述确定性侧向位移单元内的第一个区域设有若干个长度为52微米的等边三角形微柱，每行共有9个微柱，并以20行9列微柱为一组重复20遍；两行微柱之间的距离为80微米，并且每一行连续两个微柱中心点的距离为16微米；
19.基于上述设计参数，所述确定性侧向位移单元的临界直径是30微米。
20.进一步的，所述确定性侧向位移单元内的第二个区域是由多个椭圆形的微柱形成捕获单元，其中捕获单元的开口大小为70微米，两个捕获单元之间的纵横距离分别为110微米和220微米，过滤区域中最小的距离为35微米。
21.进一步的，配合所述透析芯片使用的是经过核酸适配体修饰的磁珠，具体为：50微米链霉亲和素化磁珠，通过链霉亲和素和生物素的相互作用，将epcam核酸适配体和csv核酸适配体修饰在磁珠上；
22.细胞的释放则是通过加入对应两个核酸适配体的互补序列；该互补序列与核酸适配体的亲和力更强，因此核酸适配体在有互补序列的情况下会优先与互补序列结合，从而释放已捕获的肿瘤细胞。
23.该透析芯片的制备步骤为：
24.s1、使用autocad软件绘制透析芯片的设计图；
25.s2、通过光刻法刻制透析芯片模具，其高度为80微米；
26.s3、选择聚二甲基硅氧烷材料，以5：1的比例摄取聚二甲基硅氧烷材料和其固化剂，并混合均匀；
27.s4、放入真空干燥器内，抽空45分钟至气泡消失，随后将其倒入模具并在80℃的温度下固化2小时；
28.s5、将固化好的聚二甲基硅氧烷芯片进行切割，使用5mm打孔器在出入口打孔，之后使用等离子清洗仪清洗芯片和玻片，将芯片结合在玻片上；
29.s6、在80℃的温度下固化已结合好的透析芯片20分钟；
30.s7、在出入口插入l形的不锈钢管，并在不锈钢管周围涂抹未固化的聚二甲基硅氧烷材料；
31.s8、将透析芯片放入200℃烤箱固化24小时，将不锈钢管周围的聚二甲基硅氧烷材
料固体化和强化芯片整体的强度。
32.(三)有益效果
33.一是，本发明采用用于捕获循环肿瘤细胞的磁珠
‑
核酸适配体方法，磁珠的表面上将会被修饰核酸适配体，当肿瘤细胞与磁珠
‑
核酸适配体复合物接触时，肿瘤细胞表面的蛋白将与核酸适配体发生相互反应并结合，从而把肿瘤细胞捕获在磁珠表面上；
34.二是，本发明采用微流控微混合器单元，该单元是一种可以将两种液体快速混合的微流控技术，而在此产品中微混合器的目的是为了将血液和磁珠
‑
核酸适配体溶液快速混合均匀，增加循环肿瘤细胞和磁珠接触的概率，从而增加肿瘤细胞被捕获的效率；
35.此微混合器结合了3种不同的混合机制：i)曲线微结构产生的迪恩力、ii)不对称分裂与重合流体和iii)通道阻碍物；
36.三是，本发明采用确定性侧向位移微流控单元，该单元是一种可以分离不同大小粒子的微流控技术，通过微柱子的错位排放可以使得大于临界直径的粒子被分离，即往上或往下流动；而小于临界直径的粒子则以直线的轨迹流动，从而达到分离的效果。
附图说明
37.图1是本发明中癌症透析芯片的工作原理图；
38.(a)为癌症透析芯片的设计和(b)磁珠
‑
核酸适配体的捕获与释放原理。
39.图2是本发明中细胞和复合体移动轨迹示意图；
40.(a)循环肿瘤细胞和(b)肿瘤细胞
‑
磁珠复合体在癌症透析芯片确定性侧向位移单元里的轨迹。
41.图3是本发明的癌症透析芯片在(a)1
×
102、(b)1
×
103和(c)1
×
104细胞/ml浓度下不同处理次数的累积移除效率示意图。
42.图4是本发明的癌症透析芯片在不同处理次数下的百分比示意图；
