一种快速鉴定水稻GAT植株的多重PCR检测试剂盒及应用的制作方法

一种快速鉴定水稻gat植株的多重pcr检测试剂盒及应用
技术领域
1.本发明属基因工程领域，具体涉及一种快速鉴定水稻gat植株的多重pcr检测试剂盒及其在检测gat系统中花粉败育基因表达盒、抗除草剂基因表达盒、除草剂敏感基因表达盒和荧光基因表达盒中的应用。


背景技术：

2.水稻是我国最重要的口粮作物，在保证我国粮食安全方面具有重要意义。杂交水稻利用水稻的杂种优势提高了水稻品种的产量、抗性、适应性等综合性状，使我国的水稻单产提高了15％-20％，为保障国家粮食安全作出了重要贡献。自从上世纪70年代杂交水稻推广应用以来，杂交水稻育制种技术已经经历了数代的发展(袁隆平.第三代杂交水稻初步研究成功.科学通报,2016,61(31):3404.)。
3.第一代杂交水稻育制种技术于70年代开发利用,需要用到不育系、保持系和恢复系等三种材料，因此也被称为“三系法”。用“三系法”进行杂交水稻种子生产时，首先用保持系和不育系杂交生产不育系，再用恢复系与不育系杂交生产杂交种。保持系自交可以繁殖保持系。三系不育系的雄性不育是由细胞核与细胞质的基因互作造成，只有细胞核含有特定恢复基因的恢复系与不育系杂交后才能恢复杂交后代的育性以生产杂交水稻，不具有恢复基因的品种与不育系杂交后将导致杂交后代不育从而导致绝收。只有约5％品种资源能够作为三系不育系的恢复系，种质资源利用率低。
4.第二代杂交水稻育制种技术始于80年代,需要用到不育系和恢复系，因此也被称为“两系法”。两系不育系的育性受到细胞核基因和光温环境的共同调控。一般其在特定光温条件下可以自交繁殖，否则保持不育，可以用来与恢复系杂交生产杂交种。两系不育系虽然可以“一系两用”，但其育性转换受到光温环境的影响，制种时易因光温环境而改变导致失败。
5.2006年，美国杜邦先锋公司率先在玉米中实现了基于隐性核雄性不育材料的杂交种子生产。该技术的基本原理是将育性恢复基因、花粉败育基因和筛选标记基因紧密连锁地导入隐性核雄性不育突变体中，获得核雄性不育突变体的保持材料，用于制种和育种(albertsen mc,fox tw,hershey hp,et al.nucleotide sequences mediating plant male fertility and method of using same.patent no.wo2007002267,2006.)。隐性核雄性不育系的育性仅由一对隐性核基因控制，因此其育性不受光温环境影响，并且任何品种都可以作为其恢复系与其杂交产生可育后代。该技术不但能最大限度的利用品种资源选育出高产、优质、多抗品种，还能不受光温环境的影响实现杂交种的高纯度稳定繁制,因此,从根本上解决了第一代和第二代杂交水稻育制种技术的问题，被誉为第三代杂交育制种技术(袁隆平.杂交水稻发展的战略.杂交水稻,2018,33(5):1
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2.)。
6.为了实现利用水稻隐性核雄性不育系进行育制种，我们研发了属于第三代水稻杂交育制技术的遗传智能技术(genetic automation technology，gat)。我们构建了gat载体，将植物雄性育性恢复基因表达盒、植物花粉败育基因表达盒，抗除草剂基因表达盒，除
草剂敏感基因表达盒，荧光基因表达盒构建到gat载体上并转化到不育突变体中创制gat保持系。为了加强对gat保持系的筛选和监管，开发出一种适合gat植株的快速、高效、特异的多重pcr检测试剂盒非常有必要。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种快速鉴定带有gat载体植物的方法，以检测转基因植物及其自交、回交和杂交后代中是否含有gat载体或gat载体上的表达盒killer 5400、killer、marker 2 aau、marker 2 uau、marker 1或/和marker 3 zfn。
8.所述植物包括但不限于水稻、玉米、小麦、高粱、油菜等。
9.本发明首先构建了gat载体，并通过遗传转化获得了带有gat载体的转基因植株。
10.所述gat载体为含有以下任一或多个表达盒的载体：
11.(1)植物雄性育性恢复基因表达盒，用于恢复雄性育性；该表达盒为complementation(seq id no.11)
12.(2)植物花粉败育基因表达盒，用于清除含gat的花粉及保持gat保持系的杂合状态；该表达盒为killer 5400(seq id no.12)或killer(seq id no.13)；
13.(3)抗除草剂基因表达盒，用于基因转化及gat保持系除杂提纯；该表达盒为marker 2 aau(seq id no.14)或marker 2 uau(seq id no.15)；
