一种基于免疫层析法的6种毒品定量检测试剂和试纸条的制作方法

1.本发明涉及毒品检测分析技术领域，具体涉及一种基于免疫层析法的6种毒品定量检测试剂和试纸条。


背景技术：

2.现有的毒品检测技术主要有酶联免疫、胶体金法、时间分辨免疫荧光技术和量子点荧光免疫技术，不同的检测分析技术在毒品现场检测应用上各有缺点：酶联免疫法操作复杂，检测时间长以及对人员专业性要求较高；胶体金法由于灵敏度较低不能满足毛发的检测阈值要求，时间分辨免疫荧光技术和量子点荧光免疫技术特异性强，灵敏度高，但一般为使用单项目检测卡进行检测和使用多项目检测卡进行检测，但是不管单项目检测还是多项目检测只能做到定性检测，不能做到定量检测。在使用单项目检测时只能对样本进行单项检测，使用多项目检测时也是将样本等分，然后进行各项目检测，操作繁杂。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种基于免疫层析法的6种毒品定量检测试剂和试纸条。本发明所述试剂制备得到的试纸条能够同时检测多项毒品、检测快速且可实现毒品的定量检测。
4.本发明提供了一种基于免疫层析法的6种毒品定量检测试剂，所述试剂包括6种毒品的合成抗原包被液、质控包被液和6种毒品的时间分辨微球标记抗体；所述6种毒品的合成抗原包被液包括吗啡合成抗原包被液、冰毒合成抗原包被液、氯胺酮合成抗原包被液、可卡因合成抗原包被液、大麻合成抗原包被液和摇头丸合成抗原包被液；所述6种毒品的时间分辨微球标记抗体包括吗啡的时间分辨微球标记抗体、冰毒的时间分辨微球标记抗体、氯胺酮的时间分辨微球标记抗体、可卡因的时间分辨微球标记抗体、大麻的时间分辨微球标记抗体和摇头丸的时间分辨微球标记抗体。
5.优选的是，所述吗啡合成抗原包被液包括：0.1～0.5mg/ml的吗啡合成抗原、质量百分含量为0.5％的海藻糖，8.5g/l的氯化钠、2.2g/l的磷酸氢二钠和0.2g/l的磷酸二氢钠，溶剂为水；
6.所述冰毒合成抗原包被液包括0.1～0.5mg/ml的冰毒合成抗原、质量百分含量为0.5％的海藻糖，8.5g/l的氯化钠、2.2g/l的磷酸氢二钠和0.2g/l的磷酸二氢钠，溶剂为水；
7.所述氯胺酮合成抗原包被液包括0.1～0.5mg/ml的氯胺酮合成抗原、质量百分含量为0.5％的海藻糖，8.5g/l的氯化钠、2.2g/l的磷酸氢二钠和0.2g/l的磷酸二氢钠，溶剂为水；
8.所述可卡因合成抗原包被液包括0.1～0.5mg/ml的可卡因合成抗原、质量百分含量为0.5％的海藻糖，8.5g/l的氯化钠、2.2g/l的磷酸氢二钠和0.2g/l的磷酸二氢钠，溶剂为水；
9.所述大麻合成抗原包被液包括0.1～0.5mg/ml的大麻合成抗原、质量百分含量为
0.5％的海藻糖，8.5g/l的氯化钠、2.2g/l的磷酸氢二钠和0.2g/l的磷酸二氢钠，溶剂为水；
10.所述摇头丸合成抗原包被液包括0.1～0.5mg/ml的摇头丸合成抗原、质量百分含量为0.5％的海藻糖，8.5g/l的氯化钠、2.2g/l的磷酸氢二钠和0.2g/l的磷酸二氢钠，溶剂为水。
11.优选的是，所述质控包被液包括0.5～1.0mg/ml的羊抗鼠多克隆抗体，质量百分含量为0.5％的海藻糖，8.5g/l的氯化钠、2.2g/l的磷酸氢二钠和0.2g/l的磷酸二氢钠。
12.优选的是，所述6种毒品的时间分辨微球标记抗体的制备方法包括：将时间分辨微球置于活化缓冲液中活化，将活化的时间分辨微球分别与6种毒品的抗体混合，得到6种毒品的时间分辨微球标记抗体。
13.优选的是，所述时间分辨微球在缓冲液中的质量百分含量为2％。
14.优选的是，所述6种毒品的抗体的质量浓度分别为0.1～1.0mg/ml。
15.优选的是，所述活化缓冲液的制备方法包括：将0.1m的mes、10mm的edc、100mm的nhs和质量百分含量为1％的吐温20等体积混合。
16.本发明还提供了一种基于上述技术方案所述试剂的6种毒品定量检测试纸条，所述试纸条的包被膜上喷有6种毒品的合成抗原包被液和质控包被液，所述试纸条的结合垫上喷有6种毒品的时间分辨微球标记抗体。
17.优选的是，所述包被膜包括第一包被膜和第二包被膜；
