磺化2(7)-氨基吖啶酮和1-氨基芘染料及其作为荧光标签特别是用于碳水化合物分析的用途的制作方法

磺化2(7)
‑
氨基吖啶酮和1
‑
氨基芘染料及其作为荧光标签特别是用于碳水化合物分析的用途
技术领域
1.本发明涉及荧光染料化合物，其为碳水化合物分析提供了新型的有效且有利的标签，特别是在涉及还原胺化、随后色谱或动电分离和荧光检测的方法中，通过带荧光检测的亲水相互作用色谱(hilic
‑
flr)、带荧光检测的反相液相色谱(rplc
‑
flr)、带激光诱导荧光检测的毛细管(凝胶)电泳(分别为ce
‑
lif、cge
‑
lif)或其他基于分离的糖分析方法。色谱方法可以作为高效液相色谱或作为超高效液相色谱(hplc或uhplc)运行，并且所有基于分离的方法都可以与质谱联用，作为荧光检测的替代或补充。典型地，与已知染料标签相比(如下所述)，染料
‑
碳水化合物缀合物的荧光最大值显著地向红色移动。


背景技术：

2.本文使用的术语“碳水化合物”是单糖的集合术语，如木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、岩藻糖、n
‑
乙酰氨基葡萄糖、唾液酸；(均或杂)(homo or hetero)二糖，如乳糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖；(均或杂)低聚糖，如聚糖(例如n
‑
和o
‑
聚糖)、低聚半乳糖(gos)、低聚果糖(fos)、乳低聚糖(mos)或甚至糖脂的糖部分；和多糖，如直链淀粉、支链淀粉(amylopektin)、纤维素、糖原、糖胺聚糖或几丁质。低聚糖和多糖可以是直链的或(多)支链的。
3.糖缀合物是其中碳水化合物(糖基)与非碳水化合物部分(糖苷配基)相连的化合物。通常，糖苷配基是蛋白质(糖蛋白)或脂质(糖脂)。在更通常的意义上，糖缀合物是指与任何其他化学实体(如蛋白质、肽、脂质、或甚至糖)共价连接的碳水化合物。
4.糖缀合物代表了自然界中结构和功能最为多样的分子。它们的复杂性从相对简单的糖脂到非常复杂和多样的糖基化蛋白质。虽然碳水化合物部分通常仅由少数单糖(包括n
‑
乙酰氨基葡萄糖、n
‑
乙酰氨基半乳糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、葡萄糖和唾液酸)组成，但它们的结构多样性可能比蛋白质或dna的结构多样性大得多。这种多样性的原因是异头物的存在和单糖分支和建立不同(糖苷)键的能力。因此，链长相对较小的低聚糖可能具有大量的结构异构体。此外，与以rna为模板的蛋白质生物合成不同，从基因组到糖组(定义见下一段)的信息流是一个复杂的过程，不再是模板驱动的过程。聚糖生物合成中蛋白质的共翻译和翻译后修饰是通过酶促反应实现的。这导致聚糖的复杂性和结构多样性急剧增加(如下面的方案1所示)。实际上，术语聚糖是指糖缀合物的碳水化合物部分。术语聚糖、低聚糖和多糖是同义词，意指“由中等数量或大量以糖苷键连接的单糖组成的化合物”(iupac定义)。
[0005][0006]
方案1
[0007]
为了阐明糖组的结构特征，即细胞在特定条件下产生的全套糖缀合物，并了解其功能及其与dna和蛋白质“机械”(machinery)的“对抗”(counter play)，必须提供快速、稳健和高分辨率的生物分析技术。
[0008]
许多分析技术已被用于分析碳水化合物。含有多种不同低聚糖的复杂样品可通过色谱或动电技术进行分离。常见的色谱模式包括尺寸排阻色谱(sec)、亲水相互作用色谱(hilic)、反相液相色谱(rplc)和反相离子对色谱(rpipc)以及多孔石墨化碳色谱(pgc)。质谱(ms)和核磁共振(nmr)允许对复杂低聚糖进行从头(de novo)结构表征。通常采用多种技术的组合，例如lc
‑
nmr、lc
‑
ms或ce
‑
ms。一旦确定特定聚糖的结构，其特征性质，如保留时间或迁移时间，即制成表格。通过将获得的未知样本数据与表格参数进行比较，可以对未知样本进行快速筛选和评估。
[0009]
动电分离技术基于带电粒子在电场作用下的运动，包括各种电泳技术。用于糖分析的最重要的动电分离方法是毛细管区带电泳(cze)和毛细管凝胶电泳(cge)。这些技术同时提供了高分辨率、快速分离并允许定量。
[0010]
已显示出激光诱导荧光检测的多重毛细管凝胶电泳(xcge
‑
lif)用于糖分析是特别有效的工具(例如，在r.hennig，u.reichl，e.rapp，glycoconjugate j.2011，28，331中)。一个优点是可以利用多重毛细管阵列设置，由于分离的平行化，该装置具有非常高的通量分析潜力。使用xcge
‑
lif的另一个原因是由于lif检测的非常高的灵敏度(r.hennig，diploma thesis，otto
‑
von
‑
guerickemagdeburg，2010)。
[0011]
毛细管电泳(ce)是一系列动电分离方法，iupac将其定义为“在毛细管中进行的仅基于含水或非含水背景电解质溶液中带电物(分析物)的电泳迁移率差异的分离技术”(另见m.
‑
l.riekkola，j.a.r.msmith，pure appl.chem.2004，76，443
‑
451)。换言之，ce术语是在非常薄的毛细管内通过电泳分离离子。
[0012]
iupac将cge定义为“当毛细管充满交联凝胶时毛细管筛分电泳的特例”(另见m.
‑
l.riekkola等人，上文)。
[0013]
化合物的电泳迁移率取决于质荷比，当采用cge时—由于凝胶筛分效应—还取决于分子形状。
[0014]
通常，天然碳水化合物不能通过其质荷比进行分离，因为除了含有如唾液酸、葡萄
糖醛酸或者硫酸化或磷酸化单糖单元的电荷残基的天然碳水化合物外，大多数天然碳水化合物都是电中性的。
[0015]
此外，天然碳水化合物不显示荧光。因此，对于通过色谱或动电分离和荧光检测进行的分析，有必要在分析之前标记低聚糖(图1)。除了提供适当的激发和发射波长(以及(动电分离所必需的)附加电荷)外，染料还必须适合与碳水化合物偶联(例如，见n.v.shilova，n.v.bovin，russ.j.bioorg.chem.2003，29(4)，339
‑
355.)
[0016]
用荧光染料标记碳水化合物最常见和最直接的方法是还原胺化。这两步程序在碳水化合物(缩醛或醛基)的还原端和伯胺之间产生共价键。伯胺或者并入荧光团的结构中，或者结合到与荧光染料连接的接头上。
[0017]
图1显示了基于分离的聚糖分析的主要步骤。聚糖分析程序可分为五个步骤：样品制备、聚糖释放、标记、样品纯化、荧光检测的色谱分离或动电分离和数据评价。在下文中，将更详细地描述根据最新技术对聚糖的标记和标记产品的检测。下面的方案2显示了碳水化合物还原胺化的主要反应机理(例如，参见n.volpi，capillary electrophoresis of carbohydrates.from monosaccharides to complex polysaccharides，humana press，new york，2011，pp.1
‑
51)。
[0018][0019]
方案2
[0020]
还原胺化的第一步涉及亲核加成反应，其中胺氮的孤电子对攻击开链形式(1b)中的碳水化合物残基的亲电醛碳原子。酸催化从中间体2中除去水得到亚胺(3a)。由于亚胺的形成是可逆的，因此必须通过氢化物源(诸如氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、2
‑
吡啶基硼烷或相关试剂(方案2中的还原剂))的不可逆酸催化还原将亚胺转化为仲胺(4)。硼烷的性质很重要，因为只有亚胺离子3b需要还原，而碳水化合物r2cho(1b)必须对还原保持不反应(它们只与代表荧光标签的胺r3nh2反应)。
[0021]
方案2中描述的反应顺序基于特殊还原剂(甲硼烷)的可用性和足够的反应活性，这些还原剂不与醛反应(或非常缓慢地还原醛)，但在酸性条件下容易还原亚胺离子(3b)。弱酸或中强酸，如乙酸(pk
a
＝4.76)、丙二酸(pk
1a
＝2.83)或柠檬酸(pk
1a
＝3.13)，经常在ph＝3
‑
6时使用，以实现不可逆快速还原(k.r.anumula，anal.biochem.2006，350，1
‑
23)。因此，应用的胺(r3nh2)必须是弱碱(因为在方案2中只有非质子化胺可以与醛1b反应)。在蛋白质中，赖氨酸的脂肪族氨基、组氨酸和精氨酸残基中的亲核氮原子在ph＝3
‑
6时质子化，并且根据方案2不与碳水化合物反应。因此，仅需要具有相当低的pk
a
＝3
‑
5(这些是共轭酸的
值)的芳香胺，其被广泛用作天然聚糖还原胺化的分析试剂。如下所示的3种商品化芳香胺，通过还原胺化、缀合物的色谱或动电分离和荧光灵敏检测，可用于标记聚糖。
[0022][0023]3‑
氨基芘
‑
1，6，8
‑
三磺酸(apts)是目前应用最广泛的碳水化合物标记试剂。三个强酸性残基(磺酸基)在ph>2时(在非常宽的ph范围内)引入三个负电荷。ants也有三个负电荷，但其吸收最大值过度蓝移，因此不适合商用的488nm激光器。
[0024]
纯化后(去除蛋白质、多余电解质、多余染料、标记试剂等，也如下文“实施例”一节的实施例2和其中的参考文献中所述)，将标记样品分别注入色谱柱、动电毛细管，并进行分离。由于不同的性质(如疏水性、质量/电荷、形状等)，不同的碳水化合物分别根据其特征保留时间和迁移时间到达检测器。
[0025]
当标记的碳水化合物到达荧光检测器时，荧光标记物被激发，发射信号被检测。
[0026]
如今，标记聚糖的“真正的”高通量分析通常在商业的多重cge系统上进行。这些xcge
‑
lif仪器包含一个用于分离带电分析物(例如，apts标记的聚糖)的多重毛细管凝胶电泳单元、激光器和荧光检测器。
[0027][0028]
方案3：水性缓冲液中apts及其n
‑
烷基化衍生物的光谱特性(根据z.sharrett，s.gamsey，l.hirayama，b.vilozny，j.t.suri，r.a.wessling，b.singaram，org.biomol.chem.2009，7，1461
‑
1470)。
[0029]
apt以外的其他染料可用作碳水化合物及其衍生物的荧光标签(例如，ants和5
‑
氨基荧光素)。例如，在wo 2002/099424 a3和wo 2009/112791a1中描述了吖啶酮染料，但未描述7
‑
氨基吖啶酮
‑2‑
磺酰胺。wo 2012/027717 a1描述了包含功能取代的1，6，8
‑
三磺酰胺基
‑3‑
氨基芘(apts衍生物)、分析物反应性基团、可裂解锚(anchor)以及多孔固相的系统。wo 2010/116142 a2描述了大量荧光团和荧光传感器化合物，其还包括基于氨基芘的染料。然而，与apts相比，这些染料中没有一种显示了或被建议具有优越的光谱和电泳性能，特别是作为碳水化合物的缀合物。
[0030]
鉴于现有技术的荧光染料的缺点，本发明的主要目的是提供与apts相比具有改进性质的新型荧光染料，诸如更高的电泳迁移率和/或更高的亮度或其他有利的光谱特性。用
于基于带荧光检测的动电分离的碳水化合物分析的荧光标签对这些特性有很高的要求，因此本文将提供优越的性能。
[0031]
通过提供根据权利要求1
‑
14所述的带有多负电荷基团的新型荧光吖啶酮和芘染料，以及根据例如权利要求8所公开的新型荧光染料的用途从而实现了该目的。本发明的其他方面和更具体的实施方案是进一步要求的主题。


