一种针对新冠病毒变异毒株Delta的融合蛋白、喷鼻式疫苗及其制备方法和应用与流程

一种针对新冠病毒变异毒株delta的融合蛋白、喷鼻式疫苗及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于病毒疫苗技术领域，具体涉及一种针对新冠病毒变异毒株delta的融合蛋白、喷鼻式疫苗及其制备方法和应用。


背景技术：

2.sars
‑
cov
‑
2(或2019
‑
ncov)是新冠肺炎的致病病毒。而delta病毒株是新冠病毒变异毒株，具有传播能力明显增强，潜伏期和隔代间期缩短，并可导致疾病严重程度增加的特点。目前，delta变异株感染引发的新冠肺炎，还没有专门的治疗药物。面对找到治愈方法的困难，研制疫苗已成为当务之急。
3.现有的疫苗制作包括传统疫苗(减毒活疫苗、灭活疫苗)、亚单位疫苗、病毒载体疫苗、核酸疫苗等。其中，重组亚单位疫苗是利用微生物(抗原)的某种表面结构成分诱导机体产生不含核酸的抗体的一种疫苗。这些结构可以包括某些多糖、蛋白质或表位，但它们不包括整个病原体。在亚单位疫苗的基础上，负载纳米粒子形成纳米疫苗，这也是疫苗设计的一种流行方式。
4.由于delta病毒传染性极强，致病性高的问题。全病毒结构的疫苗并不能保证其安全性，可能使接种对象产生无效抗体。无效抗体的产生往往对应对病毒感染不能起到有利作用甚至会导致依赖性感染增强现象和增强呼吸系统疾病等副作用。而单一蛋白的疫苗可能没有很好的免疫原性，或者面对同类型其他突变株感染时面临失效的风险。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种针对新冠病毒变异毒株delta的融合蛋白、喷鼻式疫苗及其制备方法和应用，具有理想的免疫原性，产生有效抗体，能够由于delta病毒株的预防。
6.本发明提供了一种针对新冠病毒变异毒株delta的融合蛋白，所述融合蛋白是s蛋白、m蛋白和n蛋白融合形成；
7.所述s蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no：1所示；
8.所述m蛋白的编码基因的核酸序列如seq id no：2所示；
9.所述n蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no：3所示。
10.优选的，所述融合蛋白为s
‑
m
‑
n融合蛋白。
11.优选的，所述融合蛋白中在每两个蛋白之间还包括柔性linker；
12.所述柔性linker的氨基酸酸序列为(ggggs)n，其中n为整数，且1≤n≤3。
13.本发明提供了一种针对新冠病毒变异毒株delta的喷鼻式疫苗，所述喷鼻式疫苗包括所述融合蛋白和佐剂。
14.优选的，所述融合蛋白的浓度为0.1～0.2g/l；
15.优选的，所述佐剂为plga。
16.优选的，所述plga在所述疫苗中的终浓度为1～2mg/ml。
17.本发明提供了所述融合蛋白在制备针对新冠病毒变异毒株delta的疫苗中的应用。
18.优选的，所述疫苗为鼻喷式疫苗。
19.本发明提供的针对新冠病毒变异毒株delta的融合蛋白是s蛋白、m蛋白和n蛋白融合形成；所述s蛋白的核苷酸序列如seq id no：1所示；所述m蛋白的编码基因的核酸序列如seq id no：2所示；所述n蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no：3所示。其中刺突蛋白s是新冠病毒与人体结合而发生感染的关键蛋白，同时其突变位点最多，最为关键；跨膜蛋白m、核衣壳蛋白n也是构成delta的主要结构。本发明构建的融合蛋白具有良好的免疫原性和生物学活性，能够诱导机体产生有效抗体，从而抑制新型冠状病毒变异株(delta)的生长，可有效预防感染delta。同时所述融合蛋白相对全病毒候选疫苗株具有较高的安全性。
20.本发明提供了一种针对新冠病毒变异毒株delta的喷鼻式疫苗，所述喷鼻式疫苗包括所述融合蛋白和佐剂。所述喷鼻式疫苗各组分相互协调补充，具有良好的免疫原性、安全性和生物学活性，能够诱导机体产生有效抗体，从而抑制新型冠状病毒变异株(delta)的生长，可有效预防感染delta。同时采用喷鼻式疫苗形式，无需注射、操作简便，避免了使用注射类疫苗后会发生注射部位疼痛、红肿的不良反应。本发明提供的疫苗制备方法简单、易于纯化，安全性高，疫苗可较快的应用于临床试验。
附图说明
21.图1为本发明中用于盛装鼻喷式疫苗的喷鼻式疫苗盒；
22.图2为本发明的一种新型冠状病毒s
‑
m
‑
n疫苗扫描电镜图；
23.图3为本发明实施疫苗提供的s
‑
m
‑
n的体外释放度曲线；
24.图4为本发明实施提供的s
‑
m
‑
n疫苗免疫小鼠产生的抗s、m、n蛋白抗体柱状图；
25.图5为本发明实施提供的s
‑
m
‑
n疫苗免疫小鼠后小鼠体内产生的细胞因子il
