一种混合荧光染料试剂及其冻干方法与流程

1.本发明涉及荧光染料领域，特别涉及一种混合荧光染料试剂及其冻干方法。


背景技术：

2.机体内的活性氧，例如o2‑
和h2o2具有反应活性高的特点，因此，他们会对精子产生氧损伤，另外，活性氧的寿命短，对检测试剂和检测方法要求较高，同时，在检测o2‑
和h2o2活性氧损伤时，由于目前提供的检测试剂没有特异性选择，其他种类的活性氧会影响上述活性氧的检测精度。
3.另外，还存在死亡精子，因此，精子的存在状况比较多，目前的染料试剂和测试方法无法排除其他活性氧的干扰，还可以检测出精子的存活率。
4.另外，荧光染料试剂通常性能稳定性较差，因此，为了荧光染料长期保持性能稳定，需要对荧光染料进行冻干处理，混合荧光染料试剂中成份以及比例会影响混合荧光染料试剂的冻干外形，性能，保存实限，同时还会影响复溶之后的性能和保存时限。
5.因此，有必要提供一种混合荧光染料试剂，另外，还有必要提供一种混合荧光染料试剂的冻干方法。


技术实现要素：

6.本发明的第一目的是提供一种混合荧光染料试剂，以解决技术背景中存在的不足。
7.为实现上述目的，本发明提出的一种混合荧光染料试剂，其特征在于，包括以下体积的成份：71ml
‑
96ml的二甲基亚砜，3ml
‑
29ml的sytox red，还包括以下质量的成份：0.03g
‑
0.65g的dcfh
‑
da，0.01g
‑
0.1g的mitosox red。
8.本发明的第二目的是提供一种混合荧光染料试剂的冻干方法，以解决背景技术中存在的不足。
9.为实现上述目的，本发明提出的一种混合荧光染料试剂的冻干方法，包括以下步骤：
10.采用二甲基亚砜溶解mitosox red，dcfh
‑
da和sytox red，配置成混合荧光染料试剂，所述二甲基亚砜的体积为71ml
‑
96ml，所述sytox red的体积为3ml
‑
29ml，所述dcfh
‑
da的质量为0.03g
‑
0.65g，所述mitosox red的质量为0.01g
‑
0.1g；
11.将所述混合荧光染料试剂置于冻干机内冷冻，所述冷冻包括以下步骤：
12.预冻：隔板温度为零下28.3℃至零下30.9℃，时间为6h，样品温度为零下24℃至零下25℃；
13.干燥：隔板温度为零下25℃至零下26.3℃，升温速率为2
‑
3℃/h，真空度为19
‑
20pa；
14.解析干燥：隔板温度为39℃至40℃，时间为4h，真空度为5pa以下。
15.优选地，所述预冻中隔板温度为零下30℃。
16.优选地，所述干燥中隔板温度为零下25℃，升温速率为2.5℃/h。
17.优选地，所述解析干燥中隔板温度为40℃。
18.优选地，配置成所述混合荧光染料试剂之后，分装入试剂瓶，再置于所述冷冻机内冷冻。
19.优选地，冷冻后，在真空状态下所述试剂瓶加盖，加盖后的所述试剂瓶从所述冻干机取出后压盖，压盖后放入密封袋，置2～8℃保存。
20.与现有技术相比，本发明的有益技术效果是：
21.能够检测细胞包括生殖细胞的质量，例如，细胞活性氧损伤比例和细胞死亡比例，并且能够特异性检测o2‑
和h2o2活性氧损伤，同时该混合荧光染料试剂制成冻干剂时，外形完整，规则，不会塌陷，保存时限可达14天，复溶后保存时限可达20h，性能损失较小；
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
23.图1为本发明实施例提供的冻干方法流程图；
24.图2为本发明实施例提供的检测双参数散点图；
25.图3为本发明实施例提供的检测直方图之一；
26.图4为本发明实施例提供的检测直方图之二；
27.图5为本发明实施例提供的检测直方图之三；
28.图6为本发明实施例提供的检测直方图之四；
29.图7为本发明实施例提供的检测直方图之五；
30.图8为本发明实施例提供的检测结果统计表。
31.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
32.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.本发明提供了一种混合荧光染料试剂，其特征在于，包括以下体积的成份：71ml
‑
96ml的二甲基亚砜，例如72ml，75ml，82ml，85ml，87ml，91ml，93ml；3ml
‑
29ml的sytox red，例如4ml，6ml，8ml，12ml，14ml，15ml，18ml，23ml，25ml，27ml；还包括以下质量的成份：0.03g