技术实现要素：

[0032]
在其电离(去质子化)形式中，本发明的新型荧光染料的特点为具有多个带负电荷的残基和连接到荧光团的芳香氨基或肼基，其可用例如，氩离子激光器激发。重要的是，新型染料及其碳水化合物缀合物发出的光的最大值与apts标记类似物相比有很大的移动。多重负净电荷，在磷酸化衍生物中格外高(例如，
‑
6)，与apts
‑
糖缀合物相比，提供更高的染料
‑
糖缀合物电泳迁移率。
[0033]
本发明新型荧光染料的结构选自由以下通式a
‑
b的化合物或其盐组成的组：
[0034][0035]
其中，
[0036]
r1、r2、r3、r4、r5彼此独立，可表示：
[0037]
h，ch3，c2h5，直链或支链c3‑
c
12
、优选c3‑
c6，烷基或全氟烷基，膦酰化(phosphonylated)烷基(ch2)
m
p(o)(oh)2，其中m＝1
‑
12、优选2
‑
6，具有直链或支链烷基链，(ch2)
n
cooh，其中n＝1
‑
12、优选1
‑
5，或(ch2)
n
coor6，其中n＝1
‑
12、优选1
‑
5，并且r6可以是烷基，特别是c1‑
c6，ch2cn，苄基，芴
‑9‑
基(fluorene
‑9‑
yl)，多卤代烷基，多卤代苯基，例如，四或五氟苯基、五氯苯基、2
‑
和4
‑
硝基苯基、n
‑
琥珀酰亚胺基(n
‑
succinimidyl)、磺基
‑
n
‑
琥珀酰亚胺基(sulfo
‑
n
‑
succinimidyl)、1
‑
氧基苯并三唑基(1
‑
oxybenzotriazolyl)或其他潜在的亲核反应性离去基团，烷基磺酸((ch2)
n
so3h)或烷基硫酸((ch2)
n
oso3h)，其中n＝1
‑
12、优选1
‑
5，任何(ch2)
n
中的烷基链可以是直链的或支链的；
[0038]
羟烷基(ch2)
m
oh或硫代烷基(ch2)
m
sh，其中m＝1
‑
12、优选2
‑
6，具有直链或支链烷基链，磷酸化羟烷基(ch2)
m
op(o)(oh)2，其中m＝1
‑
12、优选2
‑
6，具有直链或支链烷基链；r1或r2基团中的一个可以是碳酸盐或氨基甲酸酯衍生物(ch2)
m
ocoor7或(ch2)
m
nhcoor7，其中m＝1
‑
12且r7＝甲基、乙基、叔丁基、苄基、芴
‑9‑
基、ch2cn、n
‑
琥珀酰亚胺基、磺基
‑
n
‑
琥珀酰亚胺基、1
‑
氧基苯并三唑基、苯基、取代苯基，例如，2
‑
或4
‑
硝基苯基、五氯苯基、五氟苯基、2，3，5，6
‑
四氟苯基、2
‑
吡啶基、4
‑
吡啶基、嘧啶
‑4‑
基；
[0039]
(ch2)
m
nr
a
r
b
，其中m＝1
‑
12、优选2
‑
6，具有直链或支链烷基链；r
a
、r
b
彼此独立，并代表氢和/或c1‑
c4烷基、羟烷基(ch2)
m
oh，其中m＝2
‑
6，具有直链或支链烷基链、磷酸化羟烷基
(ch2)
m
op(o)(oh)2，其中m＝2
‑
6，具有直链或支链烷基链；
[0040]
烷基叠氮化物(ch2)
m
n3，其中m＝1
‑
12、优选2
‑
6，具有直链或支链烷基链；
[0041]
r1、r2、r3、r4、r5可含有末端烷氧基氨基(ch2)
m
onh2，其中m＝1
‑
12、优选2
‑
6，具有直链或支链烷基链，其可包括m＝0
‑
12的所有可能组合中的一个或多个烷基氨基(ch2)
m
nh或烷基氨基(ch2)
m
conh基团；
[0042]
(ch2)
n
conhr8，n＝1
‑
12、优选1
‑
5；r8＝h，c1‑
c6烷基，(ch2)
m
n3或(ch2)
m
‑
n
‑
马来酰亚胺基，(ch2)
m
‑
nh
‑
coch2x(x＝br或i)，m＝1
‑
12、优选2
‑
6，且在(ch2)
n
、(ch2)
m
和r6中具有直链或支链烷基链；
[0043]
伯氨基；
[0044]
进一步，残基r1、r2、r3、r4、r5中的一个可表示ch2‑
c6h4‑
nh2，coc6h4‑
nh2，conhc6h4‑
nh2或csnhc6h4‑
nh2，其中c6h4为1，2
‑
、1，3
‑
或1，4
‑
亚苯基，coc5h3n
‑
nh2或ch2‑
c5h3n
‑
nh2，其中c5h3n为吡啶
‑
2，4
‑
二基、吡啶
‑
2，5
‑
二基、吡啶
‑
2，6
‑
二基或吡啶
‑
3，5
‑
二基；
[0045]
此外，r2‑
r3(r4‑‑‑
r5)可形成四元、五元、六元或七元环，或形成四元、五元、六元或七元环并带有或不带有连接到该环中的一个碳原子上的伯氨基nh2，仲氨基nhr
a
、其中r
a
＝c1‑
c6烷基，羟基oh或磷酸化羟基
‑
op(o)(oh)2；
[0046]
任选地，r2‑‑‑
r3(r4‑‑‑
r5)可形成四元、五元、六元或七元杂环，其中额外的1
‑
3个杂原子如o、n或s包括在该杂环中；
[0047]
进一步，r1可表示未经取代的苯基，具有一个或多个电子供体(electron
‑
donor)取代基的苯基，所述电子供体取代基选自oh、sh、nh2、nhr
a
、nr
a
r
b
、r
a
o、r
a
s的组，其中r
a
和r
b
彼此独立、且可为具有直链或支链碳链的c1‑
c6烷基，具有一个或多个电子受体的苯基，所述电子受体选自no2、cn、coh、cooh、ch＝chcn、ch＝c(cn)2、so2r
a
、cor
a
、coor
a
、ch＝chcor
a
、ch＝chcoor
a
、conhr
a
、so2nr
a
r
b
、conr
a
r
b
，其中r
a
和r
b
彼此独立、并且可以是h、或具有直链或支链的c1‑
c6烷基；
[0048]
或r1可代表杂芳族基团；
[0049]
条件是在上述式a的所有化合物中，在碱性条件下，即7<ph<14，存在至少两个，优选至少3、4、5或6个带负电荷的基团，并且这些带负电基团表示至少部分去质子化的可电离基团残基，所述可电离基团选自以下：sh，cooh，磺酸残基so3h，伯磷酸基团op(o)(oh)2，仲磷酸基团op(o)(oh)r
a
、其中r
a
＝c1‑
c4烷基或经取代的c1‑
c4烷基，伯膦酸基团p(o)(oh)2，仲膦酸基团p(o)(oh)r
a
、其中r
a
＝c1‑
c4烷基或经取代的c1‑
c4烷基；
[0050][0051]
其中r1和/或r2彼此独立，可表示：
[0052]
h、氘、烷基或氘取代烷基，其中烷基的一个、几个或所有h原子可被氘取代，特别是具有1
‑
12个c原子、优选1
‑
6个c原子的烷基或氘取代烷基，例如ch3、c2h5、直链或支链c3‑
c
12
烷基或全氟烷基，或经取代的c2‑
c
12
烷基；特别是，(ch2)
n
coor3，其中n＝1
‑
12、优选1
‑
5，r3可以是h，烷基、特别是c1‑
c6，ch2cn，苄基，2
‑
和4
‑
硝基苯基，芴
‑9‑
基，多卤代烷基，多卤代苯基，例如四氟或五氟苯基、五氯苯基、n
‑
琥珀酰亚胺基、磺基
‑
n
‑
琥珀酰亚胺基、1
‑
氧基苯并三唑基或其他潜在的亲核反应离去基团，(ch2)
n
中的烷基链可以是直链或支链；和
[0053]
r1‑‑‑
r2可形成一个四元、五元、六元或七元非芳香族碳环，带有连接到该环中的一个碳原子上的附加的伯氨基nh2，仲氨基nhr
a
、其中r
a
＝c1‑
c6烷基，或羟基oh；任选地，r1‑‑‑
r2可形成一个四元、五元、六元或七元非芳香杂环，其具有包括在该杂环中的一个附加杂原子如o、n或s；
[0054]
羟烷基(ch2)
m
oh，其中m＝1
‑
12、优选2
‑
6，具有直链或支链烷基链；r1或r2基团中的一个可为碳酸盐或氨基甲酸酯衍生物(ch2)
m
ocoor4或(ch2)
m
nhcoor4，其中m＝1
‑
12且r4＝甲基、乙基、2
‑
氯乙基、n
‑
琥珀酰亚胺基、磺基
‑
n
‑
琥珀酰亚胺基、1
‑
氧基苯并三唑基、苯基或取代苯基，例如，2
‑
和4
‑
硝基苯基、五氯苯基、五氟苯基、2，3，5，6
‑
四氟苯基、2
‑
吡啶基或4
‑
吡啶基；
[0055]
(ch2)
m
nr
a
r
b
，其中m＝1
‑
12、优选2
‑
6，具有直链或支链烷基链；r
a
、r
b
彼此独立且可为h或任选经取代的c1‑
c4烷基，特别是，r1或r2基团中的一个可为m＝2
‑
6且直链或支链烷基的烷基叠氮化物基团(ch2)
m
n3；
[0056]
r1或r2中的一个可以是n＝1
‑
12的(ch2)nso2nr5nh2，而取代基r5可以由h、烷基、羟烷基或全氟烷基c1‑
c
12
表示；
[0057]
r1或r2基团中的一个可以是形成芳基肼ar
‑
nr6nh2的伯氨基，其中ar是式b中的整个芘残基，r6＝h或烷基；
[0058]
r1或r2基团中的一个可以是形成芳基肼ar
‑
nr6nh2的伯氨基，其中ar是式b中的整个芘残基，r6＝h或烷基；
[0059]
r1或r2基团中的一个可以是形成芳基羟胺ar
‑
nr7oh的羟基，其中ar是式b中的整个芘残基，r7＝h或烷基；
[0060]
r1或r2基团中的一个可以是n＝1
‑
12的烷氧基氨基(ch2)
n
onh2；
[0061]
r1或r2基团中的一个可以是(ch2)
n
coor8，其中n＝1
‑
5，具有直链或支链烷基链(ch2)
n
，并且r8选自h、直链或支链c1‑
c6烷基、ch2cn、2
‑
和4
‑
硝基苯基、2，3，5，6
‑
四氟苯基、五氯苯基、五氟苯基、n
‑
琥珀酰亚胺基、磺基
‑
n
‑
琥珀酰亚胺基、1
‑
氧基苯并三唑基；
[0062]
进一步，r1或r2中的一个可以是(ch2)
n
conhr9，其中n＝1
‑
5且r9＝h，c1‑
c6烷基，(ch2)
m
n3，(ch2)
m
‑
n
‑
马来酰亚胺基，(ch2)
m
‑
nhcoch2x(x＝br或i)，其中m＝2
‑
6且在(ch2)
n
和r9中具有直链或支链烷基链；或r1或r2中的一个可表示ch2‑
c6h4‑
nh2，coc6h4‑
nh2，conhc6h4‑
nh2或csnhc6h4‑
nh2，其中c6h4为1，2
‑
、1，3
‑
或1，4
‑
亚苯基，coc5h3n
‑
nh2或ch2‑
c5h3n
‑
nh2，其中c5h3n为吡啶
‑
2，4
‑
二基、吡啶
‑
2，5
‑
二基、吡啶
‑
2，6
‑
二基或吡啶
‑
3，5
‑
二基；或者r1或r2中的一个可以是烷基叠氮化物(ch)n3或炔烃，特别是炔丙基；
[0063]
接头l(其将染料核心与基团x连接并调整染料的光谱性质)包含至少一个碳原子，且可包含烷基，杂烷基、特别是烷氧基如ch2och2、ch2ch2o、ch2ch2och2，烷基氨基或二烷基氨基、特别是二乙醇胺或n
‑
甲基(烷基)单乙醇胺部分如n(ch3)ch2ch2o
‑
和n(ch2ch2o
‑
)2，二氟甲基(cf2)，烯烃或烯烃部分的任何组合，在任何情况下，可为直链或支链，长度范围为c1至c
12
；
[0064]
接头l还可包括羰基(ch2co、cf2co)部分；
[0065]
x表示增溶和/或可电离的阴离子
‑
提供部分(anion
‑
providing moiety)，特别是由选自以下组的部分(moiety)组成或包括选自以下组的部分(moiety)，所述组包含羟烷基(ch2)
n
oh、硫代烷基((ch2)
n
sh)、羧烷基((ch2)
n
co2h)、烷基磺酸基((ch2)
n
so3h)、烷基硫酸基((ch2)
n
oso3h)、烷基磷酸基((ch2)
n
op(o)(oh)2)或烷基膦酸基((ch2)
n
p(o)(oh)2)，其中n是范围从0至12或1至12的整数，或其类似物，其中一个或多个ch2基团被cf2取代，
[0066]
进一步，阴离子
‑
提供部分(anion
‑
providing moiety)可通过含有o、n和s的非芳香族杂环连接，例如，哌嗪类、哌可啉(pipecolines)类，或者，可选地，基团x中的一个可具有上文针对基团r1和r2列出的任何部分，也可具有针对基团l列出的任何类型的连接键，且独立于其他取代基；
[0067]
条件是在由式b表示的所有化合物中，在碱性条件下，即7<ph<14，式b的残基x中存在三个或六个带负电荷的基团，并且这些带负电基团表示至少部分去质子化的可电离基团残基，所述可电离基团选自以下：sh，cooh，so3h，op(o)(oh)2，op(o)(oh)r
a
、其中r
a
＝c1‑
c4烷基或经取代的c1‑
c4烷基，p(o)(oh)2，p(o)(oh)r
a
、其中r
a
＝c1‑
c4烷基或经取代的c1‑
c4烷基；
[0068]
式a和式b的化合物可以以盐的形式存在并应用，该盐包括所有可能类型的阳离子，优选na

、k

、li

、nh
4
、有机铵(例如，三烷基铵)或有机鏻阳离子。
[0069]
在更具体的实施方案中，根据本发明的荧光染料盐可包含带负电的酸基团，特别是磺酸基和/或磷酸基，以及平衡离子，其选自无机或有机阳离子、优选碱金属阳离子、铵阳离子或有机铵或鏻化合物(如三烷基铵阳离子)的阳离子，和/或可包含带正电基团或在式a
‑
d染料中的氮位点n(r1)r2处形成的电荷
‑
转移络合物以及平衡离子，特别是选自强矿物酸、有机酸或路易斯酸中的阴离子。
[0070]
如本文所使用的术语“取代的”通常指存在一个或多个取代基，特别是选自包含以下取代基的组的取代基：直链或支链烷基，特别是c1‑
c4烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基；异烷基，例如异丙基、异丁基(2
‑
甲基丙基)；仲烷基，例如仲丁基(丁
‑2‑
基)；叔烷基，例如叔丁基(2
‑
甲基丙基)。此外，术语“取代的”在此可指具有至少一个氘、氟、氯或溴取代基代替氢
原子的烷基，或甲氧基、乙氧基、2
‑
(烷氧基)乙氧基(alkoch2ch2o)，以及在更通常的情况下，本领域alk(och2ch2)
n
och2ch2‑
的低聚(乙二醇)(oligo(ethylenglycol))残基，其中alk＝ch3、c2h5、c3h7、c4h
10
和n＝1
‑
23。
[0071]
术语“烷基”通常可指选自包含以下的组：直链或支链烷基，更特别地，c1‑
c
20
烷基、c1‑
c
12
烷基或c1‑
c6烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基；异烷基，例如异丙基、异丁基(2
‑
甲基丙基)；仲烷基，例如仲丁基(丁
‑2‑
基)；叔烷基，例如叔丁基(2
‑
甲基丙基)等。
[0072]
如本文所使用的术语“芳香族杂环基团”或“杂芳族基团”通常指具有5到10个环原子的未经取代或经取代的环状芳族自由基(radical)(残基(residue))，其中至少一个环原子选自s、o和n；自由基(radical)通过任何一个环原子与分子的其余部分相连。代表性但非限制性实例为呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、喹啉基和异喹啉基。
[0073]
上述通式结构通式a的化合物为吖啶酮染料，上述式b的化合物为芘染料。
[0074]
更特别地，根据iupac规则，式a的化合物为7
‑
氨基吖啶酮
‑2‑
磺酰胺，而式b的化合物为1
‑
氨基芘染料，其中在位置3、6、8具有功能性取代的磺酰基，即，(功能性取代的)1，6，8
‑
三磺酰基
‑3‑
氨基芘，如下面方案4中的基本结构式所示。
[0075][0076]
方案4
[0077]
本发明的新型荧光染料表现出许多有利的特性：
[0078]
●
pk
b
＝11
‑
8(pk
a
＝3
‑
6)的芳香胺(arnh2)、肼(nrnh2)、酰肼(conrnh2)、羟胺(rnhoh)或烷氧基氨基(ronh2)，用于在ph～2
‑
5下高效清洁的还原胺化或与碳水化合物直接缩合；优选地，芳香氨基是伯氨基的，但也可以是仲氨基的；结构见方案4
[0079]
●
缀合物中的大量净电荷
‑‑
ph＝7
‑
10时在
‑
3至
‑
6范围内
[0080]
●
在广泛的ph范围内，在水性介质中具有很好的溶解性；高亮度(这是荧光量子产率和消光的总体结果)
[0081]
●
在ph＝3
‑
6时，染料核心对硼烷基试剂还原的特殊稳定性
[0082]
●
能够用氩离子激光器(在488nm和514nm发射)激发，光谱匹配完美，荧光量子产率高
[0083]
●
在约520nm处的最小发射
[0084]
●
染料的纯度可达99％。
[0085]
本发明的新型荧光标签甚至允许检测长迁移时间的“重”聚糖。由于这些长迁移时
间和峰加宽，这种“重”聚糖很难动电检测；特别是如果用apts作为荧光标签。
[0086]
在下文中，描述了本发明的更具体的实施方案。
[0087]
在上式a中，nr1和/或n(r2)r3包含羰基或亲核反应性基团。优选地，r1、r2和r3由h、直链或支链烷基、羟烷基或全氟烷基表示。取代基r3、r4和r5优选包含增溶和/或阴离子
‑
提供基团，特别是羟烷基((ch2)
n
oh)、硫代烷基((ch2)
n
sh)、羧烷基((ch2)
n co2h)、烷基磺酸基((ch2)
n
so3h)、烷基硫酸盐((ch2)
n
oso3h)、烷基磷酸盐((ch2)
n
op(o)(oh)2)或烷基膦酸盐((ch2)
n
p(o)(oh)2)，其中n是范围从1到12的整数。
[0088]
或者，取代基r1、r2、r3、r4和r5可由羧酸残基(ch2)
n
cooh表示，其中n＝1
‑
12，其反应酯(ch2)
n
coor6为亲核反应性基团。r6可以是h、烷基(包括叔丁基)、苄基、芴
‑9‑
基、多卤代烷基、ch2cn、多卤代苯基(例如，四氟或五氟苯基、五氯苯基)、2
‑
和4
‑
硝基苯基、n
‑
琥珀酰亚胺基、磺基
‑
n
‑
琥珀酰亚胺基、1
‑
氧基苯并三唑基或其他潜在亲核反应性离去基团。烷基链(或主链)(ch2)
n
可以是直链或支链。
[0089]
此外，式a中的芳基氨基(nr1和nr2r3)可通过(聚)亚甲基((poly)methylene)、羰基、含氮或硫的接头、直链或支链的，特别是(ch2)
m
con(r7)、co(ch2)
m
n(r7)、co(ch2)
m
s(ch2)
n
、(ch2)
m
s(ch2)
n
co、co(ch2)
m
so2(ch2)
n
、(ch2)
m
so2(ch2)
n
co及其组合连接至分析物反应性基团上，或作为含氮非芳香杂环(例如，哌嗪类、哌可啉类、噁唑啉类)的一部分连接；m和n是0至12或1至12的整数。取代基r7可以由上面为r1、r2、r3、r4和r5列出的任何官能团表示。
[0090]
式a中的取代基r1、r2和r3也可由伯氨基表示，因此包含羰基反应性芳基肼，(r2＝h、r1或r3＝nh2或r1＝nh2、r2、r3＝烷基、全氟烷基或烷基)与增溶和/或阴离子
‑
提供部分(anion
‑
providing moieties)缀合或被取代，列出r4和r5的可能候选物，特别是：羟烷基(ch2)
n
oh、硫烷基((ch2)
n
sh)、羧烷基((ch2)
n
co2h)、烷基磺酸基((ch2)
n
so3h)、烷基硫酸基((ch2)
n
oso3h)、烷基磷酸基((ch2)
n
op(o)(oh)2)或烷基膦酸基((ch2)
n
p(o)(oh)2)，其中n是范围从0至12或1至12的整数。可替代地，肼衍生物可由磺酰肼表示，其中r4＝nh2，r5为烷基、全氟烷基或用上述类型的增溶和/或阴离子
‑
提供基团修饰的烷基。
[0091]
可替代地，式a中的芳基氨基(nr1和/或nr2r3)可通过接头间接连接到酰基肼或烷基肼部分，从而分别包含酰肼(zconhnh2)或肼(znhnh2)。此处z表示式a的染料残基，其包括芳基氨基和接头。特别地，r1和r2可由以下各项表示：(ch2)
m
con(r7)、co(ch2)
m
n(r7)、co(ch2)
m
s(ch2)
n
、(ch2)
m
s(ch2)
n
co、co(ch2)
m
so2(ch2)
n
、(ch2)
m
so2(ch2)
n
co及其组合；m和n是范围从0至12的整数。取代基r7可以由r1、r2、r3、r4和r5的任何官能团表示，这些官能团在上文中被列为官能团r1‑
r5的候选物，特别是：羟烷基(ch2)
n
oh、硫代烷基((ch2)
n
sh)、羧烷基((ch2)
n
co2h)、烷基磺酸基((ch2)
n
so3h)、烷基硫酸基((ch2)
n
oso3h)，烷基磷酸基((ch2)
n
op(o)(oh)2)或烷基膦酸基((ch2)
n
p(o)(oh)2)，其中n是范围从0至12或1至12的整数。接头也可由含o、n和s的非芳香族杂环(例如，哌嗪类，哌可啉类)代表。
[0092]
此外，r1、r2和r3可代表ch2‑
c6h4‑
nh2，coc6h4‑
nh2，conhc6h4‑
nh2或csnhc6h4‑
nh2，其中c6h4为1，2
‑
、1，3
‑
或1，4
‑
亚苯基，coc5h3n
‑
nh2或ch2‑
c5h3n
‑
nh2，其中c5h3n为吡啶
‑
2，4
‑
二基、吡啶
‑
2，5
‑
二基、吡啶
‑
2，6
‑
二基、吡啶
‑
3，5
‑
二基。
[0093]
在可变位置r1、r2、r3、r4和r5处的分析物反应性基团可表示芳香族或杂环胺、羧酸、羧酸酯(例如，n
‑
羟基琥珀酰亚胺或其他氨基反应性酯)；或通过以下表示：叠氮化烷基(ch2)
n
n3、炔烃(炔丙基)、氨基氧基烷基(ch2)
n
onh2、马来酰亚胺基(具有亲核反应性双键的
c4h3no2)或卤代酮官能团(function)(coch2x；x＝cl，br和i)，以及卤代酰胺基(nrcoch2x，r＝h，c1
‑
c6烷基，x＝cl，br，i)，通过所列的用于肼衍生物的含羰基、酰胺基、氮、氧或硫的接头直接或间接连接，其中n＝1
‑
12。
[0094]
根据本发明的一些更优选实施方案，上述式a中的取代基r1定义如下：
[0095]
式a中的r1表示氢、低级烷基(c1‑
c4)、未取代苯基、具有一个或多个电子供体取代基的苯基，该电子供体取代基选自oh、sh、nh2、nhr
a
、nr
a
r
b
、r
a
o、r
a
s、op(o)(or
a
)(or
b
)的组，其中r
a
和r
b
彼此独立，并且可以是c1‑
c
12
、优选c1‑
c6、具有直链或支链的烷基，具有一个或多个电子受体的苯基，该电子受体选自no2、cn、coh、cooh、ch＝chcn、ch＝c(cn)2、so2r
a
、so3r
a
、cor
a
、coor
a
、ch＝chcor
a
、ch＝chcoor
a
、conhr
a
、so2nr
a
r
b
、conr
a
r
b
、p(o)(or
a
)(or
b
)的组，其中r
a
和r
b
彼此独立地可以是h，或具有直链或支链碳链的c1‑
c6烷基；
[0096]
可替代地，r1可以表示芳香族杂环基团，特别是，2
‑
吡啶基、3
‑
吡啶基、4
‑
吡啶基、2
‑
噻吩基、3
‑
噻吩基、嘧啶
‑4‑
基、嘧啶
‑2‑
基、嘧啶
‑5‑
基，或衍生自芳香族杂环的其他电子受体基团，例如4
‑
吡啶
‑
n
‑
氧化物、n
‑
烷基吡啶盐或甜菜碱，特别是n
‑
(ω
‑
磺基烷基)
‑4‑
吡啶鎓，n
‑
(ω
‑
磺基烷基)
‑2‑
吡啶鎓，n
‑
(1
‑
羟基
‑
4，4，5，5
‑
四氟
‑
环戊
‑1‑
烯
‑3‑
酮
‑2‑
基)
‑4‑
吡啶鎓(n
‑
(1
‑
hydroxy
‑
4,4,5,5
‑
tetrafluoro
‑
cyclopent
‑1‑
en
‑3‑
on
‑2‑
yl)
‑4‑
pyridinium)，n
‑
(1
‑
羟基
‑
4，4，5，5
‑
四氟环戊
‑1‑
烯
‑3‑
酮
‑2‑
基)
‑
2吡啶鎓(n
‑
(1
‑
hydroxy
‑
4,4,5,5
‑
tetrafluorocyclopent
‑1‑
en
‑3‑
on
‑2‑
yl)
‑2‑
pyridinium)。
[0097]
特别是，r1可表示带正电荷的杂环基团，其衍生自具有7
‑
氨基吖啶酮
‑2‑
磺酰胺主链的2
‑
吡啶基、3
‑
吡啶基或4
‑
吡啶基前体和烷基化剂(例如，烷基卤化物、烷基磺酸盐、烷基三氟甲磺酸盐、1，3
‑
丙磺酸内酯、1，4
‑
丁磺酸内酯)或亲电试剂(例如，全氟环戊烯)。
[0098]
特别优选具有下式之一的上述结构式a的化合物：
[0099][0100]
在式b中，l是二价接头，其将染料核心与增溶和/或可电离部分连接，并调整光谱特性。
[0101]
通常，与apts染料标签相比，它的存在会导致相当大的荧光红移(bathofloric shift)和色谱红移(bathochromic shift)，同时与488nm商品化激光器的更好地匹配，其中片段l不存在，基团x是羟基。
[0102]
式b中的接头l包含至少一个碳原子或由至少一个碳原子组成，并可表示烷基、杂烷基(例如，烷氧基：ch2och2、ch2ch2o、ch2ch2och2)、二氟甲基(cf2)、烯烃或烃部分的任何的组合，在任何情况下，是直链或支链的，长度为c1至c12。接头还可以包括羰基(ch2co、cf2co)，磺酰胺类(该情况下，l为烷基氨基或二烷基氨基，特别是二乙醇胺或n
‑
甲基(烷基)单乙醇胺部分(即，n(ch3)ch2ch2o
‑
和n(ch2ch2o
‑
)2))，其允许进一步连接到增溶和/或可电离部分x。本发明的某些实施方案表示根据式(ch2)3op(o)(oh)2和n(ch3)(ch2)2op(o)(oh)2的部分l和x的组合。因此，此类磺酰胺具有通式so2nr3r4，其中r3和r4彼此独立，并且可表示h、烷基、杂烷基(例如，烷氧基：ch2och2、ch2ch2o、ch2ch2och2)，二氟甲基(cf2)的任何组合，
其中具有直链或支链，长度为c1至c
12
，并带有末端oh基团。
[0103]
式b中的n(r1)r2优选包含羰基或亲核反应性基团。取代基r1和r2彼此独立，且两者都可以用氢表示。它们中的一个可以是直链或支链烷基(全氟烷基)基团c1‑
c
12
。同时，r1和r2中的一个可以由羧酸残基(ch2)
n
cooh及其常规酯或反应性酯(ch2)
n
cor3表示，其中n是1至12之间的整数。残基r3是h，烷基，(包括叔丁基)，苄基，芴
‑9‑
基，多卤代烷基，ch2cn，多卤代苯基(例如，四氟或五氟苯基、五氯苯基)、2
‑
和4
‑
硝基苯基、n
‑
琥珀酰亚胺基、磺基
‑
n
‑
琥珀酰亚胺基、1
‑
氧基苯并三唑基或其他潜在亲核反应性离去基团。烷基链(或主链)(ch2)
n
可以是直链的或支链的。特别地，该式可描述为z
‑
nr1(ch2)
n
cor4，其中z是式b中的分子的其余部分，其也包括基团l和x。
[0104]
进一步，亲核反应性基团cor5可经由以下连接到芳基氨基n(r1)r2：(聚)亚甲基、氧亚甲基(ch2och2、ch2ch2och2、peg)羰基、碳酸盐、氨基甲酸酯、尿烷、含氮或含硫的接头(间隔基)，支链或直链的、特别是(ch2)
m
con(r6)、conh(ch2)
n
、(ch2)
m
oconh(ch2)
n
、co(ch2)
n
、co(o)nr6，(ch2)
m
so
2m
n(r6)、co(ch2)
m
s(ch2)
n
、(ch2)
m
s(ch2)
n
co、co(ch2)
m
so2(ch2)
n
、(ch2)
m
so2nr6及其组合；m和n是0至12的整数，r6＝烷基。反应性基团r5可通过含o、n和s的非芳香族杂环(例如，哌嗪、哌可啉、噁唑啉)连接。取代基r6可由h、烷基、羟烷基或全氟烷基c1‑
c
12
表示。
[0105]
式b中的取代基r1和r2之一可由伯氨基表示，因此包含羰基反应性芳基肼(r1＝nh2，r2＝烷基、全氟烷基)或通过羟基以形成芳基羟胺(arnhoh)。可替代地，式b中的烷基肼或羟胺反应性部分可以通过上面列出的反应性基团r4的接头连接到芳基氨基n(r1)r2。当r1或r2＝(ch2)
n
so2nr6nh2、且n＝1
‑
12时，磺酰肼构成一种特殊情况，而取代基r6可由h、烷基、羟烷基或全氟烷基c1‑
c
12
表示。对于具有反应性基团r4、r3和r5的情况，磺酰胺(sulfonylamide)(磺胺(sulfonamide)，硫酰胺(sulfamide))基团也可通过上文列出的多种接头连接。
[0106]
进一步，r1和r2可表示ch2‑
c6h4‑
nh2、coc6h4‑
nh2、conhc6h4‑
nh2或csnhc6h4‑
nh2，其中c6h4为1，2
‑
、1，3
‑
或1，4
‑
苯基，coc5h3n
‑
nh2或ch2‑
c5h3n
‑
nh2，其中c5h3n为吡啶2，4
‑
二基、吡啶
‑
2，5
‑
二基、吡啶
‑
2，6
‑
二基、吡啶
‑
3，5
‑
二基。
[0107]
取代基r1和r2也可表示烷基叠氮化物(ch2)
n
n3、炔烃(炔丙基)、马来酰亚胺基(具有亲核反应性双键的c4h3no2)或卤代酮官能团(function)(coch2x；x＝cl、br和i)，直接连接或通过为肼衍生物所列出的含羰基、酰胺基、氮或硫的接头连接；n＝1
‑
12。
[0108]
式b中的基团x表示提供增溶和/或可电离阴离子
‑
提供部分，特别是提供增强的电泳迁移率的部分。基团x可包括羟烷基(ch2)
n
oh、硫代烷基((ch2)
n
sh)、羧烷基((ch2)
n
co2h)、烷基磺酸基((ch2)
n
so3h)、烷基硫酸基((ch2)
n
oso3h)、烷基磷酸基((ch2)
n
op(o)(oh)2)或烷基膦酸基((ch2)
n
p(o)(oh)2)，其中n为0至12的整数。可替代地，ch2基团可由cf2代替。阴离子
‑
提供部分也可通过含o、n和s的非芳香族杂环(例如，哌嗪类，哌可啉类)连接。可替代地，基团x中的一个可以带有为基团r1和r2列出的任何羰基或亲核反应性部分，也可以具有为基团l列出的任何类型的连接键，并且独立于其他取代基。
[0109]
如上所述，式b的化合物可以以盐的形式存在和应用，该盐包括所有可能类型的阳离子，优选na