18.所述第一包被膜上喷有吗啡合成抗原包被液、冰毒合成抗原包被液、氯胺酮合成抗原包被液和质控包被液；
19.所述第二包被膜上喷有大麻合成抗原包被液、摇头丸合成抗原包被液、可卡因合成抗原包被液和质控包被液。
20.优选的是，所述结合垫包括第一结合垫和第二结合垫；
21.所述第一结合垫上喷有吗啡的时间分辨微球标记抗体、冰毒的时间分辨微球标记抗体和氯胺酮的时间分辨微球标记抗体；
22.所述第二结合垫上喷有大麻的时间分辨微球标记抗体、摇头丸的时间分辨微球标记抗体和可卡因的时间分辨微球标记抗体。
23.本发明提供了一种基于免疫层析法的6种毒品定量检测试剂。本发明所述试剂制备得到的试纸条能够用于6种毒品的定量检测，在样本垫上滴加带检测样本，在样本经过结合垫的时候，可以使得样本内的毒品成分与结合垫内的毒品抗体进行反应，在侧向层析作用下，到达包被膜的检测(抗原)包被液划线处，通过检测包被液划线显色情况从而可以确定样本中的毒品成分具体为哪种，达到便捷检测样本毒品成分的效果，从而解决了现有技术中的对样本内的毒品成分不能便捷检测的问题。此外，在反应后将试纸条插入到检测仪中，观察具体样本中的毒品含量，具体为在检测仪中观察反应后划线前后变化程度，可以确定毒品中的含量，从而达到定量检测样品毒品成分的效果。本发明使用侧向层析时间分辨免疫荧光检测方法，不同于市场上的单向胶体金或是普通荧光侧向层析检测的定性或是定量检测，可以用极微量样本量，具体只需2次加样就可以同时准确检测吗啡、冰毒、可卡因、大麻、氯胺酮、摇头丸6种毒品的含量；能够节省样本用量，完成多项目同时检测，更节省检测时间，通过使用灵敏高不淬灭的时间分辨荧光微球，可以进行痕量级定量检测样，最高可以检测样本中10pg/ml的毒品含量，比市场上技有技术灵敏高一个数量级。
附图说明
24.图1为本发明提供的试纸条结构图。
具体实施方式
25.本发明提供了一种基于免疫层析法的6种毒品定量检测试剂，所述试剂包括6种毒品的合成抗原包被液、质控包被液和6种毒品的时间分辨微球标记抗体；所述6种毒品的合成抗原包被液包括吗啡合成抗原包被液、冰毒合成抗原包被液、氯胺酮合成抗原包被液、可卡因合成抗原包被液、大麻合成抗原包被液和摇头丸合成抗原包被液；所述6种毒品的时间分辨微球标记抗体包括吗啡的时间分辨微球标记抗体、冰毒的时间分辨微球标记抗体、氯胺酮的时间分辨微球标记抗体、可卡因的时间分辨微球标记抗体、大麻的时间分辨微球标记抗体和摇头丸的时间分辨微球标记抗体。
26.在本发明中，所述吗啡合成抗原包被液优选包括：0.1～0.5mg/ml的吗啡合成抗原、质量百分含量为0.5％的海藻糖，8.5g/l的氯化钠、2.2g/l的磷酸氢二钠和0.2g/l的磷酸二氢钠，溶剂为水；本发明对所述吗啡合成抗原的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。
27.所述冰毒合成抗原包被液优选包括0.1～0.5mg/ml的冰毒合成抗原、质量百分含量为0.5％的海藻糖，8.5g/l的氯化钠、2.2g/l的磷酸氢二钠和0.2g/l的磷酸二氢钠，溶剂为水；本发明对所述冰毒合成抗原的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。
28.所述氯胺酮合成抗原包被液优选包括0.1～0.5mg/ml的氯胺酮合成抗原、质量百分含量为0.5％的海藻糖，8.5g/l的氯化钠、2.2g/l的磷酸氢二钠和0.2g/l的磷酸二氢钠，溶剂为水；本发明对所述氯胺酮合成抗原的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。
29.所述可卡因合成抗原包被液优选包括0.1～0.5mg/ml的可卡因合成抗原、质量百分含量为0.5％的海藻糖，8.5g/l的氯化钠、2.2g/l的磷酸氢二钠和0.2g/l的磷酸二氢钠，溶剂为水；本发明对所述可卡因合成抗原的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。
