CCNB1蛋白在制备高级别脑膜瘤预后评估试剂盒中的应用的制作方法

ccnb1蛋白在制备高级别脑膜瘤预后评估试剂盒中的应用
技术领域
1.本发明涉及医学生物检测技术领域，具体地说，是ccnb1蛋白的新的用途，具体为ccnb1蛋白在制备高级别脑膜瘤预后评估试剂盒中的应用。


背景技术：

2.脑膜瘤是目前最常见的原发性中枢神经系统肿瘤之一。虽然大多数脑膜瘤表现为良性，可以通过手术切除治愈，但仍有20％的患者出现了肿瘤复发或进展。侵袭性组织学特征(即以增殖和有丝分裂活性增强、细胞异型性增加、脑组织侵袭为特征的who ii、iii级肿瘤)是脑膜瘤复发的主要风险。高级别脑膜瘤仍面临着复发率高，致残率高等问题，严重影响患者临床预后和生存质量。
3.高级别脑膜瘤患者预后与某些临床因素相关，如发病年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、手术切除范围和分子标记物特征等。然而，经典的病理形态学方法仍是目前高级别脑膜瘤诊断、分类的主要方法，难以明确客观地反应肿瘤的生物学行为，更不能准确判断患者预后和指导术后临床治疗。本领域迫切需要寻找能区分高级别脑膜瘤分子亚型及准确判断患者预后的相关基因和/或蛋白，这方面的研究对临床治疗高级别脑膜瘤及预防肿瘤复发具有重要意义。
4.ccnb1(g2/mitotic
‑
specific cyclin
‑
b1，有丝分裂特异性细胞周期蛋白b1)蛋白是一种参与有丝分裂的调节蛋白，在调控细胞g2/m过渡期的细胞周期中发挥重要作用。ccnb1在多种恶性肿瘤组织中高表达，与肿瘤的增殖、侵袭、迁移有关。ccnb1作为cdk1最重要的催化介质，已被发现在许多人类癌症中异常激活和异常表达，包括食管鳞状细胞癌、喉鳞状细胞癌和结直肠癌。此外，ccnb1在头颈部癌中与抗凋亡和肿瘤抵抗有关，头颈部癌是最具侵袭性的癌症之一，在食管鳞状细胞癌、非小细胞肺癌和结直肠癌中触发肿瘤增殖并与预后不良有关。与正常硬脑膜组织及良性脑膜瘤相比，高级别脑膜瘤中ccnb1表达亦明显上调，较高的ccnb1蛋白水平与高级别脑膜瘤患者的较短无进展生存期有关。
5.目前尚无ccnb1蛋白应用于高级别脑膜瘤的文献报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供ccnb1蛋白的新用途，即作为预后评估标志物在制备高级别脑膜瘤(who ii、iii级脑膜瘤)预后评估试剂或预后评估试剂盒中的应用。
7.发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测ccnb1蛋白在高级别脑膜瘤组织中的相对表达量，能够判断高级别脑膜瘤患者的预后。基于ccnb1蛋白的相对表达量与高级别脑膜瘤的这种相关性，以该蛋白作为分子标记物对其表达量进行检测，可以用于指导高级别脑膜瘤患者的预后判断。
8.本发明的第一方面，提供ccnb1蛋白作为高级别脑膜瘤预后评估标志物的应用。
9.本发明的第二方面，提供ccnb1蛋白在制备高级别脑膜瘤预后评估试剂或试剂盒中的应用。
10.进一步的，所述的预后评估试剂或试剂盒检测生物样品中ccnb1蛋白的相对表达量。
11.进一步的，所述的生物样品选自：高级别脑膜瘤患者手术切除的肿瘤标本切片。
12.进一步的，所述的预后评估试剂盒包含检测生物样品中ccnb1蛋白相对表达量的试剂。
13.进一步的，所述的预后评估试剂或试剂盒采用免疫组化方法检测生物样品中ccnb1蛋白的相对表达量，当免疫组化评分高于3分时，记为高表达，高级别脑膜瘤术后易出现复发，预后较差。
14.本发明利用免疫组化技术、系统评分测定高级别脑膜瘤组织中ccnb1蛋白的表达水平，并结合术后随访信息，确定ccnb1蛋白表达水平与手术后高级别脑膜瘤患者预后存在相关性，肿瘤中ccnb1呈高表达的患者术后无进展生存时间明显短于低表达者。
15.进一步的，所述的检测生物样品中ccnb1蛋白相对表达量的试剂包括ccnb1蛋白抗体以及与ccnb1蛋白的定量检测相配套的试剂。
16.进一步的，所述的ccnb1蛋白抗体为单克隆或多克隆抗体。ccnb1蛋白抗体可通过抗体的常规制备方法进行制备，ccnb1单克隆抗体为商品化抗体(制备方法参见文献：chaudhuri s k,ghosh s,monoclonal antibody raised against human mitotic cyclin b1,identifies cyclin b
‑
like mitotic proteins in synchronized onion root meristem.[j].cell biol int,1997,21:159
‑
66.)
