蜂蜜中植物毒素的高通量检测方法与流程

1.本发明涉及蜂蜜筛查领域，尤其涉及一种蜂蜜中植物毒素的高通量检测方法。


背景技术：

2.蜂蜜是蜂蜜从开花植物的花中采得的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，在蜂巢中酿制的天然甜物质。蜂蜜是一种药食同源的食品，蜂蜜的成份除了葡萄糖、果糖之外还含有各种维生素、矿物质、氨基酸及多种酶类等，新鲜成熟的蜂蜜为透明或半透明的粘稠状液体，味甜纯正，具有滋养、润燥、解毒、美白养颜、润肠通便之功效。现有蜂蜜经常会含有药物等杂质，使得蜂蜜的食用变得不太安全。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种蜂蜜中植物毒素的高通量检测方法，以解决现有蜂蜜食用不安全的问题。
4.为了实现上述发明目的，本发明的一方面，提供了一种蜂蜜中植物毒素的高通量检测方法，包括：向蜂蜜中加水稀释、搅拌均匀得到蜂蜜溶液；
5.用乙腈对蜂蜜溶液进行提取处理，得到提取液；
6.对提取液进行净化处理，得到净化液；
7.采用高效液相色谱
‑
串联质谱对净化液进行定量测定，得到蜂蜜中的植物毒素残留量。
8.实施本发明，能够得到以下有益效果：
9.实施本发明蜂蜜中植物毒素的高通量检测方法，可以提前筛选出不安全的蜂蜜，避免食用，提高了蜂蜜食用的安全性。
具体实施方式
10.为了使本技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
11.本技术中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b的情况。其中a，b可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
12.本技术中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a
‑
b(即a和b),a
‑
c,b
‑
c,或a
‑
b
‑
c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
13.应理解，在本技术的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内
在逻辑确定，而不应对本技术实施例的实施过程构成任何限定。
14.在本技术实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本技术。在本技术实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、
“”
和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
15.本技术实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本技术实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本技术实施例说明书公开的范围之内。具体地，本技术实施例说明书中的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
16.本发明实施例提供了一种蜂蜜中植物毒素的高通量检测方法，包括：
17.向蜂蜜中加水稀释、搅拌均匀得到蜂蜜溶液；
18.用乙腈对蜂蜜溶液进行提取处理，得到提取液；
19.对提取液进行净化处理，得到净化液；
20.采用高效液相色谱
‑
串联质谱对净化液进行定量测定，得到蜂蜜中的植物毒素残留量。
21.在本实施例中，用quechers对所述蜂蜜溶液进行净化处理。
22.在本实施例中，定量测定的方法包括外标法。
23.在本实施例中，植物毒素包括：雷公藤次碱、雷公藤春碱、雷酚内酯、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素、克氏千里光宁、倒千里光碱、千里光宁、千里光菲林、小檗碱和羟基马桑毒内酯中的至少一种。
24.在本实施例中，提取处理的方法包括：称取2g
‑
10g蜂蜜溶液于离心管中，用2
‑
10ml超纯水溶解后，加入15
‑
75ml乙腈，漩涡，得到提取液。
25.在本实施例中，称取2g蜂蜜溶液于离心管中，漩涡持续时间为1min，所述离心的转速为5000rpm，持续时间为10min。
26.在本实施例中，净化处理的方法包括：向提取液中加入1
‑
5g nacl，4
‑
20g无水mgso4，涡旋处理，离心处理，吸取5
‑
25ml上清液于含200
‑
1000mg psa和1200
‑
6000mg无水mgso4的净化管中，再进行至少一次涡旋处理和所述离心处理，得到净化液。
27.在本实施例中，净化处理包括：向提取液中加入1g nacl，4g无水mgso4，涡旋1min，离心5000rpm，吸取5ml上清液于含200mg psa和1200mg无水mgso4的净化管中，涡旋持续1min，在转速5000rpm，离心持续10min。
