一种改善家禽腺胃发育的乳酸菌复合微生态制剂及其应用的制作方法

1.本发明主要涉及微生物和饲料添加剂技术领域，具体涉及一种改善家禽腺胃发育的乳酸菌复合微生态制剂及其应用。


背景技术：

2.腺胃作为鸡的一个重要的消化器官，在鸡的饮食消化中有重要的作用。腺胃黏膜内有两种腺体：浅层为单管状腺，分泌黏液；深层为复管状腺，主要作用为分泌盐酸和胃蛋白酶。腺胃受损，有可能会导致盐酸分泌亢奋，导致盐酸分泌过多从而影响腺胃和肌胃的酸碱度，进而影响消化，并对腺胃黏膜和肌胃角质膜造成腐蚀，造成腺胃黏膜和肌胃角质膜的糜烂；腺胃导管的肿胀、堵塞会导致分泌的盐酸和胃蛋白酶无法分泌，进而造成消化液的减少并进一步导致腺胃炎症的恶化；腺胃的肿大和腺胃黏膜、肌胃角质膜的糜烂会导致鸡的进食困难和消化能力的严重下降。同时肠道会由于胃酸分泌的减少，使原本在胃酸调控下正常生长的肠道菌群发生紊乱，导致有害菌繁殖，从而引发肠炎、腹泻等疾病，大大降低了家禽类动物的生产性能和养殖效益。
3.乳酸菌是一类广泛存在于人类和畜禽肠道的益生菌，因安全、绿色、无污染、无残留等优点被应用。乳酸菌在畜禽胃肠道微生态平衡、胃肠道生长发育、胃肠道粘膜修复等方面均具有不同程度的促进作用。但乳酸菌种类繁多，单一的乳酸菌作用效果不强，而利用乳酸菌制备的某些生物菌剂存在价格过高、菌株复配过于复杂或单一而导致活菌量低等缺陷，或者复配菌株之间并无协同作用，甚至产生拮抗作用而影响其作用效果，从而降低使用效果并提高使用成本。因此，效果优异、成分简单的乳酸菌菌剂仍旧是现在市场的研究热点之一。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术中存在的缺陷和不足，本发明提供了一种改善家禽腺胃发育的乳酸菌复合微生态制剂及其应用，该乳酸菌复合微生态制剂成分简单，能够有效促进肉鸡腺胃的发育，提高肉鸡的生长性能。
5.为实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：本发明提供了一种改善家禽腺胃发育的乳酸菌复合微生态制剂，其特征在于：所述乳酸菌复合微生态制剂包括罗伊氏乳杆菌菌粉、动物双歧杆菌菌粉、副干酪乳杆菌菌粉和载体。
6.进一步的，所述罗伊氏乳杆菌菌粉的活菌含量不低于2.00
×
10
8 cfu/g；所述动物双歧杆菌菌粉的活菌含量不低于5.00
×
10
7 cfu/g；所述副干酪乳杆菌菌粉的活菌含量不低于5.00
×
10
7 cfu/g；所述载体的含量不低于500 mg/g。
7.进一步的，所述罗伊氏乳杆菌菌粉、动物双歧杆菌菌粉和副干酪乳杆菌菌粉的质量比为1
‑
5:1
‑
5:1
‑
5。
8.优选的，所述罗伊氏乳杆菌菌粉、动物双歧杆菌菌粉和副干酪乳杆菌菌粉的质量
比为4:1:1。
9.进一步的，所述罗伊氏乳杆菌菌粉是由保藏编号为cctcc no：m 2021628的罗伊氏乳杆菌nsl0501经培养、发酵、离心、真空冷冻干燥后得到的。
10.进一步的，所述罗伊氏乳杆菌的核苷酸序列如seq id no.1所示。
11.进一步的，所述动物双歧杆菌菌粉是采用保藏编号为cctcc no：m 2021629的动物双歧杆菌nsy0201经培养、发酵、离心、真空冷冻干燥后得到的。
12.进一步的，所述动物双歧杆菌的核苷酸序列如seq id no.2所示。
13.进一步的，所述副干酪乳杆菌菌粉是采用保藏编号为cctcc no：m 2021626的副干酪乳杆菌nsl0201经培养、发酵、离心、真空冷冻干燥后得到的。
14.进一步的，所述副干酪乳杆菌的核苷酸序列如seq id no.3所示。
15.进一步的，所述载体为麦芽糊精，80目筛上物为0。
16.本发明还提供了所述的乳酸菌复合微生态制剂在制备用于家禽养殖的饲料添加剂中的应用。