、li

、k

、nh
4
和有机铵或有机鏻阳离子。
[0110]
根据本发明的一个具体实施方案，在式b中的每种情况时，阴离子
‑
提供基团x可表示在一个或多个位点处(以及对于上文为l定义的每种类型的连接键)连接到相应接头基团
或ch2‑
c5h3n
‑
nh2，其中c5h3n为吡啶
‑
2，4
‑
二基、吡啶
‑
2，5
‑
二基、吡啶
‑
2，6
‑
二基或吡啶
‑
3，5
‑
二基；
[0120]
式c中在so2片段和残基x之间、n＝1
‑
5的(ch2)
n
‑
ch2接头可表示具有2
‑
6个碳原子的直链、支链或环状基团；
[0121]
x＝sh，cooh，oso3h，so3h，op(o)(oh)2，op(o)(oh)r
a
、其中r
a
＝任选取代的c1‑
c4烷基，p(o)(oh)2，p(o)(oh)r
a
、其中r
a
＝任选取代的c1‑
c4烷基；
[0122]
条件是在由式c表示的所有化合物中，在碱性条件下，即7<ph<14，式c的残基x中存在三个或六个带负电荷的基团，并且这些带负电基团表示至少部分去质子化的可电离基团残基，所述可电离基团选自以下：sh，cooh，oso3h，so3h，op(o)(oh)2，op(o)(oh)r
a
、其中r
a
＝c1‑
c4烷基或经取代的c1‑
c4烷基，p(o)(oh)2，p(o)(oh)r
a
、其中r
a
＝c1‑
c4烷基或经取代的c1‑
c4烷基。
[0123]
根据本发明更具体的实施方案，本发明的荧光染料由式c表示，其中在各种情况下x为so3h，且n为1
‑
12、优选1
‑
6，或其盐。
[0124]
根据本发明的另一具体实施方案，上述结构式b的化合物为如式d所示的磺酰胺衍生物
[0125][0126]
其中
[0127]
r1和/或r2彼此独立且可表示h、氘、烷基或氘取代烷基，其中烷基中的一个、几个或所有h原子可由氘原子取代，特别是具有1
‑
12个c原子、优选1
‑
6个c原子的烷基或氘烷基，例如ch3，c2h5，或直链的或支链的、任选取代的c3‑
c
12
、优选c3‑
c6烷基；特别是(ch2)
n
coor4，其中n＝1
‑
12、优选1
‑
5，r4可为h、ch2cn、2
‑
和4
‑
硝基苯基、2，3，5，6
‑
四氟苯基、五氯苯基、五氟苯基、n
‑
琥珀酰亚胺基、磺基
‑
n
‑
琥珀酰亚胺基，且(ch2)
n
中的烷基链可为直链或支链；和
[0128]
r1‑‑‑
r2可形成四元、五元、六元或七元非芳香族碳环，该碳环具有连接到该环中的一个碳原子上的附加的伯氨基nh2，仲氨基nhr
a
、其中r
a
＝任选取代的c1‑
c6烷基，或羟基oh；或任选地，r1‑‑‑
r2可形成四元、五元、六元或七元非芳香族杂环，其带有包括在该杂环中的一个杂原子如o、n或s；
[0129]
r1和/或r2可进一步表示：
[0130]
羟烷基(ch2)
m
oh，其中m＝1
‑
12、优选2
‑
6，具有直链或支链、任选取代的烷基链；r1或r2基团中的一个可以是碳酸盐或氨基甲酸酯衍生物(ch2)
m
ocoor5或(ch2)
m
nhcoor5，其中m＝1
‑
12且r5＝甲基、乙基、2
‑
氯乙基、ch2cn、n
‑
琥珀酰亚胺基、磺基
‑
n
‑
琥珀酰亚胺基、1
‑
氧基
苯并三唑基、苯基或取代苯基，诸如2
‑
和4
‑
硝基苯基、五氯苯基、五氟苯基、2，3，5，6
‑
四氟苯基，2
‑
吡啶基，4吡啶基；
[0131]
(ch2)
m
nr
a
r
b
，其中m＝1
‑
12、优选2
‑
6，具有直链或支链烷基链；r
a
，r
b
彼此独立，且代表氢和/或任选取代的c1‑
c4烷基；
[0132]
(ch2)
m
n3，m＝1
‑
12、优选2
‑
6，具有直链或支链烷基链；
[0133]
‑
(ch2)
n
coor4，其中n＝1
‑
12、优选1
‑
5，具有直链或支链烷基链(ch2)
n
，且r4选自h、直链或支链c1‑
c6烷基、ch2cn、2
‑
和4
‑
硝基苯基、2，3，5，6
‑
四氟苯基、五氯苯基、五氟苯基、n
‑
琥珀酰亚胺基、磺基
‑
n
‑
琥珀酰亚胺基、1
‑
氧基苯并三唑基；
[0134]
(ch2)
n
conhr5，其中n＝1
‑
12、优选1
‑
5且r5＝h，经取代或未经取代的c1‑
c6烷基，(ch2)
m
n3，(ch2)
m
‑
n
‑
马来酰亚胺基，(ch2)
m
‑
nhcoch2y(y＝br，i)，其中m＝1
‑
12、优选2
‑
6，在(ch2)
n
和r5中具有直链或支链的烷基链；
[0135]
进一步，r1或r2可以代表ch2‑
c6h4‑
nh2，coc6h4‑
nh2，conhc6h4‑
nh2或csnhc6h4‑
nh2，其中c6h4是1，2
‑
、1，3
‑
或1，4
‑
亚苯基，coc5h3n
‑
nh2或ch2‑
c5h3n
‑
nh2，其中c5h3n为吡啶
‑
2，4
‑
二基、吡啶
‑
2，5
‑
二基、吡啶
‑
2，6
‑
二基或吡啶
‑
3，5
‑
二基；
[0136]
r3＝h，(ch2)
q
ch2x，c2h5，直链或支链的c3‑
c6烷基，c
m
h
2m
or，其中m＝2
‑
6、具有直链或支链烷烃
‑
二基(alkane
‑
diyl)链c
m
h
2m
，以及r3＝h，ch3，c2h5，c3h7，ch3(ch2ch2o)
k
ch2ch2；其中k＝1
‑
12；而(ch2)
q
ch2接头可表示具有2
‑
6个碳原子的直链、支链或环状基团；
[0137]
在式d中，磺酰胺片段so2n和残基x之间的(ch2)
n
‑
ch2接头，其中n＝1
‑
12、优选1
‑
5，可表示具有2
‑
6个碳原子的直链、支链或环状基团；
[0138]
x＝sh，cooh，so3h，oso3h，op(o)(oh)2，op(o)(oh)r
a
、其中r
a
＝经取代或未经取代的c1‑
c4烷基，p(o)(oh)2，p(o)(oh)r
a
、其中r
a
＝经取代或未经取代的c1‑
c4烷基；
[0139]
条件是在由式d表示的所有化合物中，在碱性条件下，即7<ph<14，式c的残基x中存在三个、六个、九个或十二个带负电荷的基团，并且这些带负电基团表示至少部分去质子化的可电离基团残基，所述可电离基团选自以下：sh，cooh，so3h，oso3h，op(o)(oh)2，op(o)(oh)r
a
、其中r
a
＝c1‑
c4烷基或经取代的c1‑
c4烷基，p(o)(oh)2，p(o)(oh)r
a
、其中r
a
＝c1‑
c4烷基或经取代的c1‑
c4烷基。
[0140]
根据本发明的优选实施方案，上述式b、c和d中的取代基r1和r2定义如下：
[0141]
式b中的r1和/或r2表示h、氘、烷基或氘取代烷基，其中烷基中的一个、几个或所有h原子可被氘原子取代，特别是具有1
‑
12个c原子、优选1
‑
6个c原子的烷基或氘烷基，诸如甲基、乙基、丙基等，4，6
‑
二卤代
‑
1，3，5
‑
三嗪基(c3n3x2)，其中卤素x优选为氯，2
‑
、3
‑
或4
‑
氨基苯甲酰基(coc6h4nh2)，2
‑
、3
‑
或4
‑
氨基苯脲基(nconhc6h4nh2)，2
‑
、3
‑
或4
‑
氨基苯硫脲基(ncsnhc6h4nh2)，或连接的碳酸残基及其反应性酯，其通式为(ch2)
m1
coor3、(ch2)
m1
ocoor3、(ch2)
n1
coor3或(co)
m1
(ch2)
m2
(co)
n1
(nh)
n2
(co)
n3
(ch2)
n4
coor3，其中整数m1、m2和n1、n2、n3、n4分别独立地从1至12和从0至12，其中链(ch2)
m/n
是直链的、支链的、饱和的、不饱和的、部分或完全氘化的，和/或包括在碳环或含有n、o或s的杂环中，而r3为h、d或亲核反应性离去基团，优选包括但不限于n
‑
琥珀酰亚胺基、磺基
‑
n
‑
琥珀酰亚胺基、1
‑
氧基苯并三唑基、氰甲基、多卤代烷基、多卤代苯基、例如四氟或五氟苯基，2
‑
或4
‑
硝基苯基。
[0142]
式c和d的化合物可以以盐的形式存在和应用，该盐包括所有可能类型阳离子，特别是如上式b中所述的，优选na