‑
2柱状图。
具体实施方式
26.本发明提供了一种针对新冠病毒变异毒株delta的融合蛋白，所述融合蛋白是s蛋白、m蛋白和n蛋白融合形成；所述s蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no：1
27.(tataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattaccggtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcaaaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcagggtgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcctacttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgtaatcttttgttgcaatatggcagtttttgtacacaattaaaccgtgctttaactggaatagctgttgaacaag
acaaaaacacccaagaagtttttgcacaagtcaaacaaatttacaaaacaccaccaattaaagattttggtggttttaatttttcacaaatattaccagatccatcaaaaccaagcaagaggtcatttattgaagatctacttttcaacaaagtgacacttgcagatgctggcttcatcaaacaatatggtgattgccttggtgatattgctgctagagacctcatttgtgcacaaaagtttaacggccttactgttttgccacctttgctcacagatgaaatgattgctcaatacacttctgcactgttagcgggtacaatcacttctggttggacctttggtgcaggtgctgcattacaaataccatttgctatgcaaatggcttataggtttaatggtattggagttacacagaatgttctctatgagaaccaaaaattgattgccaaccaatttaatagtgctattggcaaaattcaagactcactttcttccacagcaagtgcacttggaaaacttcaaaatgtggtcaaccaaaatgcacaagctttaaacacgcttgttaaacaacttagctccaattttggtgcaatttcaagtgttttaaatgatatcctttcacgtcttgacaaagttgaggctgaagtgcaaattgataggttgatcacaggcagacttcaaagtttgcagacatatgtgactcaacaattaattagagctgcagaaatcagagcttctgctaatcttgctgctactaaaatgtcagagtgtgtacttggacaatcaaaaagagttgatttttgtggaaagggctatcatcttatgtccttccctcagtcagcacctcatggtgtagtcttcttgcatgtgacttatgtccctgcacaagaaaagaacttcacaactgctcctgccatttgtcatgatggaaaagcacactttcctcgtgaaggtgtctttgtttcaaatggcacacactggtttgtaacacaaaggaatttttatgaaccacaaatcattactacagacaacacatttgtgtctggtaactgtgatgttgtaataggaattgtcaacaacacagtttatgatcctttgcaacctgaattagactcattcaaggaggagttagataaatattttaagaatcatacatcaccagatg)所示；所述m蛋白的编码基因的核酸序列如seq id no：2(atggcagattccaacggtactattaccgttgaagagcttaaaaagctccttgaacaatggaacctagtaataggtttcctattccttacatggatttgtcttctacaatttgcctatgccaacaggaataggtttttgtatataattaagttaattttcctctggctgttatggccagtaactttagcttgttttgtgcttgctgctgtttacagaataaattggatcaccggtggaatttctaccgcaatggcttgtcttgtaggcttgatgtggctcagctacttcattgcttctttcagactgtttgcgcgtacgcgttccatgtggtcattcaatccagaaactaacattcttctcaacgtgccactccatggcactattctgaccagaccgcttctagaaagtgaactcgtaatcggagctgtgatccttcgtggacatcttcgtattgctggacaccatctaggacgctgtgacatcaaggacctgcctaaagaaatcactgttgctacatcacgaacgctttcttattacaaattgggagcttcgcagcgtgtagcaggtgactcaggttttgctgcatacagtcgctacaggattggcaactataaattaaacacagaccattccagtagcagtgacaatattgctttgcttgtacagtaa)所示；所述n蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no：3(atgtctgataatggaccccaaaatcagcgaaatgcaccccgcattacgtttggtggaccctcagattcaactggcagtaaccagaatggagaacgcagtggggcgcgatcaaaacaacgtcggccccaaggtttacccaataatactgcgtcttggttcaccgctctcactcaacatggcaaggaaggccttaaattccctcgaggacaaggcgttccaattaacaccaatagcagtccagatgaccaaattggctactaccgaagagctaccagacgaattcgtggtggtgacggtaaaatgaaagatctcagtccaagatggtatttctactacctaggaactgggccagaagctggacttccctatggtgctaacaaagacggcatcatatgggttgcaactgagggagccttgaatacaccaaaagatcacattggcacccgcaatcctgctaacaatgctgcaatcgtgctacaacttcctcaaggaacaacattgccaaaaggcttctacgcagaagggagcagaggcggcagtcaagcctcttctcgttcctcatcacgtagtcgcaacagttcaagaaattcaactccaggcagcagtatgggaacttctcctgctagaatggctggcaatggctgtgatgctgctcttgctttgctgctgcttgacagattgaaccagcttgagagcaaaatgtctggtaaaggccaacaacaacaaggccaaactgtcactaagaaatctgctgctgaggcttctaagaagcctcggcaaaaacgtactgccactaaagcatacaatgtaacacaagctttcggcagacgtggtccagaacaaacccaaggaaattttggggaccaggaactaatcagacaaggaactgattacaaacattggccgcaaattgcacaatttgcccccagcgcttcagcgttcttcggaatgtcgcgcattggcatggaagtcacaccttcgggaacgtggttgacctacacaggtgccatcaaattggatgacaaaga
tccaaatttcaaagatcaagtcattttgctgaataagcatattgacgcatacaaa)所示。
28.在本发明中，所述融合蛋白中三种蛋白的连接顺序不做具体限定，采用已知的三种蛋白的连接方式均可。为了举例说明所述融合蛋白的性能，本发明实施例中，所述融合蛋白按照s
‑
m
‑
n的顺序制备融合蛋白。在本发明中，为了保证所述融合蛋白中各蛋白空间折叠及提高各蛋白的生物学活性，所述融合蛋白中优选在每两个蛋白之间还包括柔性linker。所述柔性linker的氨基酸酸序列为(ggggs)n，其中n为整数，且1≤n≤4。在本发明实施例中，所述柔性linker的氨基酸酸序列优选为ggggsggggsggggs(seq id no:4)。
29.在本发明中，所述融合蛋白的构建方法，优选包括以下步骤：
30.1)以人工合成的融合蛋白的编码基因的核苷酸序列，得到带有酶切位点的融合基因片段；
31.2)将步骤1)中所述带有酶切位点的融合基因片段和基因表达载体分别进行酶切，得到扩增片段和线性表达载体；
32.3)将步骤2)中所述扩增片段和线性表达载体进行连接，得到重组载体；
33.4)将所述重组载体经过原核表达系统重组表达，纯化，得到重组表达的融合蛋白。
34.本发明对基因表达载体的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的基因表达载体的种类即可。在本发明实施例中，所述基因表达载体优选为pet
‑