30.所述大麻合成抗原包被液优选包括0.1～0.5mg/ml的大麻合成抗原、质量百分含量为0.5％的海藻糖，8.5g/l的氯化钠、2.2g/l的磷酸氢二钠和0.2g/l的磷酸二氢钠，溶剂为水；本发明对所述大麻合成抗原的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。
31.所述摇头丸合成抗原包被液优选包括0.1～0.5mg/ml的摇头丸合成抗原、质量百分含量为0.5％的海藻糖，8.5g/l的氯化钠、2.2g/l的磷酸氢二钠和0.2g/l的磷酸二氢钠，溶剂为水。本发明对所述摇头丸合成抗原的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。
32.在本发明中，所述质控包被液优选包括0.5～1.0mg/ml的羊抗鼠多克隆抗体，质量百分含量为0.5％的海藻糖，8.5g/l的氯化钠、2.2g/l的磷酸氢二钠和0.2g/l的磷酸二氢钠。本发明对所述羊抗鼠多克隆抗体的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。
33.在本发明中，所述6种毒品的时间分辨微球标记抗体的制备方法包括：将时间分辨微球置于活化缓冲液中活化，将活化的时间分辨微球分别与6种毒品的抗体混合，得到6种毒品的时间分辨微球标记抗体。本发明对所述时间分辨微球的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规时间分辨微球市售产品即可。
34.在本发明中，所述时间分辨微球在缓冲液中的质量百分含量优选为2％。
35.在本发明中，所述6种毒品的抗体的质量浓度分别优选为0.1～1.0mg/ml。
36.在本发明中，所述活化缓冲液的制备方法优选包括：将0.1m的mes、10mm的edc、100mm的nhs和质量百分含量为1％的吐温20等体积混合。
37.本发明还提供了一种基于上述技术方案所述试剂的6种毒品定量检测试纸条，所述试纸条的包被膜上喷有6种毒品的合成抗原包被液和质控包被液，所述试纸条的结合垫上喷有6种毒品的时间分辨微球标记抗体。
38.在样本垫上滴加带检测样本，在样本经过结合垫的时候，可以使得样本内的毒品成分与结合垫内的毒品抗体进行反应，在侧向层析作用下，到达包被膜的检测(抗原)包被液划线处，通过检测包被液划线显色情况从而可以确定样本中的毒品成分具体为哪种，达到便捷检测样本毒品成分的效果，从而解决了现有技术中的对样本内的毒品成分不能便捷检测的问题。在本发明中，在试纸条反应后，本发明优选将试纸条插入到检测仪中，观察具体样本中的毒品含量，本发明对所述检测仪的来源没有特殊限定，采用能够基于时间分辨微球进行定量检测的常规市售检测仪即可。本发明具体为在检测仪中观察反应后划线前后变化程度，可以确定毒品中的含量，从而达到定量检测样品毒品成分的效果。
39.在本发明中，所述包被膜优选包括第一包被膜和第二包被膜；
40.所述第一包被膜上喷有吗啡合成抗原包被液、冰毒合成抗原包被液、氯胺酮合成抗原包被液和质控包被液；
41.所述第二包被膜上喷有大麻合成抗原包被液、摇头丸合成抗原包被液、可卡因合成抗原包被液和质控包被液。
42.本发明对所述包被膜的制备方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售喷金划膜仪将各合成抗原包被液喷在包被膜上即可。
43.在本发明中，所述结合垫包括第一结合垫和第二结合垫；
44.所述第一结合垫上喷有吗啡的时间分辨微球标记抗体、冰毒的时间分辨微球标记抗体和氯胺酮的时间分辨微球标记抗体；
45.所述第二结合垫上喷有大麻的时间分辨微球标记抗体、摇头丸的时间分辨微球标记抗体和可卡因的时间分辨微球标记抗体。
46.本发明对所述结合垫的制备方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售喷金划膜仪将各时间分辨微球标记抗体喷在结合垫上即可。