17.进一步的，在使用时，将所述乳酸菌复合微生态制剂以全价配合饲料总重的2
‰‑5‰
的质量混入全价配合饲料中，翻拌均匀后，按照正常饲养标准饲喂家禽即可。
18.进一步的，所述乳酸菌复合微生态制剂能够能够显著降低家禽的腺胃指数、腺胃和肌胃比以及提高腺胃乳头及粘膜的完整度，进而有效改善由全价配合颗粒饲料造成的家禽腺胃发育不良的问题。
19.进一步的，所述家禽为肉鸡。
20.本发明还提供了所述的乳酸菌复合微生态制剂在制备用于防治家禽由腺胃发育不良或损伤引起的炎症性疾病的药物或营养品中的应用。
21.与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益技术效果：1、本发明选用的罗伊氏乳杆菌nsl0501筛选自食品乳扇，安全性好，能够有效缓解腺胃炎性肿胀，减少炎性浸润，修复胃肠道粘膜组织。
22.2、本发明选用的动物双歧杆菌nsy0201和副干酪乳杆菌nsl0201筛选自天然发酵奶酪，安全性好，能够在胃肠道快速生长繁殖，通过高效分泌乳酸等代谢产物，有效抑制致病菌的繁殖，减少腺胃炎症的发生。
23.3、本发明的乳酸菌复合微生态制剂是利用上述三种菌株经发酵冻干制备的菌粉与载体混合制成的，其成分简单安全，经养殖实验验证，其能够用于肉鸡养殖中，并具有显著降低腺胃指数，降低腺胃和肌胃比，提高腺胃乳头及粘膜完整度的作用，能够有效改善肉鸡腺胃发育的作用，再加上三种菌株的协同作用，对由腺胃发育不良引起的溃疡也具有一定的修复作用，能够受损胃粘膜，减少胃部炎症发生，进而预防腺胃炎等疾病，最终提高肉鸡的生产性能，提高养殖户的收益。
附图说明
24.图1为乳酸菌复合微生态制剂对肉鸡腺胃乳头和粘膜的影响结果，其中a为i组对照组，b为ii 组实验组。
具体实施方式
25.结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
26.实施例1、菌株的筛选和鉴定一、罗伊氏乳杆菌nsl0501的筛选鉴定1、以来源于四川省甘孜藏族自治州甘孜县牧民传统发酵乳扇作为样品。将样品转入灭菌处理的研钵中研磨，加入无菌水稀释成10 ml的样品液，然后再次用无菌水按照10
‑3‑
10
‑4的比例稀释后，分别取200 μl涂于改良mrs固定培养基上，37 ℃条件下静置培养16h。挑取平板上的单菌落，并将该单菌落接种于改良mrs液体培养基中，36℃下静置培养16 h，采用划线法将培养的菌液重复划线于改良mrs固体平板上，进行纯化，重复纯化3次。纯化三代后，得到的单菌落编号为nsl0501。
27.菌株nsl0501在改良mrs固定平板上的菌落为乳白色至淡黄色，呈圆形，直径1
‑
3 mm，表面光滑无光泽，中间凸起，不透明，边缘整齐，无晕环。
28.挑取上述的单菌落接种于改良mrs液体培养基中，36℃下静置培养16 h，然后将菌液于4 ℃，12,000 rpm条件下离心，取菌泥与30%甘油1:1混合后保存于
‑
70℃冰箱，进行后续的实验。
29.2、菌株的16s rrna鉴定提取菌株nsl0501的dna作为模板，利用细菌16s rrna通用引物27f和1492r进行扩增，扩增片段送至生物公司进行序列测定，测定结果如seq id no.1所示。blast比对结果表明，菌株nsl0501与limosilactobacillus reuteri的序列相似性为99.60%，因此判断菌株nsl0501为罗伊氏乳杆菌。
30.将筛选到的菌株nsl0501进行菌种保藏，所述罗伊氏乳杆菌nsl0501的保藏单位：中国典型培养物保藏中心（cctcc）；地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2021年5月31日；罗伊氏乳杆菌limosilactobacillus reuteri的保藏编号为cctcc no：m 2021628。