‑
0.65g的dcfh
‑
da，例如0.05g，0.1g，0.2g，0.3g，0.35g，0.4g，0.45g，0.6g；0.01g
‑
0.1g的mitosox red，例如0.02g，0.05g，0.06g，0.07g，0.08g，0.125g。
34.在本发明的一些实施例中，列出了一些具体实施方式，例如：
35.实施例1：
36.一种混合荧光染料试剂，包括：90ml的二甲基亚砜，10ml的sytox red，0.15g的
dcfh
‑
da，0.03g的mitosox red。
37.实施例2：
38.一种混合荧光染料试剂，包括：95ml的二甲基亚砜，5ml的sytox red，0.05g的dcfh
‑
da，0.01g的mitosox red。
39.实施例3：
40.一种混合荧光染料试剂，包括：80ml的二甲基亚砜，20ml的sytox red，0.5g的dcfh
‑
da，0.1g的mitosox red。
41.实施例4：
42.一种混合荧光染料试剂，包括：90ml的二甲基亚砜，10ml的sytox red，0.15g的dcfh
‑
da，0.01g的mitosox red。
43.实施例5：
44.一种混合荧光染料试剂，包括：90ml的二甲基亚砜，10ml的sytox red，0.15g的dcfh
‑
da，0.1g的mitosox red。
45.实施例6：
46.一种混合荧光染料试剂，包括：90ml的二甲基亚砜，10ml的sytox red，0.5g的dcfh
‑
da，0.03g的mitosox red。
47.实施例7：
48.一种混合荧光染料试剂，包括：95ml的二甲基亚砜，5ml的sytox red，0.15g的dcfh
‑
da，0.03g的mitosox red。
49.对比例1：
50.一种混合荧光染料试剂，包括：97.5ml的二甲基亚砜，2.5ml的sytox red，0.025g的dcfh
‑
da，0.005g的mitosox red。
51.对比例2：
52.一种混合荧光染料试剂，包括：70ml的二甲基亚砜，30ml的sytox red，0.75g的dcfh
‑
da，0.15g的mitosox red。
53.通过下列指标对实施例1至7和对比例1、2得到的冻干试剂进行检测：
54.外观：在明亮处以目力观察，冻干粉应为白色疏松粉未,无结块，外形规则完整，无塌陷，无鼓泡。
55.空白检测：不加标本，按照标准检测方法上流式细胞仪进行检测，重复三次，检测结果均应为空白或0。
56.批内精密度：按照标准检测方法检测同一份精液标本20次，计算均值。
57.按下式计算变异系数(cv)。
[0058][0059]
流式设定电压：进行检测前，需要对流式细胞仪的参数进行调节，以取得最好的检测效果，最主要是对流式细胞仪fitc、pe、pe
‑
cy7进行调节，一般而言，电压不能太大，选择fitc、pe、pe
‑
cy7中电压最大的记录下来。(此处电压是相对比值，是流式细胞仪的参数设置)
[0060]
常温保存时效：将20瓶冻干粉置于室温(约25℃)下，每隔1天，复溶一瓶，检测其各
项性能，如不合格，则保存时限为前一天。外观不能出现收缩现象(冻干粉原本为疏松圆饼状，慢慢变小)；批内精密度＞5％；流式设定电压提升300以上。
[0061]
复溶后保存时效：将20瓶冻干粉复溶后，置于室温(约25℃)下，每隔1h，检测其各项性能，如不合格，则保存时限为前一小时。
[0062]
得到的测试结果如下所示：
[0063]
[0064][0065]
需要说明的是，流式设定电压能够间接评价荧光染剂发光性能，电压越大，发光性能越低，从上述测试结果可知，实施例1至实施例7的发光性能较好，流式设定电压在200
‑
760内，对比例1和对比例2的值在890
‑
920内，远超过700，说明对比例的发光性能较低，上述实施例中，没有经过冻干操作的混合荧光染料试剂的流式设定电压与相应的冻干的混合荧光染料试剂的流式设定电压相近，说明冻干操作对发光性能很小，性能损失较小。
[0066]
另外从外观可知，实施例1至7的外观完整规则，对比例1的外观有塌陷，对比例2的外形不规则，说明上述组份的比例选择会影响冻干后的外观，另外从空白检测可知，对比例2还会存在杂质，影响使用，并且实施例1至7与对比例1至2相比具有更高的批内精密度，大概在1％
‑