14.(4)除草剂敏感基因表达盒，用于清除除草剂敏感的gat保持系花粉、种子及gat不育系除杂提纯；该表达盒为marker 1，其核苷酸序列如seq id no.16所示；
15.(5)荧光基因表达盒，用于种子机械分选；该表达盒为marker 3 zfn，其核苷酸序列如seq id no.17所示。
16.优选的，所述gat载体中上述表达盒被装载到空载体pc1300(图1)，pc0308(图2)或pc0309(图3)上。
17.优选的，所述gat载体为pc1300-mmck(图4)、pc0308-mmck(图5)、pc0309-mmck(图6)、pc0308-mmmaauck5400(图7)、pc0308-mmmuauck5400(图8)。其中pc1300-mmck、pc0308-mmck、pc0309-mmck均含有complementation、killer和marker 1表达盒，pc0308-mmmaauck5400和pc0308-mmmuauck5400均含有complementation、killer5400、marker 1、marker 3 zfn表达盒，pc0308-mmmaauck5400和pc0308-mmmuauck5400还分别含有marker 2 aau和marker 2 uau表达盒。
18.通过将本发明的gat载体导入植物隐性核雄性不育系中，可以实现隐性核雄性不育系的大规模生产，并利用对除草剂抗、感的差异和荧光信号的有无实现对gat保持系和不育系植株以及种子的规模化和机械化分选，从而建立植物隐性核雄性不育系的第三代育制种系统。
19.为了对gat转基因植株及其自交、回交和杂交后代中的gat载体及其上的表达盒进行阳性检测、表达量检测、拷贝数检测，为gat植株筛选及转基因安全检测提供有效手段，本发明提供了检测gat植株的试剂盒和方法。
20.本领域技术人员知晓，利用农杆菌或基因枪等现有遗传转化技术产生水稻转基因植株时，很大比例的转化植株并不带有完整的外源转基因片段。在利用gat载体转化受体植株时，也会产生很多只带有部分gat载体表达盒的植株，需要尽早淘汰。另外，育性、种子荧
光等性状要到开花结实后才能观察。因此，为了帮助育种家在种子期或苗期就能准确鉴定转基因植物及其自交、杂交、回交后代是否含有gat载体上所有的表达盒，本技术开发了同时检测killer 5400、killer、marker 2 aau、marker 2 uau、marker 1和marker 3 zfn表达盒的方法和试剂盒，对帮助快速、高效鉴定gat载体上表达盒的完整性具有非常现实的应用价值的。
21.本发明首先根据所述gat载体中的表达盒序列(seq id no.12-17)设计并筛选出一种鉴定水稻gat植株的特异性引物组合，含有引物killer-f(seq id no.1)和killer-r(seq id no.2)，marker2-f(seq id no.3)和marker2-r(seq id no.4)、marker1-f(seq id no.5)和marker1-r(seq id no.6)、marker3-f(seq id no.7)和marker3-r(seq id no.8)中任一对或多对的特异性引物对；
22.所述特异性引物组合中还含有一对根据gapdh基因(seq id no.18)的序列设计并筛选出的内参引物gapdh-f(seq id no.9)和gapdh-r(seq id no.10)。
23.本发明提供了上述特异性引物组合在检测转基因表达盒及其表达量和拷贝数中的应用，所述的转基因表达盒为killer 5400、killer、marker 2 aau、marker 2 uau、marker 1和marker 3 zfn，其核苷酸序列分别如seq id no.12-17所示。
24.含有上述特异性引物组合的试剂盒属于本发明的保护范围。
25.进一步地，所述的试剂盒为以下任一试剂盒：
26.(1)植物花粉败育基因表达盒killer 5400及killer检测试剂盒；所述表达盒killer 5400及killer的核苷酸序列如seq id no.12和seq id no.13所示；其含有核苷酸序列如seq id no.1-2所示的引物；
27.(2)抗除草剂基因表达盒marker 2 aau、marker 2 uau检测试剂盒；所述表达盒marker 2 aau和marker 2 uau的核苷酸序列如seq id no.14和seq id no.15所示；其含有核苷酸序列如seq id no.3-4所示的引物；
28.(3)除草剂敏感基因表达盒marker 1检测试剂盒；所述表达盒marker 1的核苷酸序列如seq id no.16所示；其含有核苷酸序列如seq id no.5-6所示的引物；