31.二、动物双歧杆菌nsy0201的筛选鉴定1、以来源于内蒙古锡林郭勒盟的天然发酵奶酪作为样品。取3份样品按照1%的用量加入到10%脱脂乳培养基中，37℃培养，待其凝乳后进行梯度稀释，逐渐稀释至10
‑
8梯度。选择3个适宜稀释度，分别取1ml于改良mrs固体培养基中，37℃下厌氧培养48h，进行菌落形态观察，挑选不同形态的单菌落再次在改良mrs固体培养基上划线分离，37℃下厌氧培养48h，重复划线分离3代，得到纯化后菌株，进行革兰氏染色以及显微镜观测，挑选出革兰氏染色阳性，显微镜观测呈球状、杆状或多形状的菌株，其中发现一株菌株的菌液离心后无法形成结实的沉淀，其菌泥松散，并经过负染色法进行负染色后该菌的荚膜染色最厚。再以苯酚
‑
硫酸法，并辅以比色法测定该菌的胞外多糖的含量，结果显示该菌的胞外多糖产量高达306 mg/l，并将该菌编号为nsy0201。
32.对菌株nsy0201进行形态学特征观察，所述菌株nsy0201是呈革兰氏阳性，菌落为乳白色至淡黄色，圆形或类圆形，直径1
‑
2mm；表面隆起、光滑无光泽，边缘具不规则的波状；菌体为短杆状，两端钝圆，鲜见分叉，表面较光滑，无芽孢。
33.2、菌株的16s rrna鉴定
提取菌株nsy0201的dna作为模板，利用细菌16s rrna通用引物27f和1492r进行扩增，扩增片段送至生物公司进行序列测定，测定结果如seq id no.2所示。blast比对结果表明，菌株nsy0201与bifidobacterium animalis的序列相似性为99.79%，因此判断菌株nsy0201为动物双歧杆菌。
34.将筛选到的菌株nsy0201进行菌种保藏，所述动物双歧杆菌nsy0201的保藏单位：中国典型培养物保藏中心（cctcc）；地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2021年5月31日；动物双歧杆菌bifidobacterium animalis的保藏编号为cctcc no：m 2021629。
35.三、副干酪乳杆菌nsl0201的筛选鉴定1、以来源于西藏自治区那曲市色尼区色尼雄村的传统发酵酸奶为样品，混匀样品，吸取1ml样品加到含9ml 0.9%生理盐水的无菌试管中，取200 μl的样品液涂于改良mrs固体培养基上，于37℃培养48h，挑取菌株的典型单菌落再次接种至改良mrs固体培养基上划线纯化培养，再挑取单菌落转接至改良mrs液体培养基中扩增培养，37℃培养后，采用划线法将培养的菌液重复划线于改良mrs固体平板上，进行纯化，重复纯化3次。纯化三代后，得到的单菌落编号为nsl0201。
36.菌株nsl0201是兼性厌氧性细菌，呈革兰氏阳性，菌落为乳白色，圆形或类圆形，直径在1.0 mm以上；表面隆起光滑，边缘整齐；菌体为短杆状，两端钝圆，呈短链状排列，表面较光滑，无芽孢。
37.2、菌株的16s rrna鉴定提取菌株nsl0201的dna作为模板，利用细菌16s rrna通用引物27f和1492r进行扩增，扩增片段送至生物公司进行序列测定，测定结果如seq id no.3所示。blast比对结果表明，菌株nsl0201与lacticaseibacillus paracasei的序列相似性为99.50%，因此判断菌株nsl0501为副干酪乳杆菌。
38.将筛选到的菌株nsl0201进行菌种保藏，所述副干酪乳杆菌nsl0201的保藏单位：中国典型培养物保藏中心（cctcc）；地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2021年5月31日；副干酪乳杆菌lactobacillus paracasei的保藏编号为cctcc no：m 2021626。
