一种猪源肺炎克雷伯菌检测试剂盒及应用的制作方法

1.本发明涉及动物病原分子诊断领域，具体涉及一种猪源肺炎克雷伯菌检测试剂盒及应用。


背景技术：

2.猪源肺炎克雷伯菌(klebsidla pneumoniae)属于肠杆菌科、克雷伯菌属的成员，是一类广泛分布于猪的皮肤、呼吸道、消化道等部位及环境中的重要条件致病菌。
3.目前，对猪肺炎克雷伯菌的检测方法多采用涂片镜检和细菌分离鉴定等细菌学检查方法及常规的免疫学方法，存在灵敏度和准确度较低，耗时较长等问题。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提供一种猪源肺炎克雷伯菌检测试剂盒及应用。
5.具体技术方案如下：
6.一种猪源肺炎克雷伯菌检测试剂盒，其不同之处在于，包括：
7.khe基因扩增引物对及探针；
8.其中，所述khe基因扩增引物对扩增的khe基因序列如seq.no.4所示。
9.进一步，所述khe基因扩增引物对的核苷酸序列如seq.no.1～seq.no.2所示。
10.进一步，所述探针的序列如seq.no.3所示，其5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。
11.进一步，所述荧光报告基团为fam基团，所述荧光淬灭基团为tamra基团。
12.进一步，还包括dntp、mg
2
溶液、dna酶混合液、阴性对照品、阳性对照品以及定量参考品。
13.进一步，所述dntp包括datp、dutp、dgtp和dctp。
14.进一步，所述dna酶混合液包括：酶稀释液、热启动taq酶和ung酶。
15.进一步，qpcr mix，2
×
qpcr mix包括dntp、mg
2
溶液、dna酶混合液。进一步，所述阴性对照品为te缓冲溶液。
16.进一步，所述阳性对照品为含seq.no.4所示的khe基因核苷酸片段的重组质粒，所述重组质粒由khe基因核苷酸片段通过同源重组的方法连接至puc载体制备而得；
17.所述定量参考品为1.0
×
106copies/μl的所述重组质粒、1.0
×
105copies/μl的所述重组质粒、1.0
×
104copies/μl的所述重组质粒和1.0
×
103copies/μl的所述重组质粒。
18.上述试剂盒在检测猪源肺炎克雷伯菌中的用途。
19.进一步，所述应用包括：将提取后的核酸样品、2
×
qpcr mix、所述扩增引物对、所述荧光探针配置成pcr体系，然后进行pcr扩增反应，根据扩增反应结果进行判断。
20.进一步，pcr反应体系如下表所示：
[0021][0022][0023]
进一步，pcr反应条件如下表所示：
[0024][0025]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0026]
(1)本发明试剂盒采用扩增引物对及探针对猪源肺炎克雷伯菌特异的khe基因进行检测，准确度高，灵敏度佳，特异性强，能与猪瘟病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒、猪伪狂犬病毒及猪圆环病毒进行区分，耗时时间短，且可在临床无症状时即可检出。
[0027]
(2)采用dutp代替了dttp，这样扩增产物是带有u碱基的双链dna，在ung酶存在时会被水解，因此可以减少扩增产物对pcr的污染。
[0028]
(3)dna酶混合液中的热启动taq酶和ung酶可以消除扩增产物残留、气溶胶污染等，该酶最佳活性温度为50℃，95℃变性失活，同热启动taq酶共同实现抑制假阳性效果。
[0029]
(4)在试剂盒的应用中，本发明将pcr反应退火温度控制在58℃，将扩增引物浓度控制在100～200nm，探针浓度控制在50～100nm能获得最佳的荧光信号。
附图说明
[0030]
图1为本发明实施例3所提供的灵敏性测试图谱；
[0031]
图2为本发明实施例4所提供的稳定性测试图谱。
具体实施方式
[0032]
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
[0033]
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
[0034]
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0035]
在本发明实施例中，所使用的原料均为常规市售产品。
[0036]
实施例1
[0037]
本实施例提供一种猪源肺炎克雷伯菌检测试剂盒，具体包括：
[0038]