、li

、k

、nh
4
和有机铵或有机鏻阳离子。
[0143]
上述结构通式b、c和d的特别优选化合物具有以下式之一：
[0144][0145]
本发明的一个优选实施方案涉及上式a
‑
b或a
‑
d的化合物，其中负电荷由几个伯磷酸基团提供，特别是双重o
‑
磷酸化7
‑
氨基吖啶酮
‑2‑
磺酰胺(两个磷酸基团)、三重o
‑
磷酸化1，6，8
‑
三[(ω
‑
羟烷基)磺酰基]
‑
芘
‑3‑
胺(三个磷酸基团)和1，6，8
‑
三[n
‑
(ω
‑
羟烷基)磺酰氨基]芘
‑3‑
胺。与apts相比，这些化合物具有更高的亮度和更好的电泳迁移率。
[0146]
本发明的新型化合物具有小分子尺寸，并且在优选实施方案中，提供了大幅增加的高负净电荷(z)(例如，对于磷酸化吖啶酮，至少z＝
‑
4，对于磷酸化芘染料，至少z＝
‑
6)。这两个要求分别相当于低流体动力半径和低质荷比(m/z)。因此，在对这些化合物和相应的标记碳水化合物进行动电测量时，可以在良好的分析分辨率下实现高速率和快速分离。
[0147]
负电荷由酸性基团提供，该酸性基团可以在碱性甚至中性介质中去质子化。磷酸基团优选地用于此目的，因为伯烷基磷酸盐(r
‑
opo3h2)的第一和第二酸性质子的pk
a
值分别在1
‑
2和6
‑
7范围内。因此，在碱性条件下，一个单一磷酸盐基团可以在缓冲溶液中引入两个负电荷(例如，在ph值为8时，存在r
‑
opo
32
‑
)。为了实现
‑
4的负电荷，连接两个磷酸基团是必要的，等等。然而，其他酸性基团，特别是选自如上式a
‑
b中定义的基团x的酸性基团也适用。
[0148]
通常，上式a
‑
b的化合物适合且有利地用作氨基酸、肽、蛋白质(包括初级和次级抗体、单结构域抗体、多西他赛(docetaxel)、抗生物素蛋白(avidin)、链霉抗生物素蛋白(streptavidin)及其修饰物)、适配子、核苷酸、核酸、毒素、脂质、碳水化合物(包括2
‑
脱氧
‑2‑
氨基葡萄糖和其他2
‑
脱氧
‑2‑
氨基吡喃糖苷、聚糖、葡聚糖)、生物素和其他小分子(即分子质量小于1500da，例如，肌动蛋白聚合诱导剂(jasplakinolide)及其修饰物)的荧光标记。
[0149]
化合物7
‑
r(r＝h，me)、13a、13b、16和18(下面的方案5)具有游离羟基，并且适合作为用于获得通式b的磷酸化芘染料的前体。特别地，化合物7
‑
r(r＝h，me)被直接磷酸化(三甲基磷酸盐中的pocl3)并提供染料8
‑
r(r＝h，me)。类似地，染料13a、b和18使用三甲基磷酸盐中的pocl3进行磷酸化。因此，前体染料13a和13b(在反应混合物的基本处理(work
‑
up)后)均生成化合物15。化合物16具有游离羧基，可以用作生物缀合的反应中心。因此，化合物16代表用于氨基酸、肽、蛋白质(包括初级和次级抗体、单结构域抗体、多西他赛、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白及其修饰物)、适配子、修饰的核苷酸、含氨基的修饰的核酸、毒素、脂质、碳水化合物(包括2
‑
脱氧
‑2‑
氨基葡萄糖和其他2
‑
脱氧
‑2‑
氨基吡喃糖苷)、修饰的生物素(例如，生物胞素)和其他小分子(即分子质量小于1500da(例如，肌动蛋白聚合诱导剂(jasplakinolide)及其修饰物))的荧光标记。
[0150][0151]
方案5
[0152]
因此，本发明的密切相关方面涉及式a
‑
b的化合物作为荧光试剂用于与广泛范围的分析物缀合的用途，其中该缀合物包括与化学实体(entity)或物质形成至少一个共价化学键或至少一个分子复合物，诸如胺、羧酸、醛、醇、芳香族化合物、杂环、染料、氨基酸、氨基酸残基与任何化学实体、肽、蛋白质、碳水化合物、核酸、毒素和脂质相偶联。
[0153]
所要求保护的化合物适用于并可用于荧光标记和检测目标分子的方法。典型地，这种方法意味着使根据上式a
‑
d中任一个的化合物与目标分子反应，所述目标分子选自包含以下的组：氨基酸、肽、蛋白质(包括初级和次级抗体、单结构域抗体、多西他赛、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白及其修饰物)、适配子、(修饰的)核苷酸，(修饰的)核酸、毒素、脂质、碳水化合物(包括2
‑
脱氧
‑2‑
氨基葡萄糖和其他2
‑
脱氧
‑2‑
氨基吡喃糖苷、聚糖、葡聚糖)、(修饰的)生物素(例如，生物胞素)和其他小分子，即分子质量小于1500da的分子(肌动蛋白聚合诱导剂(jasplakinolide))。标记后，通过色谱和/或动电技术分离、检测、定量和/或分离标记的荧光衍生物。
[0154]
进一步，本发明还包括碳水化合物
‑
染料缀合物，其包含根据上式a
‑
b或a
‑
d的荧光染料。
[0155]
更特别地，所述缀合物、特别是碳水化合物
‑
缀合物中的染料选自式6
‑
h、6
‑
me、8
‑
h、15或19和20的化合物，如下面的方案6所示。
[0156]
上式a
‑
b或a
‑
d的化合物适合且有利于用于还原糖的还原胺化，即单体(monomeric)、低聚(oligomeric)或聚合(polymeric)的碳水化合物具有游离形式或受保护形式的醛基，例如作为半缩醛，包括聚糖(如方案2和6所示)。
[0157]
因此，本发明的密切相关方面涉及此用途和用于还原糖的还原胺化的方法，其包括使上述式a
‑
d的化合物与单体(monomeric)、低聚(oligomeric)或聚合(polymeric)的碳水化合物反应，所述碳水化合物具有游离形式或作为半缩醛的醛基，包括聚糖，为了有足够的时间对标记的荧光衍生物进行还原胺化和色谱或动电分离，任选地然后通过光学光谱方法(包括荧光检测和/或质谱检测)检测分析物。方案6中给出了染料缀合物结构的实例。
[0158]
式a
‑
d的化合物和包含该化合物的碳水化合物
‑
染料缀合物构成了染料组，具有高负净电荷的特点，并伴有良好的吸收/发射性能(见表2)和电泳迁移率。
[0159][0160]
方案6
[0161]
本发明新型荧光染料的一般合成
[0162]
新型磺化2(7)
‑
氨基吖啶酮和1
‑
氨基芘染料的合成路线在下面的方案7
‑
10中给出。
[0163]
方案7描述了双重o
‑
磷酸化7
‑
氨基吖啶酮
‑2‑
[n，n'
‑
双
‑
(2
‑
羟乙基)]
‑
磺酰胺6
‑
h和6
‑
me的制备。根据wo 2007/049057和us2012/0015373中所述的步骤，在k2co3和催化量的cu(no2)2(185℃，2
‑
4h)的存在下2
‑
氯
‑5‑
硝基苯甲酸和苯胺之间的已知反应提供4
‑
硝基
‑
n
‑
苯基邻氨基苯甲酸(4
‑
nitro
‑
n
‑
phenylanthranilic acid)(未在方案5中显示)。将4
‑
硝基
‑
n
‑
苯基邻氨基苯甲酸被环化为2
‑
硝基吖啶
‑
9(10h)酮(1
‑
h)(pocl3，回流，3h)。
[0164]
进一步合成的实验细节在带有实例的特殊部分中给出。
[0165][0166]
方案7.双重o
‑
磷酸化7
‑
氨基吖啶酮
‑2‑
[n，n
‑
双
‑
(2
‑
羟乙基)]磺酰胺的制备。
[0167]
试剂和条件：a)nah，dmso，50
‑
60℃，然后加入ch3i，室温(r.t.)，过夜；b)h2so4中加入20％的so3，100℃，1.5小时；c)clso3h，50℃，2小时，然后室温过夜；d)二乙醇胺，thf水溶液或mecn水溶液，室温过夜；e)pocl3，(meo)3po，室温，然后加入et3n*h2co3缓冲液水溶液(ph 8)；f)h2，pd/c(10％pd，氧化形式)，丙醇
‑
2水溶液，室温和环境压力过夜；g)(tbuo)2pn(i
‑
c3h7)2，1h
‑
四唑，dmf，40℃，1.5小时；然后在癸烷中加入5
‑
6m tbuooh，0℃
‑
室温；h)tfa，mecn水溶液，室温；然后加入et3n*h2co3缓冲液水溶液(ph 8)。
[0168]
三重o
‑
磷酸化1，6，8
‑
三[[n
‑
(2
‑
羟乙基)
‑
n
‑
甲基]磺酰氨基]芘
‑3‑
胺8
‑
r的合成路线在方案8中示出。在带有实例的部分中给出了详细的实验步骤。
[0169][0170]
方案8.三重o
‑
磷酸化1，6，8
‑
三[[n
‑
(2
‑
羟乙基)
‑
n
‑
甲基]磺酰氨基]芘
‑3‑
胺的制备。试剂和条件：a)clso3h，65℃，3小时过夜；b)ch3nhch2ch2oh，mecn水溶液，室温过夜；c)pocl3，(meo)3po，室温，然后加入et3n*h2co3缓冲液水溶液(ph 8
‑
8.5)；d)(cf3co)2o，ch2cl2，et3n，室温；e)meoh，nahco3；f)ch3i，cs2co3，dmf，70℃，40分钟；g)na2co3，meoh水溶液；室温。
[0171]
三重o
‑
磷酸化1，6，8
‑
三[(3
‑
羟丙基)磺酰基]
‑
芘
‑3‑
胺15的合成路线在方案9中示出。实施例部分给出了详细的实验步骤。
[0172][0173]
方案9.三重o
‑
磷酸化1，6，8
‑
三[(3
‑
羟丙基)
‑
磺酰基]
‑
芘
‑3‑
胺15的制备。
[0174]
根据先验(priori)，芘衍生物7
‑
r/8
‑
r和15证明比7
‑
氨基吖啶酮
‑2‑
[n，n
‑
双
‑
(2
‑
羟乙基)]磺酰胺类6
‑
h和6
‑
me具有更好的光物理性质。特别是，可以预期到更高的摩尔消光系数和更高的荧光量子产率(更高的“亮度”)。例如，为了制备芘染料15，1
‑
氨基芘(10)—一种廉价的商业上可得的起始材料—被用作结构单元(building block)(方案9)。发明人还从1
‑
氨基芘(10)开始，使用已发表过的方法(sharrett等人，org.biomol.chem.2009，7，1461
‑
1470)合成了apts。1
‑
氨基芘(10)有一个氨基，作为电子
‑
供体残基和反应位点。将吸收光谱移动到红色是必需的，因为在336nm处化合物10具有吸收最大值，在445nm(在meoh中)处具有发射最大值。在芘荧光团中引入电子
‑
受体基团，然后进行氨基的单烷基化或双烷基化，可以实现荧光红移(bathochromlic shifts)和色谱红移(bathofluoric shifts)。随后的修饰发生在聚糖的还原胺化过程中，并将伯氨基转化为更多供电子性的仲胺或叔胺。取代基的电子效应可以图示，它们的相对强度可以通过哈米特(hammett)常数的大小和符号进行比较(见表1)。
[0175]
如果假定氨基连接到c
‑
1，则可以将取代基引入c
‑
3、c
‑
6和c
‑
8(在亲电取代反应过程中)。将受体基团引入芘系统的“活性”位置6和8(对应于苯环中的对位)以及c
‑
3(对应于苯环中的间位)导致具有红移带的供体
‑
受体染料的形成。这种红移是由于位置3、6和8上的电子
‑
供体氨基和吸电子基团之间的“推
‑
拉”电子效应造成的。例如，有价值的前体基团是apts中的磺酸残基(可转化为磺胺类；见方案8)和化合物14中的硫醚，硫醚可被氧化为砜并成为更强大的吸电子残基(方案9)。烷基砜(由化合物13b、15、16和18表示)在表1中具有最高的哈米特σ
‑
常数，这表明它们是比磺酰胺类(化合物7
‑
h、7
‑
me、8
‑
h、8
‑
me)更强大的受体。在染料设计中选择磺酰胺和烷基砜的另一个原因是，它们可以与连接伯磷酸基或其他可电离基团所需的羟基残基结合。
[0176]
表1.间位和对位的不同电子
‑
供体和电子
‑
受体基团的哈米特常数(hammett constants)。正值对应于电子
‑
受体；负值对应于电子
‑
供体。根据定义，氢原子具有“ζ(sigma)”常数的零值。这些数据来自hansch，a.leo，r.w.taft，a survey of hammett substituent constants andresonance and field parameters.chem.rev.1991，91，165
‑
195。
[0177][0178]
在开始向1
‑
氨基芘支架中引入任何基团之前(第一反应总是芳香族亲电取代)，在某些情况下，有必要保护1
‑
氨基芘10的氨基(方案9)。发明人使用与三氟乙酸酐的乙酰化(非常新的选择)并获得乙酰化胺11。在这种情况下，三氟乙酰基是比乙酰基更好的选择(例如，曾被li等人，j.am.chem.soc.1994，116，9890
‑
9893所用)，因为它是酸
‑
稳定的，但在温和的碱性条件下很容易裂解。在通过三氟乙酰化保护氨基后，化合物11的位置3、6和8上的亲电取代得到三溴氨基芘(12)。这种三溴化物表示一种非常重要的中间体，因为芳香族溴残基可以很容易地转化为许多其他官能团。例如，mispelaere
‑
canvivet等人，tetrahedron 2005，61，5253
‑
5259发布了一种引入硫醚基团的简便合成方法，其报告了一种钯
‑
催化的硫醇与芳基溴化物的交叉偶联。发现未受保护的3
‑
巯基
‑1‑
丙醇可直接用于获得三醇14。使用乙酸中的浓过氧化氢和钨酸钠作为催化剂，将14直接氧化为三磺酰衍生物13a(比较：xu等人，molecules 2010，15，766
‑
779)。化合物13a在甲醇中通过na2co3水溶液处理脱保护以生成游离胺13b，然后将其磷酸化为化合物15。
[0179]
使用三甲基磷酸盐中的pocl3直接磷酸化带有未保护氨基的芳香胺(方案8中的7
‑
r至8
‑
r和方案9中的13b至15)，然后使用et3n*h2co3缓冲液水溶液处理，证明是可行的。芳香氨基也经历了磷酸化，但由于电子密度很低，这些氨基很容易在水溶液中失去磷酸残基(在微酸或碱性条件下)。
[0180]
相反，染料8
‑
r(r＝h，ch3)和15中的伯磷酸基团在ph＝3(还原胺化)和ph＝8(电泳)时水解作用稳定。
[0181][0182]
方案10.带有衍生氮原子的基于氨基芘的荧光染料(16和18)。
[0183]
在碳酸钠的甲醇水溶液中，通过温和加热使三砜13a中的氨基脱保护，以良好的产率分离出氨基砜13b。在borch反应过程中，氨基砜13b与乙醛酸一水合物的还原胺化(borch等人，j.am.chem.soc.1969，91，3996
‑
3997)产生了芘染料500p(16)，产率为38％。该反应通过在几天内将部分氰基硼氢化钠、乙醛酸一水合物和浓盐酸水溶液添加到化合物13b中来进行。中等产率可以解释为三个吸电子烷基磺酰基使氨基失活的低反应性。化合物16表示具有多功能反应性中心
‑
羧基的荧光染料。16中的氨基是羧甲基化的，很有意思的是，看看这种衍生化(与烷基相比，供体效率较低)会导致什么样的色谱红移和荧光红移。还制备了n
‑
甲基化芘染料18。甲基是比羧甲基更强大的电子供体，在这方面，化合物18可能代表比化合物16更好的碳水化合物还原胺化产物的模型。
[0184][0185]
方案11.烷基磺酰取代的荧光染料23a，b的制备。
[0186]
如方案11所示，烷基磺酰基取代(特别是磺基烷基磺酰基取代)1
‑
氨基芘染料23a及其同系物23b的合成不需要保护相应双官能团合成子(synthone)中的磺酸基(so3h)。与制备其“磷酸化相应物(phosphorylated counterpart)”—染料15(见方案9)相比，特别是考虑到一些有用的磺烷基取代合成子，例如，3
‑
巯基
‑1‑
丙烷磺酸钠或2
‑
巯基乙烷磺酸钠是商业可获得的，这大大简化了整个过程。该反应产生一种高度水溶性染料，该染料具有三个可电离基团，通过硫代醚官能团连接到染料核心。相对于含硫醚的中间体21a、b甚至是
apts——一种公认的基准染料，硫代醚被氧化成砜后会产生较大的色谱红移和荧光红移(结构见方案11和12，光谱特性见表2)。染料的氨基部位的保护基的裂解形成碳水化合物
‑
反应性化合物，该化合物表示为通式c的情况。整个合成序列在上面的方案11中描述。
[0187]
新型染料的光谱特性
[0188]
表2.磷酸化氨基吖啶酮6
‑
h和6
‑
me、磺酰氨基吡喃8
‑
r(r＝h，me)、烷基磺酰
‑
修饰的芘染料15、16、18、23a，它们的一些前体和相关化合物的光谱性质(结构见方案9、10、11和12)。有关所选择的实际uv/vis吸收光谱和荧光光谱，另请参见图2a和图2b。
[0189][0190]
a
‑
荧光量子产率的绝对值(若未另行说明)；b
‑
teab是ph＝8
‑
8.5的et3n*h2co3缓冲液水溶液；c
‑
在375nm激发；d
‑
相对值，以罗丹明6g为参考染料，φ
fl
＝0.9；e
‑
对于单n
‑
烷基化apts衍生物的吸收和发射最大值分别为457nm和516nm(ε～19000m
‑1cm
‑1)；f
‑
在515nm处激发；g
‑
化合物23a在光谱上与其同系物23b相同；h
‑
在496nm激发下，以0.1m naoh中φ
fl
＝0.9的荧光素作为参考染料的相对值；i
‑
从teab转换为ph 7.4的pbs缓冲液几乎不影响光谱性质，即，φ
fl
。
[0191][0192]
方案12.磷酸化荧光染料19、20、磺化染料23a和apts作为具有大量净电荷和不同光谱性质的参考化合物。
[0193]
表2中的结构特征和光谱数据表明，双重磷酸化氨基吖啶酮6
‑
h和6
‑
me，三重磷酸化芘染料8
‑
h、8
‑
me和15符合上文定义的荧光标签的标准。此外，有必要证明它们是否可用于聚糖的还原胺化，以及它们的缀合物的发射是否不会干扰用apts标记的聚糖的发射(结构和光谱数据，见方案9
‑
12和表2)。例如，化合物6
‑
r(r＝h，me)的m/z比分别等于134和138(apts的m/z＝151)。它们有多个吸收最大值并发射橙色光(两个发射最大值分别为485nm和585nm，相对强度为约1：2；参见图2a)。虽然它们在488nm处的吸收相对较低，但红移发射是一个显著特征，并伴随着约160nm的斯托克斯位移(stokes shift)。化合物6
‑
r的荧光量子产率的绝对值为5
‑
6％。因此，尽管它们的亮度相对较低，但发射黄橙色的吖啶酮染料6
‑
r可能至少与更亮的发射黄绿色的氨基芘染料8
‑
r和15一样有用。这两种类型的染料都代表了新的标签，可用于标记聚糖，包括“重(heavy)”和“异(exotic)”聚糖，这些聚糖由于apts的净电荷相对较低(
‑
3)和带有apts标签的“重”碳水化合物的迁移率较低造成的限制而无法检测到。事实上，由于存在四个负电荷和极低的m/z比，此处引入的磷酸化染料能够为提供更好的缀合物的电泳迁移率，减少其迁移时间，从而揭示和突出大体积和大质量(highlight bulky and massive)的碳水化合物。
[0194]
表2中列出的所有芘染料都是高荧光的。非磷酸化芘7
‑
r(r＝h，me)、13b、16和18允许以更高的精确度估计消光系数。最长波长波段的消光系数在18000
‑
23000之间，而最大值的位置在465至507nm之间。因此，在488nm发射的氩离子激光器可以很容易地诱导荧光。发射最大值在535至563nm范围内，荧光量子产率一直很高(71
‑
97％)。因此，磺化1
‑
氨基芘(通式b
‑
d)代表比2
‑
磺酰胺基
‑7‑
氨基吖啶酮(式a)更亮的染料。亮度与消光系数(488nm处)和
荧光量子产率的乘积成正比。我们可以假设，对于吖啶酮染料，该值为约1500
×
0.06＝90，对于芘
–
20000
×
0.9＝18000。这种粗略估计意味着，三磺化1
‑
氨基芘为比2
‑
磺胺基
‑7‑
氨基吖啶酮的约200倍更亮的染料。该性质使得本发明的1
‑
氨基芘染料(式b
‑
d)是比2
‑
磺胺基
‑7‑