47.即本发明具体包括二联检测试纸条，加两次样本可同时检测六项毒品，第一试纸条包括t1检测线(包被吗啡合成抗原)、t2检测线(包被冰毒合成抗原)、t3检测线(包被氯胺酮合成抗原)、c1质控线(包被羊抗鼠多克隆抗体)和相应的时间分辨微球标记抗体；第二试纸条包括t4检测线(包被可卡因合成抗原)、t5检测线(包被大麻合成抗原)、t6检测线(包被摇头丸合成抗原)、c2质控线(包被羊抗鼠多克隆抗体)和相应的时间分辨微球标记抗体。即本发明所述试剂具体包括吗啡合成抗原包被液(t1)、冰毒合成抗原包被液(t2)、氯胺酮合成抗原包被液(t3)、可卡因合成抗原包被液(t4)、大麻合成抗原包被液(t5)和摇头丸合成抗原包被液(t6)；以及质控包被液(c)和6种毒品的时间分辨微球标记抗体。本发明所述试剂制备得到试纸条后，在样本经过结合垫时，可以使得样本内的毒品成分与结合垫内的相应毒品的时间分辨微球标记抗体进行反应，在侧向层析作用下，到达第一包被膜上t1、t2、t3和第二包被膜上t4、t5、t6包被液划线处，通过检测包被液划线显色情况可以确定样本中的毒品成分具体为哪种，达到定量、便捷检测样本毒品成分的效果。
48.在本发明中，所述试纸条优选还包括吸水垫和支持物，本发明对所述吸水垫和支持物没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的材料制备吸水垫和支持物即可，如使用吸水纸作为吸水垫，使用pvc材料的塑料片作为支持物。
49.下面结合具体实施例对本发明所述的一种基于免疫层析法的6种毒品定量检测试剂和试纸条做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
50.实施例1
51.包被膜的制备
52.制备包被液：称取氯化钠8.5g，磷酸氢二钠2.2g，磷酸二氢钠0.2g，海藻糖50g实验室三级用水700ml充分搅拌溶解，然后定容至1l；
53.用包被液将吗啡合成抗原、冰毒合成抗原、氯胺酮合成抗原分别稀释到0.1～0.5mg/ml，羊抗鼠多克隆抗体稀释到0.5～1.0mg/ml，然后用喷金划膜仪按照1μl/cm的量将此四种溶液分别按照顺序划四条带在硝酸纤维素膜上，然后置于37℃干燥8h以上，即制成第一包被膜；
54.用包被液将大麻合成抗原、摇头丸合成抗原、可卡因合成抗原分别稀释到0.1～0.5mg/ml，羊抗鼠多克隆抗体稀释到0.5～1.0mg/ml，然后用喷金划膜仪按照1μl/cm的量将此四种溶液分别按照顺序划四条带在硝酸纤维素膜上，然后置于37℃干燥8h以上，即制成第二包被膜。
55.实施例2
56.结合垫的制备
57.1)0.1m mes、10mm edc、100mm nhs、1％吐温20按照1:1:1:1得比例混合均匀后即配制成活化缓冲液；
58.2)取6支5ml离心管，每只分别加入2％时间分辨荧光微球100μl，超声2min，4500转/min离心6min，弃上清；
59.3)向每支离心管中分别加入100μl活化缓冲液混匀后超声15min；4500转/min离心6min，弃上清，备用；
60.4)分别向每支离心管中加入2ml 0.05％pbst重悬，并超声1min；
61.5)分别向6离心管中依次加入1mg/ml吗啡、冰毒、氯胺酮、大麻、摇头丸、可卡因毒品的抗体各1～10μl，并标记清楚，室温孵育2h；
62.6)分别向6支离心管中加入10％脱脂奶粉10μl，封闭1.5h；5000转/min离心6min，弃上清，再分别加入2ml 0.05％pbst重悬，并超声1min；5000转/min离心6min，弃上清，最后分别加入5ml 0.05％pbst重悬，即制成6种时间分辨微球标记毒品抗体。
63.7)取吗啡、冰毒、氯胺酮时间分辨微球标记抗体按1:1:1比例混匀后，使用喷金划膜仪按33.3ul/cm2的量喷在玻璃纤维膜上，然后置于
‑
50℃预冻30min后真空抽干3h，即制成第一结合垫；
64.8)取大麻、摇头丸、可卡因时间分辨微球标抗体记按1:1:1比例混匀后，使用喷金划膜仪按33.3ul/cm2的量喷在玻璃纤维膜上，然后置于
‑
50℃预冻30min后真空抽干3h，即制成第二结合垫。
65.实施例3
66.按照实施例1和实施例2的方法分别制备得到包被膜和结合垫，使用吸水纸作为吸
水垫，使用pvc材料的塑料片作为支持物。得到的试纸条(如图1所示)对样品进行定量检测，最高可以检测样本中10pg/ml的毒品含量。
67.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。