43.(a)磁珠碎片百分比，(b)血液出口的完整磁珠百分比和(c)血细胞流失百分比；注：第一行为随着处理次数的累积，第二行为每次处理所得到的百分比；
44.图5是本发明的红白细胞对比图和显微照；
45.癌症透析芯片在不同处理次数对(a)血细胞活性的影响和(b)处理后红细胞和白细胞的显微照(箭头为活的白细胞，圆圈的为死的白细胞)；
46.图6是本发明中光谱、血浆照片以及癌症透析芯片在不同处理次数对红细胞溶血的影响示意图；
47.a)经过癌症透析芯片不同处理次数血浆的吸收光谱；(b)不同处理次数的血浆照片；(c)癌症透析芯片在不同处理次数对红细胞溶血的影响。
48.附图标记：1、血液入口；2、磁珠入口；3、缓冲液入口；4、血液出口；5、磁珠出口。
具体实施方式
49.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下文为了描述方便，所引用的“上”、“下”、“左”、
“
右”等于附图本身的上、下、左、右等方向一致，下文中的“第一”、“第二”等为描述上加以区分，并没有其他特殊含义。
50.针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种癌症透析芯片，包括：
51.该透析芯片上设有四组入口和两组出口，分别为血液入口1、磁珠入口2、两组缓冲液入口3、血液出口4以及磁珠出口5(上述内容可参照图1a)；
52.该透析芯片由两个单元组成，分别为微混合器单元和确定性侧向位移单元；
53.微混合器单元设有两个入口，用于将血液和磁珠溶液以10ml/min的流速打入透析芯片，且微混合器单元是由七个环形且带有突出物的混合单元组成，并且七个混合单元的排列方式为非对称式上下颠倒；
54.上述的非对称上下颠倒即下一个混合单元是上一个单元的上下颠倒；
55.癌症透析的工作原理见图1；
56.带有循环肿瘤细胞的血液和磁珠
‑
核酸适配体溶液将分别以10ml/min的流速从血液入口和磁珠入口进入癌症透析芯片，而pbs为缓冲液则以14ml/min的流速从缓冲液入口进入芯片；血液和磁珠
‑
核酸适配体通过微混合器单元时将会被快速混合均匀，当肿瘤细胞与磁珠
‑
核酸适配体碰撞时，肿瘤细胞的表面蛋白将和核酸适配体发生相互作用而导致肿瘤细胞被吸附在磁珠表面上；除了捕获肿瘤细胞之外，磁珠
‑
核酸适配体的第二个功能是将肿瘤细胞的尺寸放大；由于使用50微米的磁珠，肿瘤细胞被捕获后形成的细胞
‑
磁珠复合体的大小将大于50微米，同时这个尺寸也是大于确定性侧向位移单元的临界值经，因此细胞
‑
磁珠复合体将会被位移；混合均匀后的血液将进入确定性侧向位移单元。在这个单元里血细胞因为尺寸小于临界值经所以会持续往前流动，直到血液出口；反观肿瘤细胞
‑
磁珠复合体将会被位移至芯片的外墙，最后从磁珠出口流出。
57.确定性侧向位移单元与微混合器单元的末端连接，且确定性侧向位移单元设有两个入口和两个出口，分别是两个以磷酸盐缓冲盐溶液为缓冲液的缓冲液入口，一个血液出口和一个磁珠出口；缓冲液是以14ml/min的流速进入透析芯片，确定性侧向位移单元可分成两个区域；第一个区域是将细胞
‑
磁珠复合体和磁珠从血液里往上或下位移的分离区域；第二个区域是用于阻挡磁珠进入血液出口的过滤区域。
58.如见图1a，上述提到每个混合单元可分成400微米宽的主要通道和200微米宽的次要通道，每个通道里都设有3个突出物；主要通道内的突出物高度和宽度分别为200微米和100微米，而次要通道内的突出物则分别为100微米和50微米。