29.(4)荧光基因表达盒marker 3 zfn检测试剂盒；所述表达盒marker 3 zfn的核苷酸序列如seq id no.17所示；其含有核苷酸序列如seq id no.7-8所示的引物；
30.(5)内参基因gapdh检测试剂盒；所述gapdh基因的核苷酸序列如seq id no.18所示；其含有核苷酸序列如seq id no.9-10所示的引物；内参基因的扩增用于killer 5400、killer、marker 2 aau、marker 2 uau、marker 1和marker 3 zfn等表达盒表达量及拷贝数检测。
31.(6)用于检测gat载体的试剂盒，其含有5对引物，其核苷酸序列分别如seq id no.1-10所示。
32.为了达到更好的检测效果，优选的，本发明试剂盒还包括有阴性对照野生型水稻dna、阴性对照ddh2o、和阳性对照gat载体。
33.本发明进一步提供了上述特异性引物组合、所述的试剂盒在快速检测水稻gat植株中的应用。
34.本发明进一步提供了上述特异性引物组合、所述的试剂盒在转基因植物安全评价中的应用。
35.本发明还提供了一种同时检测转基因植物中转基因元件killer 5400或killer、marker 2 aau或marker 2 uau、marker 1和marker 3 zfn的多重pcr方法，其包括提取待测转基因植物样品的dna，将seq id no.1-2、seq id no.3-4、seq id no.5-6、seq id no.7-8、seq id no.9-10所示的引物加入多重pcr反应体系中，进行多重pcr反应，反应结束后对反应液进行sds-page电泳分析以确定样品中是否含有killer 5400或killer、marker 2 aau或marker 2 uau、marker 1和/或marker 3 zfn。
36.所述多重pcr反应按以下降落pcr步骤进行：
37.(1)95℃预变性5min；
38.(2)95℃变性30s；60-55℃，每个循环降低0.5℃，退火30s，72℃延伸30s，进行10个循环；55℃退火30s，72℃延伸30s，进行25个循环；
39.(3)72℃延伸10min；
40.所述多重pcr反应在总体积20μl的反应体系中进行。
41.所述pcr反应体系中包含终浓度为1
×
的taq pcr mix(北京康为世纪生物科技有限公司)，0.5μm的各种引物，10％的dmso，还包括1μl阴性对照、阳性对照或50ng/μl待测植物基因组总dna，用无菌水补足20μl。
42.所述taq pcr mix(北京康为世纪生物科技有限公司)是taq plus dna polymerase、mg2 、dntps以及pcr稳定剂和增强剂组合的预混合系。
43.电泳条件为1
×
tbe、6％page胶、180v电压条件下电泳50min。
44.本发明的上述方法，电泳检测后，观察结果：
45.如果从待检测的样品中扩增到了70bp的扩增产物，则该检测样品为荧光基因表达盒marker 3 zfn；
46.如果从待检测的样品中扩增到了80bp的扩增产物，则该检测样品带有除草剂敏感基因表达盒marker 1；
47.如果从待检测的样品中扩增到了89bp的扩增产物，则该检测样品带有抗除草剂基因表达盒marker 2 aau或marker 2 uau；
48.如果从待检测的样品中扩增到了120bp的扩增产物，则该检测样品带有植物花粉败育基因表达盒killer 5400或killer。
49.本发明的有益效果至少体现在以下方面：
50.1、gat载体上的基因表达盒是人工设计和构建的核苷酸序列，需要设计新的引物进行检测。本发明提供的试剂盒不但为gat载体及带有gat载体的植物材料的检测提供了手段，还可以同时对多个表达盒进行检测。与只对单个表达盒检测相比提高了检测效率和准确性，反映了gat转基因的完整性，可以加快gat植株的选择。
51.2、本发明中的多重pcr试剂盒可对质粒dna、小量提取水稻叶片dna、快提水稻叶片dna、快提水稻种子dna、等多种样品的进行快速检测，样品适用范围广，试剂盒提供的试剂中，无感染性、无生物安全隐患成分，使用安全性很高。
52.3、本发明提供的试剂盒还可用于killer 5400、killer、marker 2 aau、marker 2 uau、marker 1和marker 3 zfn等表达盒的qrt-pcr分析和拷贝数检测，为gat植株的后续分析提供了有效工具。
附图说明
53.图1：pc1300的图谱。
54.图2：pc0308的图谱。
55.图3：pc0309的图谱。
56.图4：gat载体pc1300-mmck的图谱。
57.图5：gat载体pc0308-mmck的图谱。
58.图6：gat载体pc0309-mmck的图谱。
59.图7：gat载体pc0308-mmmaauck5400的图谱。
60.图8：gat载体pc0308-mmmuauck5400的图谱。