4％，另外，从测试结果可知荧光染料组合物的比例不影响常温保存时效，但是对复溶后保存时限影响较大，实施例1至实施例7的复溶后保存时限大约为20h，是对比例1和对比例2的2倍。
[0067]
另外，本发明采用混合荧光染料中，精子细胞膜内的过氧化氢，可氧化dcfh，生成荧光物质dcf，经488nm激光激发呈绿色荧光，发射波长500
‑
530nm；同时mitosox red可与活精子线粒体特异性靶向结合，并可被超氧化物(o2‑
·
)快速氧化，氧化产物经488nm激光激发产生红色荧光，发射光波长510～580nm。而死亡精子与sytox red染料结合，经488nm激光激发呈红色荧光，发射波长为700nm。三种荧光染剂的组合应用，可特异性评估精子的氧化损伤和活精子。首先通过sytox red筛选出活精子，然后通过dcfh筛选存在过氧化氢氧化损伤的精子，以及用mitosox red筛选存在线粒体超氧化物氧化损伤的精子。
[0068]
本发明还提供了一种混合荧光染料试剂的冻干方法，包括以下步骤：
[0069]
采用二甲基亚砜溶解mitosox red，dcfh
‑
da和sytox red，配置成混合荧光染料试剂，所述二甲基亚砜的体积为71ml
‑
96ml，例如，75ml，80ml，85ml，90ml，95ml，所述sytox red的体积为3ml
‑
29ml，例如，5ml，7ml，9ml，10ml，12ml，15ml,20ml，25ml，28ml，所述dcfh
‑
da的质量为0.03g
‑
0.65g，例如，0.05g，0.1g，0.15g，0.2g，0.25g，0.3g，0.4g，0.45g，0.5g，0.55g，0.6g，所述mitosox red的质量为0.01g
‑
0.1g，例如，0.03g，0.05g，0.07g，0.08g，0.09g；
[0070]
将所述混合荧光染料试剂置于冻干机内冷冻，所述冷冻包括以下步骤：
[0071]
预冻：隔板温度为零下28.3℃至零下30.9℃，例如，
‑
28.4℃，
‑
28.5℃，
‑
28.6℃，
‑
28.7℃，
‑
28.8℃，
‑
28.9℃，
‑
29℃，
‑
29.1℃，
‑
29.2℃，
‑
29.3℃，
‑
29.5℃，
‑
29.7℃，
‑
30℃，
‑
30.1℃，
‑
30.2℃，
‑
30.3℃，
‑
30.4℃，
‑
30.9℃，时间为6h，样品温度为零下24℃至零下25℃，例如，
‑
24.2℃，
‑
24.4℃，
‑
24.4℃，
‑
24.6℃，
‑
24.8℃；
[0072]
干燥：隔板温度为零下25℃至零下26.3℃，例如，
‑
25.1℃，
‑
25.3℃，
‑
25.4℃，
‑
25.5℃，
‑
25.6℃，
‑
25.7℃，
‑
25.8℃，
‑
25.9℃，
‑
26℃，
‑
26.1℃，
‑
26.2℃，升温速率为2
‑
3℃/h，例如，2.1℃/h，2.2℃/h，2.3℃/h，2.4℃/h，2.5℃/h，2.6℃/h，2.7℃/h，2.8℃/h，2.9℃/h，真空度为19
‑
20pa，例如19.5pa；
[0073]
解析干燥：隔板温度为39℃至40℃，例如，39.1℃，39.3℃，39.5℃，39.7℃，39.9℃，时间为4h，真空度为5pa以下。
[0074]
在本发明的一些实施例中，配置成所述配置成所述混合荧光染料试剂之后，分装入试剂瓶，再置于所述冷冻机内冷冻。
[0075]
在本发明的一些实施例中，所述荧光染料的冻干方法包括以下步骤：
[0076]
采用实施例1至7的组份及其比例，配置成混合荧光染料试剂，配置的方法为：以二甲基亚砜溶解mitosox red和dcfh
‑
da，再加入sytox red混匀即可，然后分装入试剂瓶，使用的是可真空压盖的茶色玻璃瓶，分装成1ml每支。
[0077]
将分装好的所述混合荧光染料试剂置于冻干机内冷冻，所述冻干机用的是上海浦东冷冻干燥设备有限公司的pdfd glzy
‑
1b真空冷冻干燥机；所述冷冻包括以下步骤：
[0078]
预冻：隔板温度为零下30℃，时间为6h，样品温度为零下25℃；
[0079]
干燥：隔板温度为零下25℃，升温速率为2.5℃/h，真空度为20pa；
[0080]
解析干燥：隔板温度为40℃，时间为4h，真空度为5pa以下。
[0081]
在完成上述冷冻操作后，在真空状态下所述试剂瓶加盖，加盖后的所述试剂瓶从所述冻干机取出后压盖，压盖后放入密封袋，置2～8℃保存。