氨基吖啶酮(式a)和apts更优越的标签。如果假设对于apts缀合物，最大(457nm)处的消光系数为19000(方案3)，并且488nm处的吸收通常为457nm处最大吸收的约35％，则可以获得6000的相对亮度(假设相同的荧光量子产率)。因此，本发明的染料在488nm激光器激发下的亮度为apts的约3倍(与聚糖的缀合物形式)。本发明的芘染料，特别是化合物8
‑
h、15和23a、b代表了新的标签，可用于标记聚糖，包括“重”和“异”聚糖，这些聚糖由于apts的相对低净电荷(
‑
3)和低亮度造成的限制而无法检测到。同样重要的是，这些氨基芘染料(即，8
‑
h、13b、15、23a、b)当从中性(pbs缓冲液，ph＝7.4)转换为碱性(teab缓冲液，ph＝8.0
‑
8.5)介质时，显示出荧光量子产率的显著变化。
[0195]
为了将发射带移到红色光谱区，制备了n
‑
甲基化衍生物8
‑
me。该染料具有n
‑
甲胺基，因此，它代表非常类似于由聚糖和母体染料8
‑
h形成的还原胺化产物(与方案2中的化合物6相比)的荧光团。吸收最大值已移到红色( 37nm；8
‑
h
→8‑
me)，但发射最大值经历了“仅”19nm的荧光红移(见表2)。因此，斯托克斯位移从79nm减小到61nm。
[0196]
还有另一种工具可以增加系列芳香族荧光染料的色谱红移和荧光红移，前提是它们具有电子
‑
供体和电子
‑
受体基团，它们之间具有所谓的“推
‑
拉”电子相互作用(直接极性缀合)。在1
‑
氨基芘染料的情况中，供电子团是固定的(并且其供电子性质不能增强)，但是位置3、6和8处的吸电子团(electron
‑
withdrawing groups)可以改变。例如，化合物14(方案9)中的硫代醚可被氧化为相应的砜，并获得比化合物7
‑
r、8
‑
r和9
‑
r(方案8)中的磺酰胺更强的吸电子团。实际上，烷基砜基团(r
‑
so2，存在于化合物13b、15、16、18和23a、b中；见方案8、9和11)具有最高的哈米特ζ
‑
常数，见表1，这表明它们甚至是比磺酰胺部分(存在于化合物7
‑
h、7
‑
me、8
‑
h、8
‑
me中；见方案8和9)更强的受体。然而，在制备化合物8
‑
h和15并比较其在水溶液中的光谱性质(表2)后，可以确定，如预期的那样，色谱红移为12nm，但发射最大值的位置和波段形态相同(如图2b所示)。对此最简单的解释是基于这样一个假设，即单个氨基(作为供体)“处于极限”，并且不能为由三个非常强的受体基团(无论它们有多强)修饰的π
‑
系统提供更多的电子密度。幸运的是，在氮原子还原烷基化后(见方案2)，发生了进一步的色谱红移和荧光红移(与上文讨论的化合物8
‑
h和8
‑
me的光谱数据相比)，化合物15提供了与聚糖的明亮缀合物。
[0197]
本发明进一步的方面涉及用于合成式c荧光芘染料的一般且直接的方法，其中在任何情况下x为so3h，n为1
‑
12、优选1
‑
6，其涉及芳基卤素与具有预合成的硫代烷基和未保护的磺酸官能团的双功能试剂的交换反应，然后任选地将硫醚氧化为砜。因此，该合成产生磺烷基磺酰基
‑
取代的染料，其中磺酸基团(so3h)通过烷基磺酰基(烷烃磺酰基)接头so2(ch2)
n
连接到芳香族染料核心。
[0198]
更特别地说，该方法至少包括以下步骤：1)用适当的保护基团保护1
‑
氨基芘；2)卤化，通常为溴化，如方案9所示；3)三卤代
‑
取代的芘衍生物与具有硫醇和磺酸(磺酸盐)官能团的双官能团试剂的交叉
‑
偶联反应，通常用钯或铜盐或复合物催化，如方案11所示；4)硫醚氧化成砜；5)氨基的脱保护。
[0199]
本发明的密切相关方面涉及一种合成荧光氨基芘染料的方法，该染料在水中带有
477
‑
510nm处的吸收最大值、净电荷为0或向下至
‑
6和更大量净电荷，以及535
‑
560nm处的发射最大值，具有通式b和c，特别是化合物7
‑
r、13a、13b、15、16、18、23a和23b，其涉及芳基卤素与经取代的硫烷基官能团的交换反应，随后氧化为砜，并且任选地，在羟基位点进行磷酸化。
[0200]
本发明进一步涉及一种合成净电荷为
‑
4、
‑
6和更大量净电荷的磷酸化荧光氨基芘或氨基吖啶酮染料的方法，其具有通式a和d，特别是化合物6
‑
r和8
‑
r，其涉及氨基醇的磺胺化，随后在羟基点进行磷酸化。
附图说明
[0201]
图1基于分离的聚糖分析的主要步骤。
[0202]
图2a显示了新型氨基吖啶酮染料：6
‑
h、6
‑
me在teab缓冲液(ph8
‑
8.5)中的的实际归一化的吸收和荧光光谱。
[0203]
图2b显示了新型磷酸化氨基芘染料8
‑
h和15在teab缓冲液(ph8
‑
8.5)中的实际归一化吸收和荧光光谱。
具体实施方式
[0204]
以下实施例更详细地说明本发明。
[0205]
一般材料和方法
[0206]
1.1.1制备方法
[0207]
如果没有另外说明，反应是在氩气环境下进行的。溶剂符合reag.pheur(欧洲药典试剂)纯度标准(p.a.)。使用市售物质时未经进一步纯化，购自sigma aldrich，acros organics，alfa aesar，abcr，merck millipore，carbolution chemicals等。
[0208]
1.1.2色谱方法
[0209]
1.1.2.1薄层色谱法(tlc)
[0210]
在硅胶60f
254
(merck millipore)上进行正相tlc。使用硅胶60rp
‑
18f
254
(merck millipore)进行反相tlc。在浓缩区为10
×
2.5cm的hptlc硅胶60f
254
(merck millipore)上进行制备tlc。通过将tlc板暴露于紫外光(254或366nm)下检测化合物。使用茚三酮溶液(0.5％于乙醇中)检测胺。
[0211]
1.1.2.2柱层析法
[0212]
粒径为40
‑
63μm的硅胶60购自merck millipore。在60
‑
50c
18
柱(macherey nagel)上进行反相柱层析。去活化硅胶60购自mp biomedical。常规分离使用自动化isolera
tm one系统(biotage gmbh)进行，该系统带有市售的萃取柱(cartridge)。
[0213]
1.1.3分析仪器
[0214]
1.1.3.1吸收光谱
[0215]
用双光束紫外
‑
可见(uv
‑
vis)分光光度计(varian，4000系列)记录吸收光谱。为了测定吸收光谱，使用了路径长度为1cm的石英池。在quantaurus
‑
qy absolute pl量子产率光谱仪c11347(quantaurus qy)或cary eclipse荧光光谱仪(varian)上获得了发射光谱和荧光量子产率。
[0216]
1.1.3.2核磁共振(nmr)
[0217]
在agilent 400mr dd2光谱仪上记录核磁共振光谱。所有光谱参考四甲基硅烷作为内部标准物(δ＝0.00ppm)，使用cdcl3中的chcl3(7.26ppm)、cd3od中的chd2od(3.31ppm)、(cd3)2co中的chd2cocd3(2.05ppm)或dmso
‑
d6中的dmso
‑
d5中的残留质子信号。信号的多重性描述如下：s＝单峰，br.s＝宽单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰。耦合常数
n
j
x，y
以hz表示，其中n为耦合的原子核x和y之间的键数。hsqc间接测定到的
13
c信号中，只记录到与h原子相连的碳原子的共振。
[0218]
1.1.3.3质谱(ms)
[0219]
在varian 500
‑
ms光谱仪上获得了带有电喷雾电离(esi)的低分辨率质谱(esi
‑
ms)。在bruker micro tof(esi
‑
tof
‑
ms)光谱仪上获得高分辨质谱(esi
‑
hrms)。
[0220]
1.1.3.4高效液相色谱法(hplc)
[0221]
hplc系统(knauer)：带有10ml泵头的smartline泵1000(2x)，紫外检测器2500，柱恒温器4000，混合室，用于分析的带有20或50μl环的进样阀和用于制备柱的500μl环的进样阀；6
‑
门
‑3‑
通道(6
‑
port
‑3‑
channel)切换阀；分析柱：eurospher
‑
100c18 5μm(如未特别说明)，或kinetex c18 100,5μm,250
×
4.6mm，流速1.2ml/min；制备柱：kinetex c
18 100，5μm，250x21 mm，流速10ml min/ml，溶剂a：水 0.1％v/v三氟乙酸(tfa)；溶剂b：mecn 0.1％v/v tfa(如果没有另外说明)。用于制备级的磷酸化染料的分离纯化，乙腈
‑
水体系中含有0.05
‑
0.1m的et3n*h2co3缓冲液(ph＝8
‑
8.9；sigma
‑
aldrich，或通过1m et3n水溶液和由固体co2蒸发获得的co2气体自己制备的)。
[0222]
实施例1
[0223]
荧光吖啶酮染料及其前体的合成
[0224]2‑
硝基吖啶
‑
9(10h)
‑
酮(1
‑
h)
[0225][0226]2‑
氯
‑5‑
硝基苯甲酸和苯胺在k2co3和催化量的cu(no2)2(185℃，2
‑
4h)存在下反应得到4
‑
硝基
‑
n
‑
苯基邻氨基苯甲酸，根据r.ramage、b.maltman、g.cotton、s.c.m couturier和r.a.s mcmordie的wo 2007/049057(03.05.2007)所述的步骤；另外参见：j.a.smith和r.m.west的us2012/0015373(19.01.2012)。4
‑
硝基
‑
n
‑
苯基邻氨基苯甲酸环化为2
‑
硝基吖啶
‑
9(10h)
‑
酮(1
‑
h)(pocl3，回流，3小时)。1h nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ＝12.4(s，1h，nh)，8.96(d，j＝2.8，1h，h
‑
1)，8.46(dd，j＝9.2，2.7hz，1h，h
‑
3)，8.23(dd，j＝8.1，1.6hz，1h，h
‑
8)，7.81(ddd，j＝8.5，7.0和1.6hz，1h，h
‑
6/7)，7.66(d，j＝9.1hz，1h，h
‑
4)，7.58(dm，1h，h
‑
5)，7.37(ddd，j＝8.1，7.0和1.1hz，1h，h
‑
7/6)ppm。
[0227]2‑
硝基
‑9‑
羰基
‑
9，10
‑
二羟基吖啶
‑7‑
磺酸(2
‑
h)
[0228][0229]
化合物1
‑
h干燥并经20％发烟硫酸(oleum)磺化(100℃，1.5h)得到标题化合物2
‑
h(us2012/0015373)。例如，向530mg(2.21mmol)的2
‑
硝基
‑
10h
‑
吖啶
‑9‑
酮(1
‑
h)中，滴加含20％so3的h2so4(25ml)，在100℃下搅拌反应混合物90分钟。然后非常小心、缓慢地将反应混合物倒入冰(>30g)中，加入4ml浓盐酸水溶液。棕色沉淀物通过离心分离，用4m hcl(2
×
5ml)水溶液洗涤，冻干。产率
‑
463mg(65％)棕色固体。hplc：t
r
＝5.6min；h2o/acn( 0.1％tfa)：在25min内80/20
→
50/50，在254nm处检测。1h nmr(400mhz，d2o)δ＝7.61(dd，j＝8.0和2.6hz，1h，h
‑
3)，7.59(br.s，1h，h
‑
1)，7.57(d，j＝2.6hz，1h，h
‑
8)，7.33(dd，j＝8.6和2.1hz，h
‑
6)，6.53(dd，j＝8.8和1.0hz，1h，h
‑
4)，6.47(d，j＝8.6hz，1h，h
‑
5)ppm。esi
‑
ms(c
13
h8n2o6s，m ＝ 320)，负极模式(negative mode)：m/z (rel. int.，％) ＝ 319 (100)[m
‑
h]
‑
。
[0230]
n，n
‑
(2
‑
羟乙基)
‑2‑
硝基
‑9‑
羰基
‑
9，10
‑
二羟基吖啶
‑7‑
磺酰胺(4
‑
h)
[0231][0232]
将化合物2
‑
h(55mg，0.17mmol)冷却至0℃，滴加氯磺酸(1.7ml，d＝1.75g/ml，3.0g，26mmol)。将反应混合物在室温下搅拌6h，倒入冰(7
‑
10g)中。通过离心分离米黄色沉淀，用冰水(2
×
5ml)洗涤，真空干燥。将制备的磺酰氯在0℃下加入n
‑
甲基乙醇胺(86mg，0.80mmol)的mecn/h2o(1：1)溶液中。将反应混合物升温至室温，在50℃下搅拌过夜。沉淀物逐渐溶解。产率
‑
33mg(48％)黄色固体，在真空中(乙腈蒸发过程中)浓缩反应混合物得到。hplc：t
r
＝16.7min h2o/can( 0.1％tfa)：在25min内80/20
→
50/50，254nm。1h nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ＝12.7(br.s，1h，nh)，8.95(d，j＝2.6hz，1h，h
‑
1)，8.55(d，j＝2.2hz，1h，h
‑
8)，8.51(dd，j＝9.2，2.7hz，1h，h
‑
6)，8.13(dd，j＝8.8，2.2hz，1h，h
‑
3)，7.72(“t”，j＝8.9hz，2h，h
‑
45)，4.83(t，j＝5.5hz，2h，oh)，3.51(q，j＝6.3hz，4h，ch2)，3.18(t，j＝6.4hz，4h，ch2)ppm。c
17
h
17
n3o7s，m＝407g/mol)；esi
‑
ms，负极模式：m/z(rel.int.，％)＝406(100)[m
‑
h]
‑
。
[0233]
n，n'
‑
(2
‑
羟乙基)
‑2‑
硝基
‑9‑
羰基
‑
9，10
‑
二羟基吖啶
‑
7磺酰胺o，o'
‑
二磷酸(5
‑
h)
[0234][0235]
将化合物4
‑
h(50mg，0.12mmol)溶于10ml mecn中，将此溶液在ar下加入到5ml新鲜蒸馏的pocl3中。将悬浮液在30℃下搅拌2h。在真空中去除溶剂和多余的pocl3，残渣溶解在teab缓冲液水溶液(1m)中，用mecn
‑
0.05m teab缓冲液水溶液(1：3)作为洗脱液在rp
‑
18上分离得到标题化合物。产率
‑
27mg(40％)黄色固体(冻干后)。hplc：t
r
＝3.5min；h2o/acn( 0.1％tfa)：在25min内70/30
→
0/100，254nm。hplc：t
r
＝9.2min，h2o/acn( 0.1％tfa)：80/20
→
50/50，在25min，254nm。1h nmr(400mhz，d2o)δ＝8.72(d，j＝2.6hz，1h，h
‑
1)，8.35(d，j＝2.2hz，1h，h
‑
8)，8.24(dd，j＝9.3，2.6hz，1h，h
‑
6)，7.95(dd，j＝8.9，2.2hz，1h，h
‑
3)，7.47(d，j＝8.9hz，1h，h
‑
4/5)，7.39(d，j＝9.2hz，1h，h
‑
5/4)，3.84
‑
3.78(m，4h，ch2)，3.37(t，j＝5.9hz，4h，ch2).
31
p nmr(81mhz，d2o)：δ＝1.0ppm。c
17
h
19
n3o
1 3
p2s，m＝567g/mol).esi
‑
ms，负极模式：m/z(rel.int.，％)＝566(100)[m
‑
h]
‑
。
[0236]2‑
氨基
‑
n，n
‑
(2
‑
羟乙基)
‑9‑
羰基
‑
9，10
‑
二羟基吖啶
‑
7磺酰胺o，o'
‑
二磷酸(6
‑
h)
[0237][0238]
pd/c(氧化形式(vwr international，10％pd，7mg)与丙醇
‑
2在氩气下混合(注意：当在空气干燥中，在反应后处理过程中、特别是过滤时pd/c会导致起火！)，加入水(1ml)；用氢气冲洗混合物，搅拌30分钟。将化合物5
‑
h(27mg，0，48mmol)溶于丙醇
‑
2(0.5ml)中，并将该溶液加入到预还原的催化剂的悬浮液中。反应混合物在氢气环境中搅拌过夜。hplc控制显示几乎完全转化为具有黄色荧光的新物质，t
r
＝2.9min(hplc面积92％)，8.8min(7.5％；起始材料)h2o/acn( 0.1％tfa)：在25分钟内80/20
→
50/50，254nm。用氩气冲洗反应混合物，通过离心分离催化剂，并用丙醇
‑
2水溶液洗涤，真空浓缩合并的上清液。标题化合物通过制备hplc分离得到(见下)。c
17
h
21
n3o
11
p2s(精确质量537.0372)，esi
‑
ms，负极模式：m/z(rel.int.，％)＝536(100)[m
‑
h]
‑
。esi
‑
hrms：536.0278(真实值(found)[m
‑
h]
‑
)，计算值：536，0299。最终纯化(糖的还原胺化)通过制备hplc完成，其使用0.05m teab缓冲液水溶液(ph 8)和kinetex柱(5μm c18 100，250x10mm)，acn/h2o：在20min内5/95
‑
30/70，4ml/min；t
r
～10
‑
11分钟(强烈依赖于分析物的浓度)。纯度控制：0.05m teab缓冲液水溶液(ph 8)和
kinetex色谱柱(5μm c18100，250x4.6mm)，acn/h2o：在20min内5/95
‑
50/50，1.2ml/min；t
r
＝8.1分钟。1h nmr(400mhz，d2o)δ＝8.35(d，j＝2.2hz，1h，h
‑
8)，7.82(dd，j＝9.3和2.6hz，1h，h
‑
6)，7.29(d，j＝9.3，1h，h
‑
5)，7.12(d，j＝2.2hz，1h，h
‑
1)，7.04(dd，j＝2.4和8.9hz，1h，h
‑
3)，7.01(d，j＝8.9hz，1h，h
‑
4)，3.87(q，j＝6.0，4h，(oh)2poch2)，3.40(t，j＝5.9hz，4h，nch2)，3.05(q，～16h，et3n中的ch2n)，1.13(t，～23h，et3n中的ch3)ppm。λ
max
(吸收，h2o(ε，m
‑1cm
‑1)＝217(13500)，260(26000)，295(28000)，420(3700)nm；λ
max
(发射，h2o)＝485nm(在405nm激发)，586nm(在300nm、420nm或470nm激发)；荧光寿命
‑
22.3ns(在405nm激发，在485nm检测到发射)和3.7ns(在470nm激发，在585nm检测到发射)。
[0239]
10
‑
甲基
‑2‑
硝基吖啶
‑
9(10h)
‑
酮(1
‑
me)
[0240][0241]
nah(600mg的60％矿物油悬浮液；360mg，15mmol)用干燥戊烷(3
×
15ml)在氩气环境中洗涤，悬浮在干燥的dmso中，然后在该悬浮液中加入少部分2
‑
硝基吖啶
‑
9(10h)
‑
酮(1
‑
h，2.5g，10.4mmol)。有机物逐渐溶解，溶液变成品洋红色(紫罗兰色)。升温至50
‑
60℃，搅拌30min，冷却至室温，将mei(4ml，64mmol)加入反应混合物中。在室温搅拌过夜的情况中，悬浮液逐渐变黄。然后将反应混合物倒冰水(75ml)中。沉淀通过过滤收集，用水清洗，从acoh(200ml)中重结晶。产率
‑
2.1g(80％)黄色固体。hplc：t
r
＝13.9min a/b：在25min内70/30
→
0/100，254nm。c
14
h
10
n2o3，m＝254g/mol).esi
‑
ms，正极模式：m/z(rel.int.，％)＝277.0579(100)[真实值(found)m na]