39.实施例2、乳酸菌复合微生态制剂的制备本发明所述的乳酸菌复合微生态制剂包括：活菌含量不低于2.00
×
10
8 cfu/g的罗伊氏乳杆菌nsl0501，活菌含量不低于5.00
×
10
7 cfu/g的动物双歧杆菌nsy0201，活菌含量不低于5.00
×
10
7 cfu/g的副干酪乳杆菌nsl0201，载体麦芽糊精含量不低于500 mg/g。
40.将上述三种菌株分别于改良mrs固体平板上划线，37℃培养48h，然后挑取单菌落接种于改良mrs液体培养基中，37℃培养16 h；菌液再以3%的接种量接种至2 l的改良mrs液体培养基中，37℃培养16 h，培养至对数期；菌悬液在4℃下，12000r/min，离心10 min，弃去上清液，收集菌体；菌体用超纯水洗涤3次，离心后得到菌泥；菌泥用12%的脱脂乳溶液重悬，经真空冷冻干燥冻干后，分别得到三种菌株的菌粉。
41.将罗伊氏乳杆菌nsl0501菌粉、动物双歧杆菌nsy0201菌粉、副干酪乳杆菌nsl0201以4:1:1的质量比进行混合后，再混入含量不低于500 mg/g的载体麦芽糊精，最终制得乳酸菌复合微生态制剂。
42.实施例3、乳酸菌复合微生态制剂在肉鸡养殖中的应用所述的乳酸菌复合微生态制剂按照全价配合饲料总重的2
‰‑5‰
的质量添加到全
价配合饲料中。
43.将400 只1 日龄健康且体重差异不显著的罗斯308肉鸡随机分为2个处理组，饲喂全价配合颗粒饲料；其中i 组为对照组，饲料中不添加任何微生态添加剂；ii 组为实验组，在饲料中添加3
‰
的乳酸菌复合微生态制剂（每吨全价饲料添加3kg乳酸菌复合微生态制剂）；每个处理组设5个重复，每重复组40 只鸡。
44.试验前对鸡舍、鸡笼及周边环境消毒处理，试验过程中保持恒定光照和机械通风，试验采用笼养方式，鸡舍采用自动控温加热装置。试验肉鸡自由采食、自由饮水，试验周期42天。
45.试验结束后，每个重复取平均体重肉鸡10只进行宰杀，计算腺胃指数、腺胃和肌胃比，并且观察腺胃乳头、粘膜等组织完整度。腺胃指数与腺胃和肌胃比的计算公式如下：腺胃指数（%）=（腺胃重/肉鸡活重）
×
100%；腺胃和肌胃比（%）=（腺胃重/肌胃重）
×
100%。
46.结果如表1和图1所示。
47.表1 复合微生态制剂对肉鸡腺胃影响组别腺胃重（g）肌胃重（g）活体重（g）腺胃指数（%）腺胃肌胃比（%）i组9.65
±
1.08
a
27.92
±
2.55
a
2615
±
63
a
0.37
±
0.03
a
32.8
±
1.02
a
ii组7.32
±
0.91
b
35.22
±
2.08
b
2905
±
79
b
0.25
±
0.03
b
22.7
±
1.16
b
注：同行上标小写字母不同表示差异显著（p<0.05）。
48.饲喂全价配合颗粒饲料会导致肉鸡腺胃指数、腺胃和肌胃比升高，从而会影响到其腺胃发育和腺胃助消化功能。从表1可以看出，在整个42天肉鸡养殖过程中，ii 组肉鸡的腺胃重量、腺胃指数及腺胃和肌胃比均显著低于i 组，肌胃重量和活体重均显著高于i 组，因此说明本发明的乳酸菌复合微生态制剂能够有效改善肉鸡的腺胃发育，并降低了全价配合颗粒饲料对于肉鸡腺胃的不良影响，进而促进了腺胃消化功能的发育，提高了肉鸡的生长性能，增加了肉鸡体重，最终增加养殖收益。
49.从图1可以看出，i组肉鸡（图1a）腺胃肿胀，乳头大小不一，排列不规则，有部分出血点；而ii组肉鸡（图1b）腺胃粘膜完好，未见肿胀，乳头大小较均匀，排列较整齐，无出血点。因此说明本发明的乳酸菌复合微生态制剂对肉鸡腺胃乳头和粘膜修复具有显著的作用，并改善了腺胃肿胀和出血点的炎性症状，因此该乳酸菌复合微生态制剂非常适合用来制备防治因腺胃发育不良或损伤而造成的肉鸡的炎症性疾病。
50.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。