59.确定性侧向位移单元内的第一个区域设有若干个长度为52微米的等边三角形微柱，每行共有9个微柱，并以20行9列微柱为一组重复20遍；两行微柱之间的距离为80微米，并且每一行连续两个微柱中心点的距离为16微米；
60.基于上述设计参数，确定性侧向位移单元的临界直径是30微米。
61.确定性侧向位移单元内的第二个区域是由多个椭圆形的微柱形成捕获单元，其中捕获单元的开口大小为70微米，两个捕获单元之间的纵横距离分别为110微米和220微米，过滤区域中最小的距离为35微米。
62.配合透析芯片使用的是经过核酸适配体修饰的磁珠(图1b)，具体为：50微米链霉亲和素化磁珠，通过链霉亲和素和生物素的相互作用，将epcam核酸适配体(5
‘
至3’序列：
63.cactacagaggttgcgtctgtcccacgttgtcatggggggt
‑
teg
‑
biotin)和csv核酸适配体
(5
‘
至3’序列：
64.biotin
‑
cacgcatagcctttgctcctcgtctggaacgtcgcagctttagttctgggcctatgcgtg)修饰在磁珠上；
65.磁珠的功能化过程如下：
66.首先，使用te缓冲液(10mm tris
‑
hcl，1mm edta，ph 8.0，以超纯水为溶剂)将生物素化的epcam和csv核酸适配体调制成100μm；
67.之后使用折叠缓冲液(1mm mgcl2，以pbs为溶剂)将核酸适配体稀释至4μm，将稀释后的核酸适配体放入恒温水浴锅里加热10分钟至90℃，之后让其冷却15分钟至大约25℃室温；
68.准备1
×
106个50微米链霉亲和素化磁珠，使用20微米不锈钢细胞过筛器将小于20微米的碎片移除；剩余的磁珠将收集于一个离心管并以700g离心3分钟；使用400μl的磁珠缓冲液(10mm tris
‑
hcl，1mm edta，1m nacl，0.05％v/v tween
‑
20，ph 7.4，以超纯水为溶剂)重悬已过滤的磁珠，使用磁铁将和磁珠缓冲液洗涤磁珠3次；使用600μl的磁珠缓冲液重悬洗涤后的磁珠，加入已冷却完毕的核酸适配体，使用旋转混合仪将3个溶液混合均匀60分钟。多余的核酸适配体通过使用磁珠缓冲液洗涤磁珠
‑
核酸适配体溶液2次，
69.最后使用pbs将磁珠
‑
核酸适配体重悬至5
×
105磁珠/ml的浓度。
70.细胞的释放则是通过加入对应两个核酸适配体的互补序列；该互补序列与核酸适配体的亲和力更强，因此核酸适配体在有互补序列的情况下会优先与互补序列结合，从而释放已捕获的肿瘤细胞。
71.在具体的应用场景中，从图2的显微延时成像可见循环肿瘤细胞因为较小的尺寸而往前流动并穿越两个三角微柱之间(图2a)，而肿瘤细胞
‑
磁珠复合体则被三角微柱位移，无法穿越两个三角微柱之间(图2b)；
72.上述结果验证了确定性侧向位移单元只对细胞
‑
磁珠复合体的轨迹有影响，从而达到从血液分离循环肿瘤细胞的效果，剩余的血细胞则返回体内。
73.参照图3可得，在固定磁珠
‑
核酸适配体浓度为5
×
105磁珠/ml的情况下，分别在血液掺入1
×
102、1
×
103和1
×
104细胞/ml浓度，用于研究癌症透析芯片的肿瘤细胞移除效率与血液处理次数的关系；
74.此实验使用了3种胰腺癌细胞：i)aspc
‑
1、ii)miapaca
‑
2和iii)bxpc
‑
3，分别代表混合、间充质和上皮循环肿瘤细胞；