；277.0584(计算值).1h nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ＝9.01(d，j＝2.9，1h，h
‑
1)，8.50(dd，j＝9.6，2.9hz，1h，h
‑
3)，8.32(ddd，j＝7.9，1.6，0.7hz，1h，h
‑
8)，8.02(d，j＝9.6hz，1h，h
‑
4)，7.95
‑
7.85(m，2h，h
‑
6/7)，7.44(ddd，j＝8.0，6.2，1.7hz，1h，h
‑
5)，3.98(s，3h，ch3)ppm。
[0242]
10
‑
甲基
‑2‑
硝基
‑9‑
羰基
‑
9，10
‑
二羟基吖啶
‑7‑
磺酸(2
‑
me)
[0243][0244]
向化合物1
‑
me(400mg，1.57mmol)滴加h2so4中20％so3(7.2ml，16.8mmol)，在100℃搅拌反应混合物90分钟。然后将反应混合物小心缓慢地倒入冰(>30g)中，加入4ml浓hcl。棕色沉淀经离心分离，用冷的4m hcl(2
×
5ml)洗涤，冻干。产率
‑
得到376mg(72％)的标题化合物，为棕色固体。hplc：t
r
＝7.9min a/b：在25min内80/20
→
50/50，254nm。1h nmr(400mhz，dmso
‑
d6)：δ＝9.03(d，j＝2.9hz，1h，h
‑
1)，8.55(d，j＝2.1hz，1h，h
‑
8)，8.52(dd，j＝9.5，
2.9hz，1h，h
‑
3)，8.08
‑
8.02(m，2h，h
‑
4，h
‑
6)，7.90(d，j＝9.1hz，1h，h
‑
5)，4.00(s，3h，ch3)ppm。c
14
h
10
n2o6s，m＝334g/mol.esi
‑
ms，负极模式：m/z(rel.int.，％)＝333(100)[m
‑
h]
‑
.1h nmr(100mhz，dmso
‑
d6)：δ＝176.7(co)，146.2，143.3，142.6，141.2，132.8，128.1，123.8，123.3，121.4，121.0，118.8，117.3，35.3(n
‑
me)ppm。
[0245]
n，n
‑
(2
‑
羟乙基)
‑
10
‑
甲基
‑2‑
硝基
‑9‑
羰基
‑
9，10二羟基吖啶
‑7‑
磺酰胺(4
‑
h)
[0246][0247]
向化合物2
‑
me(62mg，0.19mmol)在0℃下滴加氯磺酸(3.5ml，53mmol)。将反应混合物在50℃下搅拌30分钟，在室温下过夜。然后将反应混合物滴入冰中(10g)，离心分离米黄色沉淀。用冰水(2
×
10ml)洗涤，冻干。将获得的磺酰氯在0℃下加入二乙醇胺(185mg，1.76mmol)的thf(2ml)溶液中。室温搅拌过夜。沉淀物离心分离，冰水洗涤，冻干。产率
‑
得到57mg(70％)的标题产品，为黄色固体。hplc：t
r
＝16.9min a/b：在25min内80/20
→
50/50，254nm。esi
‑
ms，正极模式：m/z(rel.int.，％)＝444(100)[m na]

.c
18
h
19
n3o7s，m＝421g/mol.esi
‑
ms，正极模式：m/z＝422.1005[真实值(found)m h]

；422.1016(计算值)；444.0829[真实值(found)m na] ；444.0836(计算值).1h nmr(400mhz，dmso
‑
d6)：δ＝8.99(d，j＝2.8hz，1h，h
‑
1)，8.61(d，j＝1.6hz，1h，h
‑
8)，8.56(dd，j＝9.5和2.9hz，1h，h
‑
3)，8.19(dd，j＝9.1，2.4hz，1h，h
‑
6)，8.10(“d”，j＝9.4hz，2h，h
‑
4，5)，4.82(t，j＝5.5hz，2h，oh)，4.02(s，3h，nme)，3.52(q，j＝6.0hz，4h，och2)，3.20(t，j＝6.3hz，4h，nch2)ppm。
[0248]
n，n
‑
(2
‑
羟乙基)
‑
9，10
‑
二羟基
‑9‑
羰基
‑
10
‑
甲基
‑2‑
硝基吖啶
‑7‑
磺酰胺o，o'
‑
二磷酸(5
‑
me)
[0249][0250]
向4
‑
me(31mg，73mol)的三甲基磷酸(0.5ml)溶液中，在0℃、ar下添加pocl3(0.2ml)。悬浮液在室温下搅拌2小时。然后在真空中去除溶剂和多余的pocl3，用过量的et3n
‑
h2co3缓冲液水溶液(ph 7.5)稀释残渣，并保持在4℃过夜。在rp
‑
18上用mecn
‑
0.1m et3n
‑
h2co3缓冲液水溶液(1：5)作为洗脱液分离标题化合物，冻干并用于最后的还原步骤(见下文)。c
18
h
21
n3o
13
p2s，m＝581g/mol。esi
‑
ms，负极模式：m/z(rel.int.，％)＝580.0191(100)[真实值(found)m
‑
h]
‑
；580.0198(计算值)。
[0251]2‑
氨基
‑
n，n'
‑
(2
‑
羟乙基)
‑
9，10
‑
二羟基
‑9‑
羰基
‑
10
‑
甲基吖啶
‑7‑
磺酰胺o，o
‑
二磷酸(6
‑
me)
[0252][0253]
pd/c(vwr international，氧化形式，10％pd)，7mg在氩气下与丙醇
‑
2混合，加入水(1ml)；混合物用氢气冲洗，并搅拌30min。将化合物5
‑
me(27mg)溶于丙醇
‑
2(0.5ml)中，将该溶液被加入到预还原催化剂的悬浮液中。反应混合物在氢气环境中搅拌过夜。hplc控制显示，几乎完全转化为具有黄色荧光的新物质，t
r
＝16.1min(hplc面积95％)，19.2min(5％；起始材料)h2o/acn( 0.05m et3n*h2co3缓冲液在水相中)：在20min内99/1
→
80/20，二极管阵列检测器，kinetex柱5μm c18 100，4.6x250mm，20℃，1.2ml/min。用氩气冲洗反应混合物，离心分离催化剂，用丙醇
‑
2水溶液洗涤，真空浓缩合并的上清液。标题化合物通过制备hplc分离，其使用0.05m teab缓冲液水溶液(ph 8)和kinetex柱(5μm c18100，250
×
10mm)，acn/h2o：在20min内5/95
‑
30/70，4ml/min；t
r
～11.4min。c
18
h
23
n3o
11
p2s(精确质量551.0529)。esi
‑
ms，负极模式：m/z(rel.int.，％)＝550(100)[m
‑
h]
‑
.esi
‑
hrms：550.0441(真实值(found)[m
‑
h]
‑
)，计算值：550，0456。1h nmr(400mhz，d2o)：δ＝8.29(d，j＝2.4hz，1h，h
‑
8)，7.84(dd，j＝9.3和2.4hz，1h，h
‑
6)，7.43(d，j＝9.3，1h，h
‑
5)，7.12(d，j＝9.3hz，1h，h
‑
3)，7.03(d，j＝2.8hz，1h，h
‑
1)，6.97(dd，j＝9.2和2.8hz，1h，h
‑
4)，3.85(q，j＝6.1，4h，poch2)，3.49(s，3h，nme)，3.37(t，j＝5.9hz，4h，nch2)，3.04(q，～14h，et3n中的ch2n)，1.13(t，～20h，et3n中的ch3)ppm。
31
p nmr(162mhz，cdcl3)：δ＝1.1ppm。λ
max
(0.05m et3n*h2co3缓冲液水溶液，ph 8，ε，m
‑1cm
‑1)＝219(10 300)，263(18 600)，299(18500)，430(2900)nm；λ
max
(发射，0.05m et3n*h2co3缓冲液水溶液，ph 8)＝485nm和585nm(两个最大值以约1：2的比率，与激发波长无关，激发波长可能为300nm、420nm或470nm)；荧光量子产率：5
‑
6％(绝对值)。
[0254]
实施例2
[0255]
荧光1
‑
氨基芘染料及其前体的合成
[0256]
根据z.sharrett，s.gamsey，l.hirayama，b.vilozny，j.t.suri，r.a.wessling，b singaram，org.biomol.chem.2009，7，1461
‑
1470.所述，由1
‑
氨基芘和20％的发烟硫酸，在na2so4的存在下制备了3
‑
氨基芘
‑
1，6，8
‑
三磺酸三钠盐(apts)。
[0257]3‑
氨基
‑
n，n'，n
”‑
三(2
‑
羟乙基)
‑
n，n'，n
”‑
三甲基芘
‑
1，6，8
‑
三磺酰胺(7
‑
h)
[0258][0259]
将446mg(0.98mmol)apts(三钠盐)在冰浴中冷却至0℃，然后在搅拌下滴加氯磺酸(7.5ml，0.11mol)。将反应混合物在65℃下搅拌3h。冷却至室温后，将反应混合物转移到碎冰中。三磺酰氯的红色沉淀通过离心分离，用冰水(2
×
10毫升)洗涤，并在0℃下加入到n
‑
甲基乙醇胺(1.0g，13mmol)的乙腈水溶液(1：1，25ml)中。反应混合物在室温下用力搅拌，直到它变得均匀，然后冻干。以chcl3/meoh/h2o(80：18：2)混合物为洗脱剂，在sio2(100g)上色谱分离得到标题化合物。产率
‑
经二次色谱纯化获得252mg(41％)橙棕色固体。hplc：t
r
＝15.8min，acn/h2o：在25min内20/80
‑
50/50，1.2ml/min，254nm。c
25
h
32
n4o9s3(精确质量628.1331)；esi
‑
hrms：651.1212(真实值(found)[m na]

)，计算值：651，1224。1h nmr(400mhz，cd3od)δ＝9.19(d，j＝9.8hz，1h)，9.06(s，1h)，8.99(d，j＝9.6hz，1h)，8.82(d，j＝9.8hz，1h)，8.74(d，j＝9.7hz，1h)，8.18(s，1h)，3.69(m，6h，ch2)，3.42(m，6h，ch2)，3.04(s，3h，nch3)，3.01(s，6h，2xnch3)ppm；λ
max
(吸收)＝477nm(ε＝22 400m
‑1cm
‑1，meoh)，λ
max
(发射)＝535nm(meoh，在470nm激发)；荧光寿命5.6ns(meoh)；荧光量子产率(0.96；在meoh中的绝对值)。
[0260]3‑
氨基
‑
n，n'，n
”‑
三(2
‑
羟乙基)
‑
n，n'，n
”‑
三甲基芘
‑
1，6，8
‑
三磺酰胺o，o'，o
”‑
三磷酸三(三乙基铵盐)(8
‑
h)
[0261][0262]
将化合物7
‑
h(40mg，64μmol)溶于(meo)3po(5ml)中，在室温搅拌下将该溶液加入新鲜蒸馏的pocl3(0.2ml)中。观察到微弱的放热反应，溶液变成棕橙色。反应混合物在室温下搅拌数小时。在真空(首先使用旋转蒸发器，然后
‑
油泵；0.5mbar，6℃，用干冰冷却的冷阱(trap)，用于收集三甲基磷酸盐和pocl3)中去除所有挥发性物质(过量的pocl3和大部分的
三甲基磷酸盐)。用1m et3n*h2co3缓冲液(teab；初始ph＝8)处理并搅拌残渣，控制ph。也发生氨基磷酸化，但是这个磷酸基很容易被裂解。当溶液变酸时加入新鲜的部分teab缓冲液，直到ph稳定在约5
‑
7。在iproh/h2o/25％nh3水溶液中(10/5/1)中、常规sio2上进行tlc控制是可能的；r
f
～0.3(带绿色荧光的黄斑)。将反应混合物冻干，使用iproh/h2o/25％nh3水溶液中(10/5/1)混合物为洗脱剂，在常规sio2上色谱分离得到标题化合物。hplc控制显示，含有该物质的均一组分t
r
＝10.2min(acn/h2o( 0.1％tfa)：在25min内20/80
‑
50/50，1.2ml/min，254nm)。冻干得到60mg的橙红色泡沫。c
25
h
35
n4o
18
p3s3(精确质量868.0321)*
×
nh
3 esi
‑
ms，负极模式：m/z(rel.int.，％)＝867(100)[m
‑
h]
‑
，889(60)[m
‑
2h na]
‑
。
[0263]
最终纯化通过制备hplc完成，其使用0.1m teab缓冲液和制备型kintex柱(例如，kinetex，5μm c18 100，250x4.6mm，acn/h2o：在20min内10/90
‑
30/70，1.2ml/min；t
r
＝10.8min)。洗脱液经冷冻干燥后得到标题化合物，为黄色泡沫。1h nmr(400mhz，cd3od)δ＝9.14(d，j＝9.7hz，1h)，9.03(s，1h)，8.96(d，j＝9.7hz，1h)，8.77(d，j＝9.8hz，1h)，8.67(d，j＝9.7hz，1h)，8.17(s，1h)，3.94
‑
4.06(m，6h，ch2)，3.49
‑
3.59(m，6h，ch2)，3.08(s，3h，nch3)，3.04(q，j＝7.3hz，18h，et3n中的ch2n)，3.02(s，3h，nch3)，1.22(t，j＝7.3hz，27h，et3n中的ch3ch2)ppm；λ
max
(吸收)＝205，237，305和471nm(0.05m et3n*h2co3缓冲液水溶液，ph 8)，λ
max
(发射)＝544(0.05m et3n*h2co3缓冲液水溶液，ph 8)；荧光寿命5.9ns(在h2o中；在470nm激发)；荧光量子产率：0.77(h2o，标准：香豆素153在乙醇中发射效率为0.54，λ
excit
＝400nm)，0.88(在0.05m et3n*h2co3缓冲液水溶液的绝对值，ph 8；在460nm激发).
[0264]3‑
(三氟乙酰)氨基
‑
n，n'，n
”‑
三(2
‑
羟乙基)
‑
n，n'，n
”‑
三甲基芘
‑
1，6，8
‑
三磺酰胺(9
‑
h)
[0265][0266]
将化合物7
‑
h(179mg，0.28mmol)悬浮于10ml dcm中，在室温下加入10％三氟乙酸酐的dcm溶液(d＝1.33g/ml，0.9ml，～0.57mmol)，然后加入et3n(126μl，d＝0.73g/ml，0.91mmol)。将反应混合物搅拌30min。减压蒸发所有挥发性物质，将残渣溶于甲醇(50ml)，加入nahco3(50mg)。室温搅拌30min后，用乙酸中和反应混合物，将所有挥发性物质真空去除。这些操作从羟基中除去三氟乙酸基团。使用丙酮(2:1)为洗脱剂，通过常规硅胶(50g)柱色谱分离得到标题化合物。产率
‑
165mg(82％)黄色固体。hplc:t
r
＝10.8min，acn/h2o:在25min内20/80
‑
100/0，254nm。c
27
h
31
f3n4o
10
s3，(精确质量724.1154).esi
‑
ms，负
极模式:m/z(rel.int.，％)＝723(100)[m
‑
h]
‑
。1h nmr(400mhz，丙酮
‑
d6)δ＝11.2(br.s，1h，nh)，9.49(d，j＝10.0hz，1h)，9.38(“dd”，j＝9.7和1.9hz，2h)，9.26(s，1h)，9.02(s，1h)，8.76(d，j＝9.7hz，1h)，3.83
‑
3.90(m，3h，oh)，3.71(m，6h，och2)，3.43(m，6h，nch2)，3.08/3.06/3.06(3
×
s，∑9h，nme)ppm。
19
f nmr(376mhz，丙酮
‑
d6)δ＝
‑
75.7ppm。
[0267]3‑
[n
‑
甲基
‑
n
‑
(三氟乙酰基)]氨基
‑
n，n'，n
”‑
三(2
‑
羟乙基)
‑
n，n'，n
”‑
三甲基芘
‑
1，6，8
‑
三磺酰胺(9
‑
me)
[0268][0269]
在氩气下将csco3(42mg，0.13mmol)和ch3i(960mg，6.7mmol)加入到化合物7
‑
h(120mg，0.17mmol)的dmf(2ml)溶液中。在70℃下搅拌反应混合物40min，减压蒸发溶剂。使用以15:1的dcm和甲醇混合物作为洗脱剂，在常规sio2(50g)上用色谱法分离得到标题化合物；产率
‑
110mg(88％)黄色固体。由于仲酰胺基团的存在，在该物质的1h nmr谱中检测到两个旋转异构体(两组信号)，因此很难解释。hplc:t
r
＝12.2min，acn/h2o:在25min内20/80
‑
100/0，254nm。c
28
h
33
f3n4o
10
s3(精确质量738.1311)。esi
‑
ms，正极模式:m/z(rel.int.，％)＝739(100)[m h]