[0017]
更进一步的，所述的预后评估试剂或试剂盒是将ccnb1蛋白作为分子标记，利用ccnb1单克隆或多克隆抗体，以及免疫组化试剂，分析ccnb1蛋白在高级别脑膜瘤组织中的相对表达量，预测高级别脑膜瘤患者预后情况。
[0018]
进一步的，所述的免疫组化试剂包括二甲苯、乙醇、h2o2体积分数为3％的h2o2‑
甲醇液，1％bsa封闭液，dab显色试剂，苏木素和辣根过氧化物酶。通过免疫组化实验，能够通过染色强度和染色阳性细胞的个数对每个检测样本中的ccnb1蛋白的表达量进行直观分析。
[0019]
本发明的第三方面，提供一种高级别脑膜瘤预后评估试剂盒，所述的试剂盒包含检测生物样品中ccnb1蛋白相对表达量的试剂。
[0020]
进一步的，所述的预后评估试剂盒包含ccnb1蛋白抗体系统以及与ccnb1蛋白的定量检测相配套的试剂系统。
[0021]
本发明的第四方面，提供了一种利用如上所述的预后评估试剂盒进行高级别脑膜瘤预后评估方法，包括以下步骤：
[0022]
(a)利用试剂盒中的免疫组化实验试剂标记兔抗人igg，将高级别脑膜瘤组织切片进行免疫组化染色；
[0023]
(b)光镜下观察高级别脑膜瘤组织染色情况，对ccnb1蛋白抗体染色细胞的阳性率及肿瘤细胞胞核中ccnb1蛋白抗体染色的强度进行判读评分；
[0024]
具体为，显微镜下观察阳性染色，每个标本随即选择五个高倍镜视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞所占百分率。以细胞核内出现棕/黄色染色为阳性，按照染色的深浅，分为四个等级：无染色记为0分，浅黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分；以细胞核内出现棕/黄色染色的细胞为阳性细胞，计算100个细胞中的阳性细胞的数量，评分
标准为：无阳性细胞记为0分，阳性细胞比例＜5％记为1分，5％
‑
10％记为2分，≥10％记为3分。以染色深度积分乘以阳性率积分，即为该样本点中ccnb1蛋白在相应肿瘤组织中表达量的终积分。
[0025]
(c)根据综合评分判断ccnb1蛋白在高级别脑膜瘤中高表达或低表达。ccnb1蛋白在细胞核中染色的积分小于等于3分记为低表达，大于3分记为高表达。
[0026]
本发明的有益效果在于：
[0027]
1、本发明的ccnb1蛋白与高级别脑膜瘤相关性的发现为预测高级别脑膜瘤复发风险及患者术后的生存时间提供了一条全新的途径，对判断高级别脑膜瘤患者预后具有重要作用，对于高级别脑膜瘤患者术后监控及序贯治疗也具有重要的指导意义。当免疫组化评分高于3分时，高级别脑膜瘤易出现复发。
[0028]
2、就技术而言，ccnb1蛋白的表达量的检测实质上是肿瘤组织切片的免疫组化定量检测，具有操作简便、检测灵敏、特异性好、重复性高等特点，现今已越来越多地被应用于临床检验技术中。
[0029]
3、本发明利用免疫组化技术、系统评分测定高级别脑膜瘤组织中ccnb1蛋白的表达水平，并结合术后随访信息，确定ccnb1蛋白表达水平与手术后高级别脑膜瘤患者预后存在相关性，ccnb1蛋白能用于制备判断高级别脑膜瘤患者预后的蛋白分子标记，对于高级别脑膜瘤的分子分型、病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。
附图说明
[0030]
图1中a、b、c、d分别为ccnb1在正常硬脑膜组织、who i、ii、ii级脑膜瘤组织中的免疫组化染色结果图；高级别脑膜瘤组织(图c、d)中可见ccnb1呈较强阳性着色，低级别脑膜瘤组织(图b)弱着色，正常硬脑膜组织(图a)不着色。