28.在本实施例中，在进行所述定量测定之前还包括如下步骤：吸取2ml
‑
10ml净化液，用氮气流下吹干，用10％甲醇和90％的0.1％甲酸水溶液定容至1ml
‑
5ml，供高效液相色谱
‑
串联质谱测定。
29.在本实施例中，吸取2ml净化液，在适当的氮气流下吹干，用10％甲醇和90％的0.1％甲酸水溶液定容至1ml，供hplc
‑
ms/ms测定。
30.在实施例中，本发明实施例实施本发明蜂蜜中植物毒素的高通量检测方法，可以提前筛选出不安全的蜂蜜，避免食用，提高了蜂蜜食用的安全性。
31.实施例1
32.1.试剂和材料
33.除非另有规定，本方法所用试剂均为优级纯，水为gb/t6682规定的一级水。所用试
剂临用现配。
34.试剂：甲酸：色谱纯；乙腈：色谱纯；甲醇：色谱纯；氯化钠：分析纯。
35.2.试剂配制
36.0.1％甲酸水溶液：量取1ml甲酸加入1000ml水中，混匀；甲醇水溶液(1 9，体积比)：量取10ml甲醇于90ml水中，混匀。
37.3.标准品
38.雷公藤次碱、雷公藤春碱、雷酚内酯、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素、克氏千里光宁、倒千里光碱、千里光宁、千里光菲林、小檗碱和羟基马桑毒内酯，纯度大于98％。
39.4.标准溶液配制：
40.标准储备液(1mg/ml)：分别准确称取10mg(精确到0.01mg)雷公藤次碱、雷公藤春碱、雷酚内酯、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素、克氏千里光宁、倒千里光碱、千里光宁、千里光菲林、小檗碱和羟基马桑毒内酯，用甲醇分别溶解定容至10ml。
41.标准使用液(100.0ng/ml)：分别准确吸取上述1mg/ml标准储备液各0.1ml至100ml容量瓶中，用甲醇定容刻度，配制成浓度为100ng/ml的混合标准工作液。
42.5.材料
43.psa固相萃取填料；c18固相萃取填料；聚丙烯离心管：15ml。
44.6.仪器设备
45.液相色谱
‑
三重四极杆质谱联用仪，配有电喷雾离子源；电子天平：感量为0.01g和0.0001g；高速离心机；涡漩混合器；均质机；超声波清洗仪；氮吹仪。
46.7.分析步骤
47.仪器参考条件
48.液相色谱参考条件
49.(a)色谱柱：agilent poroshell 120c18柱(100mm
×
2.1mm，2.7μm)；(b)流动相分别采用a为0.1％的甲酸水溶液，b为乙腈，采用的梯度洗脱：0～5min，5％～50％b；5～10min，50％～70％b；10～12min，70％b，12～17min 70％～5％b；17～25min，5％b；
50.(d)流速：0.3ml/min；
51.(e)进样量：10μl；
52.质谱仪参考条件
53.(a)离子源：电喷雾离子源(esi)。
54.(b)毛细管电压：1.5kv；离子源温度：150℃；脱溶剂温度：400℃；
55.(c)扫描方式：正离子扫描；
56.(d)检测方式：多反应检测(mrm)；
57.(e)锥孔电压、碰撞能量等电压值应优化至最优灵敏度；
58.(f)定性离子对、定量离子对，锥孔电压及碰撞能量见表1。
59.表1目标化合物的主要参考质谱参数
[0060][0061]
其中，*为定量离子。
[0062]
8.分析结果的表述
[0063]
试样中生物碱的含量按式(1)计算
[0064]
式中：x——试样中目标化合物的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；c——试样中目标化合物在标准曲线中对应的质量浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；v——试样待测液的定容体积，单位为毫升(ml)；
[0065]
m——样品质量，单位为克(g)；计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留2位有效数字(或小数点后2位)。
[0066]
9.检出限
[0067]
本方法条件下，蜂蜜中荷叶碱和雷公藤春碱的检出限为1.0μg/kg，定量限为3.0μg/kg。其余9种化合物的检出限为0.1μg/kg，定量限为0.3μg/kg。
[0068]
样品提取
[0069]
称取2g(精确至0.01g)蜂蜜样品于15ml离心管中，用2ml超纯水溶解后，加入15ml乙腈，涡旋1min，之后加入1g nacl，4g无水mgso4，涡旋1min，5000rpm离心10min。吸取5ml上清液于含200mg psa和1200mg无水mgso4的净化管中，涡旋1min，5000rpm离心10min。准确吸取2ml上清液，在适当的氮气流下吹至近干，用10％甲醇 90％(0.1％甲酸水溶液)定容至1ml，供hplc
‑
ms/ms测定。
[0070]
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。