，761(35)[m na]

。
[0270]3‑
甲氨基
‑
n，n'，n
”‑
三(2
‑
羟乙基)
‑
n，n'，n
”‑
三甲基芘
‑
1，6，8
‑
三磺酰胺(7
‑
me)
[0271][0272]
标题化合物由相应的n
‑
甲基
‑
n
‑
三氟乙酰胺(9
‑
me；见上文)在用na2co3处理后获得，将其作为饱和溶液在甲醇水溶液(约1:1)中过量吸收，使得反应混合物保持均匀。使用15:1的dcm和甲醇的混合物作为洗脱剂，通过sio2色谱法将产物分离为橙色固体(20mg)。
[0273]1h nmr(400mhz，cd3od)δ＝9.15(d，j＝9.8hz，1h)，9.06(s，1h)，8.98(d，j＝9.6hz，1h)，8.77(d，j＝9.8hz，1h)，8.63(d，j＝9.7hz，1h)，7.93(s，1h)，3.77
‑
3.63(m，6h，ch2)，3.40(m，6h，ch2)，3.21(s，3h，nch3)，3.00(s，3h，nch3)，2.99(s，6h，2xnch3)ppm；c
26
h
34
n4o9s3(精确质量642.1488)。hrms(esi):665.1353(真实值(found)[m na]

)，计算值:665.1380.λ
max
(吸收)＝493nm(ε＝23000m
‑1cm
‑1，meoh)，λ
max
(发射)＝549nm(meoh)；荧光寿命5.9ns(meoh)，荧光量子产率:0.97(在meoh中的绝对值)；0.83(在meoh使用罗丹明6g作为标准的相对值(qy＝0.94在乙醇)，在480nm激发)。
[0274]3‑
甲基氨基
‑
n，n'，n
”‑
三(2
‑
羟乙基)
‑
n，n'，n
”‑
三甲基芘
‑
1，6，8
‑
三磺酰胺o，o'，o'
‑
三磷酸(8
‑
me)作为三价(tris)(三乙基铵盐)
[0275]
在0℃下，将化合物7
‑
me(40mg,54μmol)的0.5ml(meo)3po溶液滴加入pocl3(74mg,480μmol)的0.1ml(meo)3po溶液中。然后将反应混合物在室温下搅拌1.5h。所有挥发性物质(过量的pocl3和大部分的三甲基磷酸盐)在真空中移除(首先使用旋转蒸发器，然后使用油泵；0.5mbar,60℃，用干冰冷却的冷阱收集三甲基磷酸盐)。用1m et3n*h2co3缓冲液(teab；初始ph＝8)处理并搅拌残渣，控制ph值。当溶液变酸时加入新鲜的部分teab缓冲液，直到ph值稳定在约5
‑
7。然后将反应混合物加载到rp
‑
18(约30g)上，使用1:4的mecn和0.1m et3n*h2co3缓冲液水溶液(ph 7.5)的混合物洗脱标题化合物。产率
‑
63％，黄色固体。hplc:t
r
＝6.9min h2o/acn( 0.1％tfa):在25min内80/20
→
0/100,254nm。c
26
h
37
n4o
18
p3s3(精确质量882,0478)。esi
‑
ms，负极模式:m/z(rel.int.，％)＝881(100)[m
‑
h]
‑
，440(15)[m
‑
2h]2‑
。λ
max
(吸收)＝502nm(h2o)，λ
max
(发射)＝563nm(h2o)；荧光量子产率为0.85(h2o，标准品:罗丹明6g，在乙醇中的发射效率为0.94，λ激发＝500nm)。发现这种物质在糖的还原胺化反应中是不反应的。
[0276]
2,2,2
‑
三氟
‑
n
‑
(芘
‑1‑
基)乙酰胺(11)
[0277][0278]
在搅拌下并使用超声波浴将1
‑
氨基芘(10)(1.00g,4.60mmol)溶于干燥dcm(30ml)中。滴加三氟乙酸酸酐(d＝1.51,772μl,1.17g,5.55mmol,1.21eq.(当量))超过10min。得到的悬浮液在室温搅拌30分钟。过滤去除沉淀，用环己烷(3
×
15ml)洗涤，真空干燥。还要过滤除去在滤液中观察到的白色沉淀物。合并的沉淀物(浅灰色粉末)代表标题化合物(1.13g,3.61mmol,79％)。1h nmr(400mhz,丙酮
‑
d6):δ＝8.11(t,3j
h,h
＝7.6hz,1h,7
‑
h),8.20(d,3j
h,h
＝9.1hz,1h),8.22(d,3j
h,h
＝8.4hz,1h,2
‑
h),8.23(d,3j
h,h
＝9.3hz,1h),8.23(d,3j
h,h
＝9.1hz,1h),8.34(d,3j
h,h
＝7.6hz,2h,6
‑
h,8
‑
h),8.35(d,3j
h,h
＝8.4hz,1h,3
‑
h),8.82(d,3j
h,h
＝9.3hz,1h),10.78(br.s,1h,nh)ppm。
13
c nmr(101mhz,丙酮
‑
d6):δ(ppm)＝122.5(ch),125.2(c
q
),125.4(ch),125.9(c
q
),126.0(ch),126.7(ch),126.9(ch),127.0(c
q
)127.6(ch),128.2(ch),128.8(ch),129.1(c
q
)129.2(ch),131.7(c
q
),131.8(c
q
),132.2(c
q
)ppm。由于强度低，cf3和co信号未被检测到。
19
f nmr(376mhz,丙酮
‑
d6):δ(ppm)＝
‑
75.7(s,cf3)ppm。c
18
h
10
f3no(313.0714)hr
‑
ms(esi):真实值(found)314.0783[m h]

；计算值314.0787。
[0279]
2,2,2
‑
三氟
‑3‑
n
‑
[3，6，8
‑
三(溴)芘
‑1‑
基]
‑
乙酰胺(12)
[0280][0281]
n
‑
三氟乙酰
‑1‑
氨基芘11(870mg,2.76mmol)悬浮于硝基苯(30ml)中，50℃搅拌30min。将溴(500μl,19.5mmol,7.07当量)溶于硝基苯(5ml)中，加入到芘溶液中。反应混合物在密闭容器中80℃搅拌30min。然后使混合物达到室温。用环己烷(20ml)稀释后，过滤去除沉淀，用环己烷(2
×
25ml)洗涤，真空干燥。获得作为淡黄色粉末的产物(1224mg,2.26mmol,81％)。1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6):δ＝8.39(d,3j
h,h
＝9.7hz,1h,10
‑
h),8.47(d,3j
h,h
＝9.7hz,1h,9
‑
h),8.51(d,3j
h,h
＝9.3hz,1h,5
‑
h),8.59(d,3j
h,h
＝9.3hz,1h,4
‑
h),8.66
(s,1h,2
‑
h),8.80(s,1h,7
‑
h)ppm。
19
f nmr(376mhz,dmso
‑
d6):δ＝
‑
73.57(s,cf3)。ms(esi):m/z(负极模式,％)＝548(100)[m]
‑
。hr
‑
ms(esi):对于c
18
h7nof
379
br
280
br([m
‑
h]
‑
)计算值547.7937,真实值(found)547.7930.
[0282]
2,2,2
‑
三氟
‑
n
‑
[3，6，8
‑
三[(3
‑
羟丙基)硫烷基]芘
‑1‑
基]乙酰胺(14)
[0283][0284]
k2co3(221.2mg,400μmol,0.53当量)和net3(40μl)悬浮于干燥dmf(4ml)中，用氩气冲洗15min。加入3
‑
巯基
‑1‑
丙醇(d＝1.067mg/ml,272μl,290mg,3160μmol,4.35当量),溴化芘衍生物12(400mg,757μmol)和干燥dmf(40ml),然后柔和的氩气流在溶液中鼓泡20分钟。然后加入pd2(dba)3(197.6mg,216μmol,0.30当量)和xantphos(140.4mg,242.8μmol,0.33当量)。混合物在85℃、氩气下搅拌18h。在真空中去除溶剂,残渣溶解在meoh中,应用于并进行快速层析(snap ultra 100g柱，dcm/meoh，2
‑
18％meoh
‑
梯度，超过15cv(柱体积))得到作为浅黄色固体的标题化合物14(298mg,511μmol,70％)。这个过程在不同的规模上重复了几次，可靠地给出了50
‑
70％的标题产品的产率。1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6):δ＝1.80(m,6h,ch2ch2ch2),3.28(m,6h,sch2ch2),3.55(m,6h,hoch2ch2),4.63(m,3h,oh),8.06(d,3j
h,h
＝9.47hz,1h,9
‑
h),8.17(br.s,2h,2
‑
h,7
‑
h),8.50(d,3j
h,h
＝9.47hz,1h,9
‑
h),8.53(d,3j
h,h
＝9.50hz,1h,5
‑
h),8.53(d,3j
h,h
＝9.50hz,1h,4
‑
h),11.85(s,nh,1h)ppm。
13
c nmr(101mhz,dmso
‑
d6):δ＝29.9(ch2),30.0(ch2),31.7(ch2),31.9(ch2),32.0(ch2),59.2(ch2),59.2(ch2),59.2(ch2),116.2(d,1j
f,c
＝289.3hz),121.8(ch),123.2(ch),123.7(ch),124.2(ch),124.4(c
q
),124.6(c
q
),124.7(c
q
),125.5(ch),127.2(ch),127.4(c
q
),127.6(c
q
),128.6(2xc
q
),132.3(c
q
),132.8(c
q
),132.9(c
q
),156.2(d,2j
c,f
＝36.7hz)ppm。
[0285]
19
f nmr(376mhz,dmso
‑
d6):δ＝
‑
73.15(s,cf3)ppm。hplc:t
r
＝8.3min(mecn/h2o在25min 50:50
→
100:0 0.1％tfa，在254nm检测)。hr
‑
ms(esi):对于c
27
h
28
nof3s3([m
‑
h]
‑
)计算值582.1060,真实值(found)582.1049。
[0286]
2,2,2
‑
三氟
‑
n
‑
[3，6，8
‑
三[(3
‑
羟丙基)磺酰基]芘
‑1‑
基)]
‑
乙酰胺(13a)
[0287][0288]
三醇14(135mg,232μmol)悬浮在acoh(20ml)和h2o(1ml)的混合物中。然后加入二水合钨酸钠(19.1mg,57.9μmol,0.25eq.)，冰浴冷却该溶液至粘稠。然后加入h2o2水溶液(85
‑
90％，d＝～1.45,5.00ml，～189mmol，～82当量)超过10min。在冰浴中搅拌该溶液30min。去除冰浴后，在室温下搅拌混合物2，直到反应完成(tlc)。通过冷冻干燥去除溶剂，将残渣溶解在mecn/h2o中。加入在真空中去除所有溶剂后，将样品进行快速层析(snap ultra 25g柱,acn/meoh 5％dcm，meoh 1
‑
10％
‑
梯度，超过20cv)。获得作为黄色固体的分离的化合物13a(113mg,116μmol,50％)。
[0289]1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6):δ)＝1.78(m,6h,ch2ch2ch2),3.41(m,6h,hoch2ch2),3.73(m,6h,sch2ch2),4.59(m,3h,oh),8.83(d,3j
h,h
＝9.46hz,1h,10
‑
h),9.02(s,1h,2
‑
h),9.26(s,1h,7
‑
h),9.35(m,2h,4
‑
h,4
‑
h),9.47(d,3j
h,h
＝9.46hz,1h,9
‑
h),12.35(s,nh,1h)ppm。
13
c nmr(101mhz,dmso
‑
d6):δ＝25.7(ch2),25.9(ch2),53.2(ch2),53.3(ch2),53.5(ch2),58.4(ch2),58.4(ch2),115.91(d,1j
f,c
＝289.0hz),124.3(ch),124.8(ch),125.0,125.3,127.3,127.9,128.0,128.1,129.5(ch),131.1(ch),132.1(ch),132.2,132.3,134.5(ch),156.5(t,2j
c,f
＝38.2hz)ppm。
19
f nmr(376mhz,dmso
‑
d6):δ＝
‑
73.46(s,cf3)ppm。tlc(sio2):r
f
＝0.68(acn:dcm:h2o＝10:1:1).hr
‑
ms(esi):对于c
27
h
28
no
10
f3s3([m
‑
h]
‑
)计算值678.0755,真实值(found)678.0756.
[0290]
3,6,8
‑
三[(3
‑
羟丙基)磺酰基]
‑
芘
‑1‑
胺(13b)
[0291][0292]
保护的芘衍生物13a(20mg,29μmol)悬浮于meoh(6ml)中。加入稀释的na2co3水溶液(750μl饱和na2co3水溶液与5ml水混合),在室温下搅拌该溶液30min,然后在50℃下搅拌30min，然后在室温下搅拌90min。加入和meoh，并在减压下去除溶剂。粗产物用fcc(snap ultra 10g柱,dcm/meoh,2
‑
20％meoh
‑
梯度，超过12cv(柱体积))纯化，分离得到产物13b为橙色固体(14mg,24μmol,81％)。1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6):δ(ppm)＝1.73(m,6h,ch2ch2ch2),3.45(m,6h,och2ch2),3.51(m,6h,sch2ch2),4.60(m,3h,oh),8.25(s,1h,2
‑
h),7.83(br.s,2h,nh2),8.77(d,3j
h,h
＝9.56hz,1h),8.87(d,3j
h,h
＝9.66hz,1h),8.93(d,3j
h,h
＝9.66hz,1h),9.02(s,1h),9.15(d,3j
h,h
＝9.56hz,1h)ppm。
13
cnmr(101mhz,dmso
‑
d6):δ＝25.9,26.0,26.1,52.3,52.5,53.4,58.5,58.5,58.6,115.8,115.9,116.9,118.5,121.0,126.1,126.4,127.3,127.9,128.0,128.8,130.0,132.8,134.1,136.9,148.5ppm。hplc:t
r
＝13.1min(mecn/h2o在25min内10:90
→
100:0 0.1％tfa，在225nm检测)。tlc(sio2):r
f
＝0.38(dcm:meoh＝9:2).hr
‑
ms(esi):对于c
25
h
29
no9s3([m
‑
h]
‑
)计算值582.0932,真实值(found)582.0927。uv
‑
vis(在meoh中):ε＝21000m
‑1cm
‑1,λ
max
(吸收)＝486nm,λ
max
(荧光)＝534nm,qy＝0.80。
[0293]
三
‑
o
‑
磷酸化3，6，8
‑
三[(3
‑
羟丙基)磺酰基]
‑
芘
‑1‑
胺(15)
[0294][0295]
将脱保护的芘衍生物13b(2.00mg,3.43μmol)的三甲基磷酸(0.2ml)溶液在氩气下滴加到新鲜蒸馏并冰
‑
冷却的pocl3(0.25ml,2.69mmol)。该混合物在0℃搅拌30min、在室温
搅拌4h。所有挥发性成分在真空中(0.7mbar)蒸馏到一个在干冰/丙酮浴中冷却的烧瓶中(首先在室温下，随后加热到60℃)，残渣进一步通过冻干(0.02mbar)进行干燥。在残渣中加入et3n
‑
h2co3缓冲液水溶液(1m，约6
‑
8ml)，直到ph调整到8(气体释放)。样品经冷冻干燥浓缩至约1ml体积，用制备hplc(kinetex 5μm evo c18 100a 250x21mm柱，mecn/水 0.05m teab,带有mecn梯度10
‑
30％，超过20min，峰值在9.1min)纯化。
[0296]1h nmr(400mhz,cd3od):δ＝1.24(t,36h,j＝7hz,12ch3,3et3n)2.04(m,6h,ch2ch2ch2),3.58
‑
3.72(m,6h,ar
‑
so2ch2ch2),3,07(q,j＝7hz,24h,ch2ch3,3et3n),3.88
‑
3.93(m,6h,ch2ch2so3),8.17(s,1h),8.73(d,j＝9.5hz,1h),8.73(d,j＝9.5hz,1h),8.86(d,j＝9.5hz,1h),9.18(s,1h)9.21(d,j＝9.5hz,1h),ppm。
[0297]
13
c nmr(101mhz,cd3od):δ＝9.2(ch3),21.6(ch2),22.1(ch2),25.8(ch2),47.4(ch2),54.1(ch2),55.3(ch2),56.5(ch2),63.8(ch2),71.0(ch2),71.6(ch2),117.8(c),118.3(ch),120,2(ch),122.9(ch),127.7(c),128.2(c),128.7(ch),129.3(c),129.8(c),130.2(ch),131.8(ch),134.8(c),136.0(c),138.3(c),149.8(c),ppm。
31
p nmr(161.9mhz,cd3od):δ＝0.97ppm(s,op(o)(oh)2))。
[0298]
hplc:t
r
＝5.48min(mecn/h2o在20min内10:90
→
100:0 0.05mteab，在254nm检测)。tlc(rp
‑
sio
2 c18):r
f
＝0.7
‑
0.8(mecn:h2o 0.05m teab＝9:2).ms(esi):对于c
25
h
32
no
18
p3s3(822.9994):[m
‑
h]
‑
计算值821.9922。uv
‑
vis(0.05m et3n*h2co3(teab)缓冲液水溶液,ph 8
‑
8.5):λ
max
(吸收)＝203,236,305,477nm；λ
max
(发射)＝542nm,ε＝19600m
‑1cm
‑1,qy
fl.
＝92％(在teab缓冲液中，ph 8
‑
8.5，用带有积分球(integration sphere)的hamamatsu仪器c11347
‑
12测量的绝对值)和74
‑
76％,由带有r2658pmt的fluorolog
‑
3光谱仪测量，相对于以荧光素的碱性溶液为标准品，其qy
fl.
＝90％，在0.1m naoh中，在496nm激发)。
[0299]
n
‑
[3,6,8
‑
三[(3
‑
羟丙基)磺酰基]芘
‑1‑
基]甘氨酸(16)
[0300][0301]
将脱保护的氨基芘13b(19mg,34μmol)悬浮在meoh(11ml)中。加入乙醛酸一水合物(12.6mg,136μmol,4.0当量)，再加入浓hcl(12μl,140μmol,4.3当量)酸化混合物。在室温搅拌1h后，加入nabh3cn(17mg,270μmol,8.0当量)。3h后，再加入另一部分的乙醛酸一水合物(11mg,120mol,3.5当量)。搅拌过夜后，再加入第二部分的nabh3cn(29mg,460mol,14当量)和浓盐酸(20μl,240μmol,7.1当量)。在室温下再搅拌1天，加入第三部分的乙醛酸一水合物(91mg,990μmol,29当量)，nabh3cn(27mg,430μmol,12.6当量)和浓hcl(20μl,240μmol,7.1
当量)，反应搅拌一夜。在真空中去除溶剂，粗产物通过rp
‑
柱层析纯化(h2o acn 0.2％tfa，9
‑
25％
‑
can梯度)。分离产物为红色固体(8.3mg,13μmol,38％)。
[0302]1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6):δ＝1.74(m,6h,ch2ch2ch2),3.38(m,6h,sch2ch2),3.63(m,6h,hoch2ch2),4.26(br.s,2h,ch2cooh),4.59(m,3h,oh),7.89(br.s,1h,nh)8.45(m,2h,4
‑
h,5
‑
h),8.81(d,3j
h,h
＝9.46hz,1h,10
‑
h),8.89(s,1h,2
‑
h),9.06(s,1h,7
‑
h),9.21(d,3j
h,h
＝9.46hz,1h,9
‑
h)ppm。tlc(sio2):r
f
＝0.22(acn:h2o:dcm 甲酸＝20:2:1)。
[0303]
hplc:t
r
＝4.4min(mecn/h2o在25min内30:70
→
100:0 0.1％tfa，在254nm检测)。hplc:t
r
＝9.5min(mecn/h2o在25min内10:90
→
100:0 0.1％tfa，在465 nm检测)。ms(esi):m/z(负极模式,％)＝641(100)[m]
‑
.hr
‑
ms(esi):对于c
27
h
31
no
11
s3([m na]