khe基因扩增引物对、2
×
qpcr mix、探针、阳性对照品、阴性对照品以及定量参考品。
[0039]
在本实施例中2
×
qpcr mix(天根生化科技有限公司)为病毒荧光定量检测试剂盒试剂，含有dntp、mg
2
、酶稀释液、热启动taq酶和ung酶，dntp包括datp、dutp、dgtp和dctp四种脱氧核糖核苷。
[0040]
khe基因扩增引物对的上游引物序列如seq.no.1所示，命名为khef01；下游引物序列如seq.no.2所示，命名为khe r01；引物对扩增khe基因的片段序列如seq.no.4所示。探针引物序列如seq.no.3所示，其5’端连接fam荧光报告基团，3’端连接有tamra荧光淬灭基团，命名为khep01。
[0041]
阴性对照品为te缓冲溶液。
[0042]
定量参考品为1.0
×
106copies/μl的重组质粒、1.0
×
105copies/μl的重组质粒、1.0
×
104copies/μl的重组质粒和1.0
×
103copies/μl的重组质粒；重组质粒由如seq.no.4所示khe基因核苷酸片段通过同源重组的方法连接至puc载体制备而得，命名为puc
‑
khe，其中1.0
×
106copies/μl的puc
‑
khe可以用作阳性对照。
[0043]
实施例2
[0044]
本实施例提供实施例1的猪源肺炎克雷伯菌检测试剂盒使用方法，具体包括：
[0045]
(1)细菌培养：将患病动物进行剖检，取肺脏破碎后生理盐水悬浮，随后在普通营养琼脂培养基上培养。挑取培养基中典型菌落，将其接种于麦凯康培养基上，37℃厌氧培养18～24h。挑取粉红色的菌落，使用肉汤培养基进行富集培养。
[0046]
(2)核酸提取：采用商品化核酸提取试剂盒提取核酸，4℃备用。
[0047]
(3)按表1配制pcr反应体系(25μl体系)：
[0048]
表1 pcr反应体系
[0049][0050]
(4)加样：每个pcr反应管加入23μl混合液，按顺序分别加入阴性对照、阳性对照和被检样本2μl，反复吸打3～5次，瞬时离心。
[0051]
(5)上机扩增：将pcr反应管按顺序设置阴性对照、阳性对照以及被检样本，设置如表2所示的pcr反应条件。
[0052]
表2 pcr反应条件
[0053][0054]
设置运行反应程序，记录样品ct值与扩增曲线。
[0055]
(6)实验有效性判定：阴性对照无ct值或无典型s型扩增曲线，阳性对照ct值≤35且有典型s型扩增曲线，则此次实验有效。
[0056]
(7)实验结果判定：若被检样品结果无ct值或无典型s型扩增曲线，报告为猪源肺炎克雷伯菌核酸阴性；若被检样品结果ct值≤35且有典型s型扩增曲线，报告为猪源肺炎克雷伯菌核酸阳性。
[0057]
若被检样品结果ct值≥35且有典型s型扩增曲线，则为可疑，需进行复检，复检结果ct值≥35且有典型s型扩增曲线，报告为猪源肺炎克雷伯菌核酸阳性；复检结果若无ct值或无典型s型扩增曲线，则报告为猪源肺炎克雷伯菌核酸阴性。
[0058]
实施例3
[0059]
本实施例提供实施例1试剂盒的灵敏度测试，具体操作如下：
[0060]
将阳性对照品稀释成1.0
×
105copies/μl(编号为a)、1.0
×
104copies/μl(编号为b)、1.0
×
103copies/μl(编号为c)、1.0
×
102copies/μl(编号为d)、原阳性对照品(1.0
×
106copies/μl的puc
‑
khe)、阴性对照品按实施例2操作分别进行检测。
[0061]
检测结果如表3与图1所示。
[0062]
表3试剂盒灵敏度测试结果
[0063]
检测样品ct值rn阳性对照品18.792.524a23.292.459b26.742.236c31.331.816d37.230.979阴性对照品noct
‑
0.006
[0064]
从表3与图1可以看出，ct值随阳性对照品浓度的减小而增大，证明本试剂盒有很好的灵敏性。
[0065]
实施例5
[0066]
本实施例提供实施例1试剂盒稳定性测试，将1.5
×
104copies/μl按实施例2pcr的方法进行重复性操作，测试结果如表4及图2所示。
[0067]
表4稳定性测试结果
[0068] ct值rn样品重复124.501.910样品重复124.961.866样品重复124.961.869
[0069]
从表4及图2可以看出，本发明试剂盒有很好的稳定性。
[0070]
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。