61.图9：多重引物pcr检测体系的建立和优化。泳道1，双蒸水；泳道2，野生型中花11基因组dna；泳道3-30，pc0308-mmmaauck5400质粒。killer-f-r、marker2-f-r、marker1-f-r和marker3-f-r四对引物分别扩出120bp、89bp、80bp和70bp条带，分别对应killer 5400、marker 2 aau、marker 1和marker 3 zfn表达盒。
62.图10：利用多重pcr试剂盒检测t0代转基因植株中转基因片段的完整性。泳道1-30分别代表不同的t0代转基因单株。killer 5400、marker 2 aau、marker 1和marker 3 zfn分别标示各自对应的pcr特征条带。
63.图11：使用多重pcr试剂盒检测快提法提取的模板dna。泳道m，100bp dna marker；泳道1，灭菌水；泳道2，中花11基因组dna；泳道3，pc0308-mmmaauck5400质粒；泳道4、6、8、10，1号植株叶片dna；泳道5、7、9、11，1号植株种子dna；泳道12，2号植株叶片dna；泳道13，2号植株种子dna；泳道14，3号植株叶片dna；泳道15，3号植株种子dna。泳道4-5，加入marker3-f-r引物对；泳道6-7，加入marker1-f-r引物对；泳道8-9，加入marker2-f-r引物对；泳道10-11，加入killer-f-r引物对；其余泳道，加入killer-f-r、marker2-f-r、marker1-f-r和marker3-f-r引物对。killer-f-r、marker2-f-r、marker1-f-r和marker3-f-r四对引物分别扩出120bp、89bp、80bp和70bp条带，分别对应killer 5400、marker 2 aau、marker 1和marker 3 zfn表达盒。
64.图12：用多重pcr试剂盒检测基因表达盒的表达量。
65.a图为泳道m为d2000 dna marker，泳道1为中花11总rna电泳结果，泳道2为1号植株总rna电泳结果。
66.b图为泳道1和3分别为gapdh-f-r扩增中花11和1号植株cdna的结果，泳道2和4为killer-f-r、marker2-f-r、marker1-f-r和marker3-f-r同时扩增野生型中花11和1号植株cdna的结果。
具体实施方式
67.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
68.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
69.实施例1 gat载体的构建及gat植株的获得
70.gat载体由下列五种基因表达盒中的若干个通过接头序列连接构建于植物双元表达载体中得到，所述五种基因表达盒分别为：
71.(1)植物雄性育性恢复基因表达盒，由启动子、雄性育性恢复基因编码区及终止子依序连接而成。本实施例的植物雄性育性恢复基因表达盒complementation，其核苷酸序列如seq id no.11所示，启动子为水稻oscyp704b2基因起始密码子atg上游1112bp序列，编码区为经密码子优化的oscyp704b2基因的编码区，终止子为oscyp704b2基因终止密码子tga下游274bp序列。该表达盒的作用是恢复oscyp704b2基因的隐性纯合突变体oscyp704b2的雄性育性。。
72.(2)植物花粉败育基因表达盒，由植物花粉特异启动子、败育基因编码区及终止子依序连接而成。本实施例所述的一个植物花粉败育基因表达盒是killer 5400，由启动子pg47、经密码子优化的osaa(5400)编码区和终止子nos组成，如序列seq id no.12所示。本实施例所述的另一个植物花粉败育基因表达盒是killer，由启动子pg47、经密码子优化的zm-aa1编码区和终止子in2-1组成，序列如seq id no.13所示。所述表达盒的作用是使得含gat转基因的花粉败育，用于维持gat转化株或者gat保持系的杂合状态及防止gat转基因漂移。
73.(3)抗除草剂基因表达盒，由启动子、除草剂抗性基因编码区及终止子依序连接而成。本实施例所述的一个抗除草剂基因表达盒是marker 2 aau，由osals的启动子、经密码子优化的osals编码区osalsm1和osubi终止子组成，序列如seq id no.14所示。另一个抗除草剂基因表达盒是marker 2 uau，由osubi的启动子、osalsm1和osubi终止子组成，序列如seq id no.15所示。该表达盒的作用是提供基因转化筛选的抗性及区分gat保持系和不育系。