[0031]
图2为ccnb1在高级别脑膜瘤组织、低级别脑膜瘤和正常硬脑膜组织中的表达结果图；显示ccnb1在高级别脑膜瘤组织、低级别脑膜瘤和正常硬脑膜组织中的表达积分值分别为2.56
±
2.33、0.73
±
1.79、0.22
±
0.67，每两者之间的差异均具有显著的统计学意义(p<0.01)。
[0032]
图3为ccnb1在高级别脑膜瘤组织中免疫组化染色的结果图，可见肿瘤细胞胞核中ccnb1呈广泛的较强阳性着色(积分大于3分)，肿瘤组织中ccnb1高表达。
[0033]
图4为ccnb1在高级别脑膜瘤组织中免疫组化染色结果图，可见肿瘤细胞胞核中ccnb1呈散在较弱阳性着色(积分小于等于3分，肿瘤组织中ccnb1低表达)。
[0034]
图5为ccnb1蛋白高表达和低表达对两组患者之间无进展生存期pfs的k
‑
m曲线图。
具体实施方式
[0035]
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
[0036]
以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0037]
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0038]
在以下实施例中，高级别脑膜瘤患者的肿瘤组织样本均来自于上海长征医院，由2
名病理科医生明确诊断为who ii、iii级脑膜瘤。
[0039]
实施例1：
[0040]
随机选取72例高级别脑膜瘤患者术后肿瘤组织、15例who i级脑膜瘤患者术后肿瘤组织和9例外伤需切除的部分硬脑膜石蜡切片(肿瘤组织切片均来自上海长征医院，由2名病理科医生确诊；硬脑膜来自脑外伤患者因病情需要切除的硬脑膜，标本的获取均通过医院伦理委员会审批)。
[0041]
本实施例采用免疫组化方法检测ccnb1蛋白在高、低级别脑膜瘤组织和正常硬脑膜中的表达情况并评分，具体步骤如下：
[0042]
(1)制备高级别脑膜瘤组织石蜡切片，60℃烤箱过夜；
[0043]
(2)切片脱蜡及水化(二甲苯
①
10min
→
二甲苯
②
10min
→
二甲苯
③
10min
→
100％乙醇5min
→
95％乙醇5min
→
85％乙醇5min
→
75％乙醇5min
→
双蒸水5min)；
[0044]
(3)3％h2o2甲醇液，室温放置20min；
[0045]
(4)双蒸水洗5min
×
3；
[0046]
(5)抗原修复：切片放入0.01m柠檬酸盐缓冲液(ph6.0)中煮沸5min，挺火10min，再煮沸5min；
[0047]
(6)自然冷却至室温，双蒸水洗5min
×
3；
[0048]
(7)1％bsa封闭液37℃孵育30min；
[0049]
(8)甩去去血清封闭液，滴加一抗(兔抗人ccnb1单克隆抗体)，37℃持续60min；
[0050]
(9)4℃取出，室温复温15min，然后0.01m pbs洗5min
×
4；
[0051]
(10)滴加二抗(envision二抗试剂盒)，根据二抗试剂盒说明书孵育；
[0052]
(11)0.01m pbs洗5min
×
4，dab显色2
‑
10min，镜下观察；
[0053]
(12)双蒸水终止显色，苏木素复染10秒；
[0054]
(13)分化后自来水反蓝，蒸馏水浸泡；
[0055]
(14)脱水透明，盖玻片覆盖；
[0056]