75.此产品的处理次数代表血液通过癌症透析芯片的次数，在每次处理中将会加入新的磁珠
‑
核酸适配体溶液；从图3可见，不同循环肿瘤细胞表型的移除效率随着处理次数增加。经过5次处理后，1
×
103和1
×
104细胞/ml浓度的平均移除效率分别为98.3
±
2.2％和8.1
±
0.8％(图3b和3c)，而在1
×
102细胞/ml浓度时的平均移除效率则为90.0
±
5.8％(图3a)，比在高浓度的情况下略低；
76.此结果表明此产品可以只用5次的处理就可以高效率地从血液移除不同表型的循环肿瘤细胞。
77.图4a表示癌症透析芯片在不同处理次数下的磁珠碎片百分比；在血液和磁珠出口的磁珠碎片率随着处理次数分别线性和指数性地增加，在5次处理后累积碎片率为1.60
±
0.79％和5.02
±
1.43％；在血液出口的磁珠碎片率比基线碎片率低，说明了确定性侧向位
移单元的过滤区域能有效地阻止碎片进入血液出口；图4b展示出现在血液出口的完整磁珠百分比，其中可见即使经过了5次的处理后进入血液出口的磁珠只有0.13
±
0.07％，此结果表明只有极少数的磁珠会流入血液出口进入体内；从血细胞的流失率而言，红细胞和白细胞的流失率均以线性随着处理次数增加，到第5次处理时流失率分别为2.25
±
0.35％和1.30
±
0.29％(图4c)。
78.除了可以移除循环肿瘤细胞，另一个重要的指标是对返回体内的血液的伤害；从图5a可见，癌症透析芯片对红细胞的活性没有影响，反而对白细胞的活性有少许影响，在第5次处理后白细胞的活性为86.5
±
3.8％；此外，从形貌而言红细胞仍然保持正常圆双凹的形貌，而具有活性的白细胞也呈现正常的圆形形貌；除了活性之外，溶血百分比也是测量对血液损害的重要指标之一；通过对每次处理后的血液进行10分钟700g的离心得到血浆，使用分光光度计测量血浆从300nm到800nm的吸收光谱(图6a)；
79.结果表明不同于在100％裂解血出现414nm、541nm和576nm的峰，经过癌症透析芯片处理的血浆没有出现明显的峰，与控制(即没有处理过的血)一致(图6a和6b)；
80.使用414nm峰值进行溶血的量化，图6c的结果表明此产品造成的溶血百分比会随着处理次数增加，最高溶血百分比值为4.29
±
2.32％，说明了此产品只会造成轻微溶血；
81.综上所述，此产品不会对返回体内的血液造成显著的伤害。
82.该透析芯片的制备步骤为：
83.s1、使用autocad软件绘制透析芯片的设计图；
84.s2、通过光刻法刻制透析芯片模具，其高度为80微米；
85.s3、选择聚二甲基硅氧烷材料，以5：1的比例摄取聚二甲基硅氧烷材料和其固化剂，并混合均匀；
86.s4、放入真空干燥器内，抽空45分钟至气泡消失，随后将其倒入模具并在80℃的温度下固化2小时；
87.s5、将固化好的聚二甲基硅氧烷芯片进行切割，使用5mm打孔器在出入口打孔，之后使用等离子清洗仪清洗芯片和玻片(清洗功率：120w，清理时间：20s)，将芯片结合在玻片上；
88.s6、在80℃的温度下固化已结合好的透析芯片20分钟；
89.s7、在出入口插入l形的不锈钢管(外径：0.7mm，内径：0.4mm)，并在不锈钢管周围涂抹未固化的聚二甲基硅氧烷材料；
90.s8、将透析芯片放入200℃烤箱固化24小时，将不锈钢管周围的聚二甲基硅氧烷材料固体化和强化芯片整体的强度。
91.以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。