74.(4)除草剂敏感基因表达盒，由启动子、除草剂显性敏感元件及终止子依序连接而成。本实施例的除草剂敏感基因表达盒marker 1由zmubi启动子，细胞色素p450基因cyp81a6的rnai结构序列，nos终止子组成，核苷酸序列如seq id no.16所示。该元件的作用是防止gat转基因漂移、去除gat植物对非转基因植物的污染。
75.(5)荧光基因表达盒，由种子特异性启动子、荧光基因及终止子依序连接而成；本实施例的荧光基因表达盒marker 3 zfn由zz1启动子、经密码子优化的深红色荧光蛋白基因fp635编码区和nos终止子组成，序列如seq id no.17所示。该元件的作用是区分gat保持系种子与gat不育系或gat杂交种。
76.上述五种表达盒通过接头序列紧密连锁地构建到空载体pc1300(见图1)、pc0308(见图2)和/或pc0309(见图3)上，得到gat载体。
77.所述gat载体为pc1300-mmck(图4)、pc0308-mmck(图5)、pc0309-mmck(图6)
78.pc0308-mmmaauck5400(图7)、pc0308-mmmuauck5400(图8)。其中pc1300-mmck、pc0308-mmck、pc0309-mmck均含有complementation、killer和marker 1表达盒，pc0308-mmmaauck5400和pc0308-mmmuauck5400均含有complementation、killer5400、marker 1、marker 3 zfn表达盒，pc0308-mmmaauck5400和pc0308-mmmuauck5400还分别含有marker 2 aau和marker 2 uau表达盒。
79.本实施例所述gat载体pc1300-mmck(图4)、pc0308-mmck(图5)、pc0309-mmck(图6)均同时含有complementation、killer和marker 1表达盒。此外还包含另一种抗除草剂基因表达盒。
80.本实施例所述gat载体pc0308-mmmaauck5400(图7)、pc0308-mmmuauck5400(图8)
均同时含有complementation、killer5400、marker 1、marker 3 zfn表达盒，此外pc0308-mmmaauck5400和pc0308-mmmuauck5400还分别含有marker 2 aau和marker 2 uau表达盒。
81.通过标记辅助选择的方法将oscyp704b2导入到水稻品种中花11中，获得中花11的隐性核雄性不育系。
82.通过根癌农杆菌介导的遗传转化法将所述gat载体pc1300-mmck、pc0308-mmck、pc0309-mmck、pc0308-mmmaauck5400、pc0308-mmmuauck5400分别转入所述中花11雄性不育材料中，并再生获得t0代gat转基因植株。
83.筛选单拷贝的gat植株作为gat保持系。gat保持系自交结实可获得1:1分离的gat保持系和gat不育系(所述中花11雄性不育材料)种子，两种种子通过荧光基因表达盒提供的荧光标记实现分选，从而实现gat保持系的自我繁殖。gat保持系向gat不育系授粉使得不育系结实并保持其后代的雄性不育性，从而实现隐性雄性核不育系的繁殖。除草剂抗性基因和敏感基因表达盒提供的除草剂抗、感差异用来筛选gat保持系和gat不育系植株。
84.本发明提供的gat载体中的5个基因表达盒有机结合发挥作用并结合机械化、自动化加工可成功实现植物隐性核雄性不育系的商业化利用。本发明gat载体可应用于植物隐性核不育材料的杂交育种和杂交制种，从而获得优质高产广适高抗植物新品种及其种子。
85.实施例2 gat载体检测特异性引物的设计和筛选
86.根据实施例1所构建gat载体上各基因表达盒的dna序列，利用primer premier 5软件进行pcr引物设计。检测killer 5400(seq id no.12)和killer(seq id no.13)表达盒的引物，以及检测marker 2 aau(seq id no.14)和marker 2 uau(seq id no.15)表达盒的引物分别针对两对表达盒的共有序列设计。检测marker 1(seq id no.16)和marker 3 zfn(seq id no.17)的引物各自基于其特异序列设计。每个表达盒的检测引物均设计数对，预测扩增片段的长度从70bp到206bp不等。根据各种pcr条件下的扩增效果筛选出4对最优引物。其中用于killer 5400或killer检测的引物killer-f和killer-r分别具有如seq id no.1和seq id no.2所示的核苷酸序列，可以扩增出一条120bp的条带。用于marker 2 aau或marker 2 uau检测的引物marker2-f和marker2-r分别具有如seq id no.3和seq id no.4所示的核苷酸序列，可以扩增出一条89bp的条带。用于marker 1检测的引物marker1-f和marker1-r分别具有如seq id no.5和seq id no.6所示的核苷酸序列，可以扩增出一条80bp的条带。用于marker 3 zfn检测的引物marker3-f和marker3-r分别具有如seq id no.7和seq id no.8所示的核苷酸序列，可以扩增出一条70bp的条带。