28a。所述酶切用酶的种类优选为xholⅰ。本发明对所述xholⅰ的酶切的条件没有限制采用本领域所熟知的酶切方法即可。所述酶切后优选采用基因纯化试剂盒进行纯化。得到纯化的扩增片段和线性表达载体后进行连接。所述连接所用的酶优选为t4连接酶。本发明对所述t4连接酶的连接的条件没有限制采用本领域所熟知的连接方法即可。所述重组载体在进行重组表达前，优选进行验证。所述验证的方法优选为将所述重组载体为模板采用所述引物进行扩增、测序，测序结果与目标基因的序列一致，表明成功构建了重组载体。
35.本发明对所述原核表达系统重组表达的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的原核表达系统重组表达的方法即可。重组表达后，优选采用裂解液进行裂解。所述裂解液包括sds lysis buffe。所述裂解液与菌体的体积优选为1:1。本发明对所述纯化的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的纯化方法即可。在本发明实施例中，所述纯化优选用分子筛柱纯化蛋白。所述纯化使用层析柱，所述层析柱为ni
2
金属螯合层析柱。所述层析柱进行纯化的条件没有特殊限制，采用本领域所熟知的纯化方法即可。纯化后得到rostta(de3)pet28a
‑
s
‑
m
‑
n基因工程菌包涵体。
36.本发明提供了一种针对新冠病毒变异毒株delta的喷鼻式疫苗，所述喷鼻式疫苗包括所述融合蛋白和佐剂。
37.在本发明中，所述融合蛋白的浓度优选为0.1～0.2g/l，更优选为0.15g/l。所述佐剂优选为plga。所述plga在所述疫苗中的终浓度优选为1～2mg/ml，更优选为1.2～1.8mg/ml，最优选为1.5mg/ml。所述plga作为佐剂有以下诸多优点：(i)plga拥有良好的生物降解性和生物相容性,(ⅱ)描述的充分的准备和生产方法适用于各种各样的药物，如亲水或疏水分子或大分子，(ⅲ)可减少疫苗抗原的降解，(ⅳ)可持续释放的可能性，(
ⅴ
)可改变表面性质，提供隐形和/或与生物材料更好的相互作用等。
38.在本发明中，所述喷鼻式疫苗的制备方法，优选包括以下步骤：
39.将重组表达的融合蛋白与佐剂混合，得到初乳，再与pva混合，双蒸馏水洗涤后，溶
于tris缓冲液，去除溶剂，得到喷鼻式疫苗。
40.在本发明中，所述佐剂优选为plga。所述佐剂优选以50mg/ml的plga的二氯甲烷溶液形式与融合蛋白混合。所述融合蛋白和plga的质量比有u型按为1:12.5。所述融合蛋白的溶剂优选为pbs溶液。
41.本发明提供了所述融合蛋白在制备针对新冠病毒变异毒株delta的疫苗中的应用。所述疫苗优选为鼻喷式疫苗。所述疫苗的制备方法同上述记载，在此不做赘述。
42.在本发明中，所述鼻喷式疫苗的使用方法如下：将制备的喷鼻式疫苗向鼻腔中喷射即可。
43.下面结合实施例对本发明提供的一种针对新冠病毒变异毒株delta的融合蛋白、喷鼻式疫苗及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
44.实施例1
45.s
‑
m
‑
n蛋白疫苗的制备方法
46.1在uniprot蛋白数据库中找到delta病毒的s、m、n的氨基酸，以s蛋白的5'序列和m蛋白的3'，以及m蛋白5'序列与n蛋白3'序列用柔性linker相连接。所述的linker以甘氨酸g和丝氨酸s构成的(ggggs)3。
47.2将s
‑
m
‑
n蛋白编码基因的5'和3'端以xholⅰ进行酶切，利用t4连接酶pet
‑
28a质粒连接，转化进感受态细胞中，获得s
‑
m
‑
n基因表达质粒，通过单克隆筛选获得稳定表达的重组s
‑
m
‑
n蛋白的细胞株。
48.3将上述细胞株扩大培养，进行分泌表达和纯化，获得纯化的重组的delta s
‑
m
‑
n蛋白。
49.3.1将重组s
‑
m
‑
n蛋白的细胞株接种于50μg/ml卡那霉素的溶菌肉汤培养基(lb)中，37℃，160rpm摇菌过夜，按3％的接种量将基因工程菌菌落接种于lb/kam培养液中，200～300rpm摇菌至od
600
为0.5～0.7时，加入iptg使其终浓度为0.5mm，诱导4～6小时后，2000～4000g在2～6℃离心5～15min，去上清，用对应体积的sds lysis buffer裂解室温混均，4℃裂解。
50.3.2将裂解液置于冰浴下50～55w超声5～20遍，每次超声20～40s，停20～40s，直至菌液不粘稠，12000g 4℃离心10～20min，去上清，得rostta(de3)pet28a
‑
s
‑
m
‑
n基因工程菌包涵体。
51.4利用ni
2
金属螯合层析柱，提纯蛋白，具体条件如下：
52.1)0.05mol/ledta、0.5mol/lnacl溶液100ml；
53.2)2mol/lnacl溶液50ml；