[0082]
采用上述冻干产品检测精子活性氧损伤和死亡情况的操作为：
[0083]
将上述实施例中得到的冻干粉末回温至室温得到混合荧光染料试剂；
[0084]
配置缓冲液：准确量取氯化钠5.715g、氯化钾0.350g、七水合硫酸镁0.049g、磷酸二氢钾0.050g、碳酸氢钠2.100g、葡萄糖0.501g、丙酮酸钠0.036g、乳酸钠4ml、氯化钙0.226g、proclin 300400ul，以纯化水溶解，以浓盐酸溶液和浓氢氧化钠溶液调ph至7.4
±
0.2，定容至1000ml；
[0085]
标本准备：以符合世界卫生组织标准要求的采集装置及方法收集精液标本，并在1小时内尽快完成检测；
[0086]
精子浓度计算：取约1
×
106个精子加入到洁净的小玻璃管中(加入精液体积的计
算方法为：1000
÷
m(ul))，补充上述缓冲液至0.5ml；
[0087]
加入荧光染料：再加入5ul上述混合荧光染料试剂，混合后37℃水浴避光反应15min，得到检测样本；
[0088]
检测：将上述检测样本放入到流式细胞仪检测，至少分析5000个精子；
[0089]
获取数据：打开迈瑞bricyte e6流式细胞仪,完成开机工作。点击“新增样本”，选择通道fsc、ssc、fitc、pe、pe
‑
cy7。点选fitc、pe、pe
‑
cy7为对数。在画图区点击“散点图”，任意画出p1门。上样，点击“预览”。仪器运行，调节fsc、ssc通道电压，将杂质和精子分开。调节p1门，圈出精子，得到如图2所述的双参数散点图，通过分析图3所示的散点图能够区分开精子与杂质；
[0090]
在第二张图片区点击“直方图”，粒子群选择“p1”，x轴选择“pe
‑
cy7
‑
h”，调节pe
‑
cy7的电压，使直方图的两个波峰与波谷清晰，如图3所示，点击区间门，将第一个波峰圈出，为“i1”，圈出的即为活精子，除外的为死精子；
[0091]
在第三张图片区点击“直方图”，粒子群选择“i1”，x轴选择“fitc
‑
h”，调节fitc的电压，使直方图的波峰与波谷清晰，如下图。点击区间门，将除第一个波峰圈出，为“i2”，圈出的即为存在过氧化氢氧化损伤的活精子，第一个波峰为正常的活精子，如图4所示；
[0092]
在第四张图片区点击“直方图”，粒子群选择“i1”，x轴选择“pe
‑
h”，调节pe的电压，使直方图的波峰与波谷清晰，如图5所示，点击区间门，将除第一个波峰圈出，为“i3”，圈出的即为存在线粒体超氧化物氧化损伤的活精子，第一个波峰为正常的活精子；
[0093]
在第五张图片区点击“直方图”，粒子群选择“p1”，x轴选择“pe
‑
h”，如图6所示，点击区间门，将除第一个波峰圈出，为“i4”，圈出的即为存在线粒体超氧化物氧化损伤的精子(活精子 死精子)；
[0094]
在第六张图片区点击“直方图”，粒子群选择“p1”，x轴选择“fitc
‑
h”，如图7所示，点击区间门，将除第一个波峰圈出，为“i5”，圈出的即为存在过氧化氢氧化损伤的精子(活精子 死精子)；
[0095]
上述步骤通过选择不同的粒子群与荧光通道(fitc、pe、pe
‑
cy7)，做直方图，第一个波峰均为正常粒子，后续均为异常粒子。不同组合，可以提供不同的检测意义，其所有检测意义可见方法学原理；
[0096]
点击“记录”，等待仪器检测完成；
[0097]
点击“报告”，查看检测结果，输出如图8所示的结果数据表。
[0098]
通过上述操作即可检测精子的活性氧损伤和死亡情况。
[0099]
直接配置的荧光染料混合液的测定步骤与上述步骤相同，不同的是，直接配置的荧光染料混合液不经过冻干操作，不存在复溶操作，通过上述操作对同一批精子检测，得到的结果与经过冻干操作的混合荧光染料得到的结果相近，表明采用本发明的冻干技术方案对混合荧光染料的性能影响很小。
[0100]
上述实施例中，二甲基亚砜选购自广东光华科技股份有限公司，sytox red选购自thermo fisher scientific公司，dcfh
‑
da选购自sigma
‑
aldrich公司，mitosox red购自thermo fisher scientific公司。
[0101]
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用
在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。