87.此外，还根据水稻gapdh基因的dna序列设计了内参引物gapdh-f和gapdh-r，核苷酸序列分别如seq id no.9和seq id no.10所示，可以扩增出一条80bp的条带。gapdh的引物用于在检测各表达盒的表达量时检测内参基因gapdh的表达量。
88.实施例3多重pcr检测体系的建立
89.1、建立单表达盒的pcr检测体系
90.每个pcr反应配制20μl的反应体系，其中包含终浓度为1
×
的taq pcr mix(北京康为世纪生物科技有限公司)，0.5μm的各种引物，10％的dmso，还包括1μl模板，用无菌水补足20μl。
91.设置两个阴性对照，分别使用双蒸水和50ng/μl的水稻品种中花11叶片基因组dna作为模板，都同时加入killer-f-r、marker2-f-r、marker1-f-r以及marker3-f-r四对引物。
其余表达盒检测均加入pc0308-mmmaauck5400质粒为模板，但分别加入killer-f-r、marker2-f-r、marker1-f-r或marker3-f-r中的一对引物。表达盒的检测均设置2个技术重复。
92.pcr反应程序按以下步骤进行：
93.(1)95℃预变性5min；
94.(2)95℃变性30s；60-55℃，每个循环降低0.5℃，退火30s，72℃延伸30s，进行10个循环；55℃退火30s，72℃延伸30s，进行25个循环；
95.(3)72℃延伸10min；16℃保存。
96.反应结束后，pcr产物使用sds-page电泳，电泳条件为1
×
tbe，6％page胶，180v电压条件下电泳50min，银染显影。
97.检测结果如图9的泳道1-10所示。泳道1和2分别为双蒸水和中花11基因组dna的扩增结果，均未扩增出条带，说明killer-f-r、marker2-f-r、marker1-f-r以及marker3-f-r四对引物均不对水稻基因组dna产生非特异扩增。泳道3和4为marker3-f-r引物对的扩增结果，扩出了一条70bp的条带。泳道5和6为marker1-f-r引物对的扩增结果，扩出了一条80bp的条带。泳道5和6为marker1-f-r引物对的扩增结果，扩出了一条80bp的条带。泳道7和8为marker2-f-r引物对的扩增结果，扩出了一条89bp的条带。泳道9和10为killer-f-r引物对的扩增结果，扩出了一条120bp的条带。所有对表达盒进行检测的扩增结果均与预期相符，说明引物对目标表达盒具有很好的特异性扩增。
98.2、建立表达盒的双重pcr检测体系
99.双重pcr反应体系的配制和设置参照单表达盒的pcr检测体系，不同的是在以pc0308-mmmaauck5400质粒为模板的反应体系中加入killer-f-r、marker2-f-r、marker1-f-r和marker3-f-r四对引物中的任意两对引物进行扩增。pcr程序和电泳条件与单表达盒的pcr检测体系相同。
100.扩增结果如图9泳道11-20所示。泳道11和12为marker3-f-r和marker1-f-r引物对的扩增结果，扩出了一条70bp和一条80bp的条带。泳道13和14为marker3-f-r和marker2-f-r引物对的扩增结果，扩出了一条70bp和一条89bp的条带。泳道15和16为marker3-f-r和killer-f-r引物对的扩增结果，扩出了一条70bp和一条120bp的条带。泳道17和18为marker1-f-r和marker2-f-r引物对的扩增结果，扩出了一条80bp和一条89bp的条带。泳道19和20为marker1-f-r和killer-f-r引物对的扩增结果，扩出了一条80bp和一条120bp的条带。所有扩增条带的大小均与预期相符，说明在两对引物同时存在的条件下，各引物依然能对目标表达盒进行特异性扩增。
101.3、建立表达盒的三重pcr检测体系
102.三重pcr反应体系的配制和设置参照单表达盒的pcr检测体系，不同的是在以pc0308-mmmaauck5400质粒为模板的反应体系中加入killer-f-r、marker2-f-r、marker1-f-r和marker3-f-r四对引物中的任意三对引物进行扩增。pcr程序和电泳条件与单表达盒的pcr检测体系相同。