)计算值664.0951,真实值(found)664.0925。uv
‑
vis(在meoh中):ε＝18000m
‑1cm
‑1,λ
max.
(吸收)＝499nm,λ
max.
(荧光)＝553nm,qy＝0.71。
[0304]
3,6,8
‑
三[(3
‑
羟丙基)磺酰基]芘
‑1‑
(甲胺)(18)
[0305][0306]
化合物14(75mg,0.13mmol)在氩气下悬浮于干燥的dmf(0.1ml)中，加入cs2co3(55mg,0.17mmol)，然后加入mei(0.15ml)。在螺旋盖(screw
‑
cap)管中，在50℃下搅拌反应混合物1小时。hplc表明反应完全。hplc:起始物质t
r
＝13.7min(mecn/h2o 30:70
→
100:0 0.1％tfa，在25min在254nm检测)。hplc:产物t
r
＝15.8min(mecn/h2o在25min内30:70
→
100:0 0.1％tfa，在254nm检测)。在真空下去除dmf，残渣在二氯甲烷
‑
水混合物中被吸收。将有机层分离，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，真空蒸发。化合物17(56mg,78％，n
‑
甲基化产物，结构见合成的总体方案)在sio2(25g)上、用含0
‑
5％meoh的乙酸乙酯洗脱，经色谱层析分离得到。为了使其氧化为砜，将化合物17溶于乙酸(5ml)中，加水(3ml)，再加入na2wo4*2h2o(12mg，催化剂)，该混合物冷却至0℃。在0℃下加入过氧化氢(1.5ml约80％的溶液)。反应混合物变暗，然后暗色消失。hplc显示，完全转化为新物质，t
r
＝8.48min(在25min内，mecn/h2o 30:70
→
100:0 0.1％tfa，在254nm检测)。所有挥发性物质在真空中被去除，干燥的残渣在乙腈水溶液中溶解。中间化合物中cf3co基团的裂解(脱保护)过程如下:加入饱和na2co3水溶液(约20wt
‑
％，1.5ml)，室温搅拌该溶液。乙腈
‑
水的比例必须以这样的方式选择，即加入1.5ml饱和na2co3水溶液将提供均匀的反应混合物。反应混合物几分钟内变为亮橙色；在室温下搅拌过夜。hplc结果表明，完全转化为新物质(标题化合物)，t
r
＝6.4min(在25min内，mecn/h2o 30:70
→
100:0 0.1％tfa，在254nm检测)。加入冰acoh中和碳酸钠，冻干冷冻的反应混合物。固体残渣溶解在热乙腈水溶液中，并应用于rp
‑
sio2(c18,50g)柱。用乙腈
‑
水混合物(1/3
‑
1/2， 1％acoh)洗脱后，首先出现绿黄色的杂质“带”，然后出现标题化合
物(17)的橙色域。通过冻干橙色溶液得到作为的橙红色粉末(微溶于甲醇和水)的48mg(80％)的标题化合物。hplc:t
r
＝6.0min(mecn/h2o在20min内30:70
→
100:0 0.1％tfa，在254nm检测；kinetex柱)。1h nmr(400mhz,cd3od dmso
‑
d6,ref.3.30ppm对于chd2od):δ＝1.92(m,6h,ch2ch2ch2),3.28(s,3h,menh),3.57(q,6h,3j
h,h
＝6.1hz,och2ch2),3.68(m,6h,so2ch2ch2),8.12(s,1h,2
‑
h),8.89(d,3j
h,h
＝9.6hz,1h),8.93(d,3j
h,h
＝9.6hz,1h),9.10(d,3j
h,h
＝9.6hz,1h),9.22(s,1h),9.32(d,3j
h,h
＝9.7hz,1h)ppm。hr
‑
ms(esi):c
26
h
31
no9s3(597.1116)；[m
‑
h]
‑
真实值(found)596,1078,计算值596.1088。uv
‑
vis(meoh):ε＝23400m
‑1cm
‑1,λ
max
.(吸收)＝502nm,λ
max.
(荧光)＝550nm,qy＝0.88。uv
‑
vis(h2o):ε＝19500m
‑1cm
‑1,λ
max.
(吸收)＝509nm,λ
max.
(荧光)＝563nm,qy＝0.88。
[0307]
一些额外选择的荧光染料，具有大量负净电荷和有利的光谱性质(参见方案12和表2)。
[0308][0309]
具有结构20的多个可电离基团的发红光的罗丹明染料是通过相应的羟基取代的罗丹明前体的磷酸化获得的，并类似于先前由k.kolmakov,c.a.wurm,r.hennig,e.rapp,s.jakobs,v.n.belov and s.w.hell in chem.eur.j.2012,18,12986
‑
12998描述的化合物19(另一种磷酸化罗丹明染料，参见方案6和11)进行分离(有关性质和磷酸化的详细信息，请参见其中的化合物7
‑
h)。根据k.kolmakov,c.a.wurm,d.n.h.meineke,f.v.p.boyarskiy,v.n.belov and s.w.hell(chem.eur.journal,2013,20,146
‑
157；见本文中化合物14
‑
et)合成了化合物20的羟基
‑
取代前体。磷酸化之后，按常规程序皂化乙酯基，如前所述。
[0310]
化合物20的纯度和性质由以下分析数据确认:1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6):δ＝1.23(s,6h,ch3),1.28(s,6h,ch3),2.62(s,6h,nch3),4.21(m,4h,2ch2),5.70(s,2h),6.76(s,2h),7.16
‑
7.30(br.m,4h),8.55(m,1h),8.36(m,1h)ppm。
13
c nmr(101mhz,dmso
‑
d6):δ＝29.1(ch3),34.2(ch3),95.8(ch2),118.2(ch),121.7(c)122.6(c),125.5(ch),127.3(ch),127.4(ch),128.0(ch),129.8(ch),133.9(c),136,8(c),155.0(co),157.0(co)ppm。
[0311]1h nmr(400mhz,cd3od,20为et3n
‑
盐):δ＝1.12(t,j＝7hz,9h,ch3ch2),1,25(t,j＝7hz,27h,ch3ch2),1.52(s,6h,ch3),1.53(s,6h,ch3),3.11,3.31(m,24h,ch3ch2),3.18(s,6h,nch3),3.61(m,2h,ch2),4.45(m,2h,ch2),6.03(s,2h),6.8(s,2h),6.9(s,2h),7.28(d,j＝8hz,1h),8.16(d,j＝8hz,1h),8.66(m,1h)ppm。
31
p nmr(161.9mhz):δ＝
‑
0,2(dmso
‑
d6)和0,63(cd3od)ppm(s,op(o)(oh)2))。
[0312]
hplc:t
r
＝3.9min(kinetex evo c
‑
18柱,用0,02m aq.et3n(a)和3％mecn(b),等度
aq.teab(a)和25％mecn(b),等度流速0.5ml/min,在254nm检测)。tlc:r
f
＝0,6(硅胶板,mecn/h2o 7:1 0,2％et3n,在365nm紫外光照射下，可见强烈的蓝色荧光)。hr
‑
ms(esi):对于c
27
h
27
f3no
10
s6‑
([m
‑
h]
‑
)计算值773.9911,真实值(found)773.9845。uv
‑
vis(pbs缓冲液,ph＝7.4)λ
max.
(吸收)＝428nm。该合成基于c.mispeleare
‑
canivet and co
‑
workers,tetrahedron 2005,61,5253
‑
5259.所述的钯
‑
催化的硫醇和芳基溴化物的交叉偶联的一般配方。
[0321]
2,2,2
‑
三氟
‑
n
‑
[3,6,8
‑
三[(3
‑
磺丙基)磺酰基]芘
‑1‑
基]
‑
乙酰胺(22a)
[0322][0323]
将硫醚21a(作为三乙基铵盐)氧化成砜，如下所示：将50mg(0.046mmol，为m＝1077的et3n盐)底物溶解在hoac(4ml)和水(0.4ml)的混合物中。冷却至 5℃时，加入1ml 50wt.％h2o2和0.5ml 1wt.％na2wo4x2h2o(催化剂)水溶液。在此温度下将反应混合物保持30分钟，在室温下过夜，用水(20ml)稀释并冷冻干燥。使用kinetex gemini nx c
‑
18固相(5μm)，用0.5vol.％的hoac(a)和mecn(b)水溶液在梯度(0
‑
50％b)条件下，通过制备hplc纯化产物。将纯组分汇集在一起，在t≤40℃浓缩并冷冻干燥，以提供28mg(52％)红色结晶固体，为三乙基铵盐(m.w.＝1173)，在水中有强烈的橙黄色荧光。
[0324]
化合物22a的分析数据:1h nmr(41h nmr(400mhz,cd3od):δ＝1.27(m,27h,ch3ch2)2.24(m,6h,ch2ch2ch2),2.97(m,6h,so2ch2ch2),3,19(m,18h,ch2ch3),3.84(m,6h,ch2ch2so3),8.73(d,j＝9hz,1h),9.03(s,1h),9.39
‑
9.41(m,2h),9.02(s,1h),9.52(d,j＝9hz,1h)ppm。
13
c nmr(101mhz,cd3od):δ＝8.9(ch3),20.1(ch2),47.9(ch2),50.2(ch2),55.7(ch2),56.2(ch2),56.6(ch2),126.4(c),126.6(ch),127.0(c),128,0(ch),129,6(ch),130,0(c),131.7(c),133.5(c),134.1(c),134.4(c),134.9(c),136.4(c),158.8(c＝o),ppm。
19
f nmr(376mhz,cd3od):δ＝
‑
76.50(s,cf3)ppm。
[0325]
hplc:t
r
＝5.2min(kinetex column evo c
‑
18 100,用0,05m aq.teab(a)和25％mecn(b),等度流速0.5ml/min,在254nm检测)。tlc:r
f
＝0,5(硅胶板,mecn/h2o 7:1 0,2％et3n,在365nm紫外光照射下，可见强烈的橙色荧光)。hr
‑
ms(esi):对于c
27
h
27
f3no
16
s6‑
([m
‑
h]
‑
)计算值869.9606,真实值(found)869.9536。uv
‑
vis(pbs缓冲液,ph＝7.4)λ
max.
abs.＝476nm。
[0326]
3,6,8
‑
三[(3
‑
磺丙基)磺酰基]
‑
芘
‑1‑
胺(23a)
[0327][0328]
化合物22a中的保护性cocf3基团在室温下、碱性条件下用常规方法裂解(见t.w greene,p.g.m.wuts“protective groups in organic synthesis”third edition 1999,p.557)。通过tlc监测反应过程，反应混合物用hoac中和至ph 7
‑
8，并在t≤40℃浓缩。使用gemini nx c
‑
18固相(5μm)，用0.3vol.％的et3n(a)水溶液和10％的mecn(b)在等度模式下对残留物进行制备hplc。浓缩纯组分并冷冻干燥，以提供22mg(79％)化合物23a，为三乙基铵盐。性状：红色结晶固体，易溶于水，溶液具有强烈的黄绿色荧光。
[0329]
分析数据:1h nmr(400mhz,cd3od):δ＝1.27(t,27h,j＝7hz,ch3ch2,3et3n)2.13
‑
2.29(m,6h,ch2ch2ch2),2.88
‑
3.17(m,6h,ar
‑
so2ch2ch2),3,16(q,j＝7hz,18h,ch2ch3,3et3n),3.69
‑
3.84(m,6h,ch2ch2so3),8.13(s,1h),8.66(d,j＝9hz,1h),8.83(d,j＝9hz,1h),8.93(d,j＝9hz,1h),9.17(d,j＝9hz,1h),9.20(s,1h)ppm。
13
c nmr(101mhz,cd3od):δ＝9.2(ch3),20.0(ch2),20.1(ch2),20.2(ch2),47.9(ch2),50.4(ch2),55.4(ch2),55.7(ch2),56.5(ch2),60.1(ch2),117.7(c),118.3(ch),120,3(ch),123,0(ch),127,7(c),128.1(c),128.6(ch),129.4(c),129.9(c),130.2(ch),131.7(ch),134.9(c),136.0(c),138.1(c),149.6(c),ppm。hplc:t
r
＝4.7min(kinetex柱evo c
‑
18 100,用0,05m aq.teab(a)和25％mecn(b),等度,0.5ml/min,在254nm检测)。tlc:r
f
＝0,4(硅胶板,mecn/h2o 7:1 0,2％et3n,在365nm紫外光照射下，可见其强烈的绿色荧光)。hr
‑
ms(esi)负极模式:对于c
25
h
28
no
15
s6‑
([m
‑
h]
‑
)计算值774.9873,真实值(found)774.9804；正极模式:对于c
25
h
33
n2o
15
s
6
([m nh4]

)计算值793,0205,真实值(found)793.0146。uv
‑
vis(teab缓冲液,ph＝8.5):ε＝21 000m
‑1cm
‑1,λ
max.
abs.＝486nm,λ
max.
fl.＝542nm.,φ
fl
＝86％(在teab缓冲液中，相对于荧光素作为参考染料，在496nm激发，在0.1mnaoh中φ
fl
＝0.9)。
[0330]
使用市售2
‑
巯基
‑
乙烷磺酸钠作为含硫醇且烷基链较短的试剂，染料23b(上述染料23a的同系物，也属于通式c，其中每个x＝so3h且n＝1)以完全相同的方式从溴化物12中获得，产率高。其光谱和光物理性质(ε、λ
max
和φ
fl
，另见表2)证明与染料23a完全相同。
[0331]
实施例3
[0332]
聚糖的还原胺化
[0333]
为了使用本发明的化合物对聚糖进行还原胺化，可以根据8
‑
氨基芘
‑
1,3,6
‑
三磺酸三钠盐(apts)和基于硼烷的还原剂对n
‑
聚糖进行荧光标记的现有技术方案(bigge jc,patel tp,bruce ja,goulding pn,charles sm,parekh rb,analytical biochemistry 1995,230,229
‑
238；ruhaak lr,hennig r,huhn c,borowiak m,dolhain rjem,deelder am,rapp e,wuhrer m,journal of proteome research 2010,9,6655
‑
6664)或其修改版本。