54.3)1mol/lnaoh溶液50ml；
55.4)0.2mol/lniso4溶液50ml；
56.5)平衡缓冲液：50mmol/ltris
‑
hcl，500mmol/lnacl，ph 7.0500ml；
57.6)ni
2
chelating sepharose fastflow 5～10ml；
58.7)重组s
‑
m
‑
n蛋白样品20～50ml；
59.8)洗涤液：50mmol/l咪唑，50mmol/l tris
‑
hcl，500mmol/lnacl，ph 7.0；
60.9)洗脱液：300mmol/l咪唑，50mmol/ltris
‑
hcl，500mmol/lnacl，ph 7.0
61.10)20％乙醇溶液50ml。
62.亲和层析剂为5～10ml；蠕动泵流速为15rpm(约2ml/min)；120s进行收集。
63.5制备s
‑
m
‑
n蛋白疫苗
64.称取100mg plga溶于2ml二氯甲烷中；取s
‑
m
‑
n蛋白溶液，s
‑
m
‑
n蛋白含量8mg，加入2mlpbs；将两溶液两相混合，400rpm磁力搅拌器，2min，形成初乳，加入终浓度2％pva，300bar，2min，双蒸馏水洗涤，溶于10ml tris缓冲液中，室温下搅拌3～5h,使有机溶剂充分挥发，12000rpm 10min离心收集微粒，再用双蒸水洗涤，得到plga疫苗纳米颗粒(plga
‑
s
‑
m
‑
n纳米粉末)。
65.实施例2
66.s
‑
m
‑
n疫苗进行包封率测定以及表征分析观察
67.1纳米颗粒载药和包封率
68.采用bca蛋白定量测定法测定s
‑
m
‑
n蛋白浓度
69.称取10mg上述制备的plga
‑
s
‑
m
‑
n纳米粉末于2ml 0.05mol/l naoh和1％sds的水溶液，离心后检测上清中含有的蛋白量，通过总蛋白减去游离蛋白计算出载药量(参见公式i)和包封率(参见公式ii)分别为8.2％、63.2％。
70.载药量(lc)＝(总蛋白
‑
游离蛋白)/总纳米粒
×
100％公式i；
71.其中，总蛋白为添加的固定质量的总蛋白，游离蛋白为测定s
‑
m
‑
n蛋白的质量；总纳米粒为纳米包裹蛋白的质量；
72.包封率(ee)＝(总蛋白
‑
游离蛋白)/总蛋白
×
100％公式ii
73.其中，总蛋白为添加固定质量的总蛋白，游离蛋白为测定s
‑
m
‑
n蛋白的质量。
74.2纳米颗粒的扫描电镜
75.通过扫描电镜sem观察纳米颗粒的表面形态，扫描电镜见图2，可以看出制备的纳米颗粒呈椭圆形。
76.3s
‑
m
‑
n疫苗纳米颗粒释放度
77.结果如图3所示，本实施例制备的s
‑
m
‑
n疫苗纳米颗粒第一阶段为24h内的快速释放，释放率为13.2％。在第二阶段，在24h后，扩散驱动的s
‑
m
‑
n通过刚性plga核心不断释放。在84h时，s1
‑
e疫苗的累积释放率(参见公式iii)达到63.4％的峰值，释放完全。
78.释放率(％)＝每隔12h测上清蛋白浓度/总蛋白浓度*100％公式iii。
79.实施例3
80.采用实施例1制备的s
‑
m
‑
n蛋白疫苗用于小鼠免疫吸入试验
81.将6～8周龄雌性balb/c小鼠分为2组(s
‑
m
‑
n
‑
plga疫苗颗粒组、阴性对照组)，每组8只小鼠，分别经鼻吸入。将各种疫苗溶解在体积为200μl的pbs中。从小鼠眼眶进行取血，分离血清进行抗体检测。血清样本在
‑
20℃保存至使用。
82.间接elisa法检测免疫小鼠血清中delta特异性igg抗体水平和抗体滴度和。以20μg/ml的s、m或者n蛋白包被elisa板，4℃过夜。用0.05％的pbst洗三次，1％bsa
‑
pbst封闭液封闭，室温孵育1h。0.05％pbst洗5遍，加入200μl稀释后的血清(1：1000稀释)，37℃孵育2h；pbst洗5遍，加入hrp
‑
羊抗小鼠igg(1：100稀释)，200μl/孔，室温孵育1h；pbst洗5遍，加入200μl底物液，室温避光孵育20分钟显色后，加50μl终止液终止，在od
450nm
读数。
83.如图4所示，实验组od
450nm
高于对照组。结果表明，本实施例提供的s
‑
m
‑
n疫苗免疫
小鼠后，在小鼠体内诱生了高水平的delta特异性血清igg，显著高于对照组。
84.实施例4
85.细胞因子检测
86.采用elisa对小鼠脾细胞(实施例3处理小鼠)进行测定免疫细胞因子表达情况，同时测定阴性对照组的免疫细胞因子水平。
87.结果表明，小鼠实验组脾脏细胞cd4

t细胞、cd8

t细胞显著增加，il
‑
2也有显著变化(见图5)，与对照组相比显著增加。结果表明，在本发明的s
‑
m
‑
n蛋白疫苗的刺激下，小鼠产生了强烈的细胞免疫应答。
88.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。