103.扩增结果如图9泳道21-28所示。泳道21和22为marker3-f-r、marker1-f-r和marker2-f-r引物对的扩增结果，扩出了70bp、80bp和89bp条带各一条。泳道23和24为marker3-f-r、marker1-f-r和killer-f-r引物对的扩增结果，扩出了70bp、80bp和120bp条
带各一条。泳道25和26为marker3-f-r、marker2-f-r和killer-f-r引物对的扩增结果，扩出了70bp、89bp和120bp条带各一条。泳道27和28为marker1-f-r、marker2-f-r和killer-f-r引物对的扩增结果，扩出了80bp、89bp和120bp条带各一条。所有扩增条带的大小依然与预期相符，说明在三对引物同时存在的条件下，各引物均能对目标表达盒进行特异性扩增。
104.4、建立表达盒的多重pcr检测体系
105.多重pcr反应体系的配制和设置参照单表达盒的pcr检测体系，不同的是在以pc0308-mmmaauck5400质粒为模板的反应体系中同时加入killer-f-r、marker2-f-r、marker1-f-r和marker3-f-r四对引物进行扩增。pcr程序和电泳条件与单表达盒的pcr检测体系相同。
106.扩增结果如图9泳道29-30所示，marker3-f-r、marker1-f-r、marker2-f-r和killer-f-r四对引物同时扩出了70bp、80bp、89bp和120bp条带各一条，带型清晰明亮，大小与预期相符，说明在四对引物可以同时工作而不产生相互干扰。
107.实施例4利用多重pcr检测试剂盒检测转基因t0代植株中转化片段的完整性
108.对实施例1中获得的1-30号30棵pc0308-mmmaauck5400载体转基因t0植株取样检测载体上各表达盒是否均已转入受体植株。
109.转基因植株的基因组dna提取采取小样dna提取法，步骤如下：
110.取2-4cm的叶片放入研钵，加入1.5％ctab溶液800-900μl研磨粉碎。将研磨后的液体转入1.5ml的离心管中，65℃水浴30min，期间颠倒混匀数次。在通风橱中加入氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1)650μl，手摇10min。将摇好的样品在8000-10000rpm离心8min。然后.吸上清400μl转入一新的1.5ml离心管中，加入-20℃预冷的95％乙醇800μl，颠倒混匀，-20℃冰箱冷冻30min后12000rpm离心10min。倒上清，75％乙醇洗沉淀后倒掉乙醇，风干沉淀。加入200μl的灭菌水溶解沉淀待用。
111.提取的dna样品使用nanodrop微量分光光度计测量浓度及od值，od值达到1.8-2.0的dna样品才能进行gat转基因检测。
112.多重pcr的检测体系参照实施例3建立的体系进行，检测结果如图10所示，泳道1-30分别依次显示1-30号t0代pc0308-mmmaauck5400载体转基因植株的检测结果。泳道1-4、10-12、14-15、21-26、29-30均扩出了120bp、89bp、80bp和70bp四条带，表明killer 5400、marker 2 aau、marker 1、marker 3 zfn四个表达盒均已转入相应受体植株，转化的gat片段可能是完整的。泳道5-6均扩出了120bp、89bp和80bp三条带，表明killer 5400、marker 2 aau、marker 1三个表达盒转入了相应受体植株，转化的gat片段可能不完整。泳道7-9、13、16-17没有条带扩出，表明相应受体植株是转基因阴性植株。泳道18-20均扩出了120bp和89bp两条带表明killer 5400和marker 2 aau两个表达盒转入了对应受体植株，转化的gat片段可能不完整。泳道27-28均扩出了120bp、89bp和70bp三条带，表明killer 5400、marker 2 aau、marker 3 zfn三个表达盒转入了对应受体植株，转化的gat片段可能不完整。
113.上述结果表明本发明提供的多重pcr检测试剂盒可以特异性的检测相应的表达盒，从而检测带有相应表达盒的gat载体及转基因植株。
114.实施例5多重pcr反应试剂盒的灵敏性试验
115.为检测该试剂盒对dna模板的敏感性，用该试剂盒对用快提法提取的待测水稻植株叶片或半粒种子基因组dna进行多重pcr检测(赵国珍.一种高效便捷的水稻dna提取法及
其应用.中国水稻科学,2012.26(04):495-499.)。快提法只需4种化学试剂和普通pcr仪或水浴锅，经3步操作即可完成，在0.5h内可提取个96样，每个样试剂成本仅需不到0.1元，方便快捷。但快提法由于并不进行任何纯化，所抽提的dna质量不高，容易降解。
116.快提法具体提取方法为：