(15)显微镜下观察阳性染色：每个标本随即选择5个高倍镜视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞所占百分率。以细胞核内出现棕/黄色染色为阳性，按照染色的深浅，分为四个等级：无染色记为0分，浅黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分；以细胞核内出现棕/黄色染色的细胞为阳性细胞，计算100个细胞中的阳性细胞的数量，评分标准为：无阳性细胞记为0分，阳性细胞比例＜5％记为1分，5％
‑
10％记为2分，≥10％记为3分。以染色深度积分乘以阳性率积分，即为该样本点中ccnb1蛋白在相应肿瘤组织中表达量的终积分。
[0057]
如图1所示，高级别脑膜瘤胞核中可见ccnb1呈广泛的较强阳性染色(图1c、d)，呈现显著高表达。对照的低级别脑膜瘤、正常硬脑膜组织较弱着色(图1a、b)，经多组实验验证，如图2所示，ccnb1在高级别脑膜瘤、低级别脑膜瘤及正常硬脑膜组织中的表达积分值为2.56
±
2.33、0.73
±
1.79、0.22
±
0.67，每两组间差异均具有显著的统计学意义(p<0.01)。
[0058]
实施例2：
[0059]
随机取高级别脑膜瘤患者手术切除的肿瘤标本，制备高级别脑膜瘤患者肿瘤的组织切片，采用实施例一中的免疫组化方法的实验步骤检测ccnb1蛋白在高级别脑膜瘤组织中的相对表达量，计算免疫组化评分。
[0060]
共检测72例高级别脑膜瘤组织，发现ccnb1在49例肿瘤组织中的表达积分小于等于3分，23例肿瘤组织中的表达积分大于3分。依据ccnb1蛋白表达高低(当免疫组化终评分大于3分为高表达，小于等于3分为低表达)将高级别脑膜瘤患者分组，绘制无进展生存曲线图(图5)。结果表明肿瘤中ccnb1呈高表达的患者术后无进展生存时间明显短于低表达者。
[0061]
实施例3：
[0062]
样本：某高级别脑膜瘤患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法的实验步骤检测ccnb1蛋白在高级别脑膜瘤组织中的相对表达量。高级别脑膜瘤的显微图片如图3所示。经计算，该组织的免疫组化评分为6。
[0063]
经术后随访可发现，该患者术后4个月后肿瘤复发。
[0064]
实施例4：
[0065]
样本：某高级别脑膜瘤患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法的实验步骤检测ccnb1蛋白在高级别脑膜瘤组织中的相对表达量。高级别脑膜瘤的显微图片如图4所示。经计算，该组织的免疫组化评分为0。
[0066]
经术后随访可发现，该患者术后72个月后仍健在，且肿瘤无复发。
[0067]
由以上实验结果可知，通过采用免疫组化的方法检测ccnb1蛋白分子相对表达量能预测高级别脑膜瘤患者术后的无进展生存时间。当免疫组化评分高于3时，高级别脑膜瘤患者术后易出现复发，预后较差。显然，ccnb1蛋白与高级别脑膜瘤预后具有相关性，因此，以ccnb1蛋白作为蛋白质分子标记对其表达量进行检测能预测高级别脑膜瘤手术后复发等事件，并判断预后。相应的，特异性抗ccnb1蛋白的抗体，包括单克隆或多克隆抗体，能用于制备确定高级别脑膜瘤手术预后的试剂盒，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
[0068]
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。