117.使用前配制缓冲液a(保持新鲜,现配现用)：800μl 20％tween 20，160μl 5mol/l naoh，7.04ml ddh2o(以整块96孔pcr板计)。缓冲液b：1ml 1mol/l tris-hcl(ph8.0)，40μl 0.5mol/l edta(ph8.0)，8.96ml ddh2o。
118.dna提取步骤
119.1)取新鲜水稻叶片10mg或半粒种子放入200μl 96孔pcr板上，冰上完成叶片取样；
120.2)每孔加入70μl缓冲液a，用带有封口胶的锡箔纸密封，立刻将平板放入pcr仪或水浴锅中95℃孵育10min；
121.3)取出96孔板，迅速加入等体积的缓冲液b，混匀，取1μl作为模板dna进行pcr检测。
122.利用快提法分别抽提实施例4中1-3号植株叶片和种子的基因dna，使用实施3中建立的多重pcr检测体系对上述样品进行检测，检测结果如图11所示。泳道1和2分别显示阴性对照双蒸水和中花11基因组dna的扩增结果，同时加入killer-f-r、marker2-f-r、marker1-f-r以及marker3-f-r并未扩增出条带，说明四对引物均不对水稻基因组dna产生非特异扩增。泳道3为阳性对照pc0308-mmmaauck5400质粒的扩增结果，同时加入killer-f-r、marker2-f-r、marker1-f-r和marker3-f-r扩增出了120bp、89bp、80bp和70bp四条带，表明引物工作正常。泳道4-5分别显示1号植株叶片和种子dna只加marker3-f-r扩增的结果，扩出了70bp特征条带。泳道6-7分别显示1号植株叶片和种子dna只加marker1-f-r扩增的结果，扩出了80bp特征条带。泳道8-9分别显示1号植株叶片和种子dna只加marker2-f-r扩增的结果，扩出了89bp特征条带。泳道10-11分别显示1号植株叶片和种子dna只加killer-f-r扩增的结果，扩出了120bp特征条带。泳道12-13分别显示2号植株叶片和种子dna中同时加入killer-f-r、marker2-f-r、marker1-f-r和marker3-f-r的扩增结果，均扩增出了120bp、89bp、80bp和70bp四条带。泳道14-15分别显示3号植株叶片和种子dna中同时加入killer-f-r、marker2-f-r、marker1-f-r和marker3-f-r的扩增结果，也均扩增出了120bp、89bp、80bp和70bp四条带。上述结果表明1-3号植株中均同时带有killer 5400、marker 2 aau、marker 1、marker 3 zfn四个表达盒，与用小样dna提取法抽提dna扩增的结果一致，表明本发明试剂盒对低质量dna也有很好的检测效果。利用本发明试剂盒与小样dna提取法配合，可以为gat转基因植株的筛选和监管提高高效和可靠的检测手段。
123.实施例6利用多重pcr试剂盒对目标表达盒进行表达量分析
124.选取实施例4中的1号植株和中花11植株，采用trizol法抽提叶片总rna。抽提好的rna使用1％琼脂糖凝胶电泳检测。如图12的a泳道1和泳道2所示，中花11和转基因植株总rna的28s和18s的rrna条带清晰，说明rna质量较高，可用于反转录。
125.使用上述rna进行反转录，体系和程序如下：
126.rna-primer mix的配制
127.在放置冰上的rnase free的反应管内加入以下试剂至终体积13μl
128.total rna
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1μg
129.250μm random primer
ꢀꢀ
3μl
130.ddh2o(rnase free)
ꢀꢀꢀꢀ
补足13μl
131.rna-primer mix微离心，70℃5min之后冰浴。
[0132][0133][0134]
上述反应体系在37℃温浴1h后，在85℃灭活5min，用双蒸水稀释10倍备用。
[0135]
以上述反转录获得的cdna做模板，使用多重pcr试剂盒进行rt-pcr反应，检测条件参照实施例3，检测结果如图12的b所示。泳道1和泳道3分别为内参基因引物对gapdh-f-r扩增野生型中花11和1号植株cdna的结果，均扩增出80bp条带，表明反转录成功。泳道2和泳道4分别为引物对killer-f-r、marker2-f-r、marker1-f-r和marker3-f-r扩增野生型中花11和1号植株cdna的结果，其中泳道2没有条带扩出而泳道4有120bp、89bp、80bp和70bp四条带扩出，表明本发明的多重pcr引物试剂盒能够定量检测相应表达盒的表达量。
[0136]
综上所述，多重pcr引物试剂盒不仅能够在dna水平对转基因和非转基因植株做准确鉴定；同时在rna水平对转基因植株也能够做定量的检测。
[0137]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。