一株甘蔗内生枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法

1.本发明属于生物防治技术领域。更具体地，涉及一株甘蔗内生枯草芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.植物病害是指植物在生物或非生物因子的影响下，发生一系列形态、生理和生化上的病理变化，阻碍了正常生长、发育的进程，从而影响人类经济效益的现象。植物病害是寄主植物和病原物的拮抗性共生，其发生和流行是寄主植物和病原物相互作用的结果。造成植物发生病害病因有很多种，由植物病原真菌引起的病害约占植物病害的70％～80％，例如：甘蔗鞭黑粉菌可引起甘蔗鞭黑穗病，稻瘟病菌引起的水稻稻瘟病是稻作生产中的主要病害，极大影响水稻产量。
3.化学药剂防治作物病害是人们常用的有效防治措施。它的特点是见效快、防治效果显著、使用方便、不受地区和季节限制等，适于大面积防治，是有害生物综合治理中不可缺少的一环。但是随着化学药剂的长期使用，不仅导致耐药菌株的大量出现，而且衍生的环境问题也越来越突出。比如农药残留，污染环境，引起人畜中毒；长期使用某些农药引起有害生物产生抗药性；杀伤害虫天敌引起次要害虫上升和某些害虫的再猖獗等。由此说明，化学药剂的频繁使用不仅无法有效防治植物病害的发生，而且还会加重环境的污染。因此，寻找能有效控制作物病害的替代方法十分迫切。
4.目前，生物防治已经成为植物病害综合防治中的一种非常重要的手段。植物病害生物防治是指利用有益微生物或有益微生物的代谢产物对植物病害进行有效防治的措施，主要是通过微生物间的抗生、竞争、重寄生、溶菌作用，以及微生物的代谢产物来诱导植物产生抗病性从而阻止病原物的侵入。对植物病害进行生物防治具有不污染环境、对人和其他生物安全、防治作用持久、产品无残留、对病菌杀伤特异性强、易于同其他植物保护措施协调配合并能节约能源等优点。
5.目前国内外的研究人员已经开展了很多关于生防菌的研究，例如贝莱斯芽孢杆菌能够对棉花黄萎病菌具有拮抗作用(王伟，王伟,李术娜,李红亚,等.大丽轮枝菌拮抗细菌菌株12
‑
51的筛选鉴定与抗菌物性质分析[j].中国农学通报,2009,25(19):14
–
19)；枯草芽孢杆菌af0907对小麦赤霉病在内的多种植物病害有很好的防治效果(胡晓丹,王建伟,李孝敬,等.赤霉病菌拮抗菌bacillus subtilis af0907抗菌物质研究[j].中国生物防治学报，2015，31(3)：378
‑
385.)；水稻内生菌贝莱斯芽孢杆菌菌株e69和e66对多种植物病原真菌均有拮抗作用，其无菌发酵液对于稻瘟病有很好的抑菌效果(沙月霞,隋书婷,曾庆超,等.贝莱斯芽孢杆菌e69预防稻瘟病等多种真菌病害的潜力[j].中国农业科学，2019,52(11):1908
‑
1917.)；萎缩芽孢杆菌对小麦赤霉病有很好的功效(辛海峰,孟艳艳,张旭，等.一株萎缩芽孢杆菌在小麦中的定植及对赤霉病的防治[j].生态学杂志,2013,32(6):1490
‑
1496.)；红树内生海洋细菌ciii
‑
1对辣椒青枯病有很好的防治效果(何红,欧雄常,王立才,等.红树内生海洋细菌c
ⅲ‑
1菌株对辣椒青枯病的防病效果[j].植物保护学报,2008年06
期)。一株甘蔗内生菌沃氏食酸菌能有效的防止辣椒青枯病(曾泉，史国英，农泽梅，等.绿色植保与乡村振兴—中国植物保护学会2018年学术年会论文集[c].2018年)。
[0006]
由此可见，利用生防菌来防治作物病害的生物防治技术越来越受到人们的关注与重视。但是由于生防菌易于退化、生防菌抑菌种类有针对性、抑菌谱窄等问题，适用范围局限，且不适于大面积施用，所以对于生防菌的持续深入研究和开发挖掘有很大的社会和经济价值。
[0007]
另外，作物间作的方式是一种常见的种植方式，因此，多种病害的共同防控也是一大难题，尤其是对于普遍抑菌种类有针对性、抑菌谱窄的生防菌来说。比如将黑皮果蔗和水稻采取轮作的方式种植，通常是一期新植，接着二期或三期宿根，再一期或二期水稻，然后又回到新植。而在末期水稻未收获前，把新植甘蔗种植在水稻株间糊状泥土中，称为糊仔甘蔗。和第一期水稻间作的，称为第一期糊仔甘蔗，也叫做春植糊仔甘蔗。和第二期水稻间作的，称为第二期糊仔甘蔗，也叫做秋植糊仔甘蔗。它的优点是既不影响水稻生长，又可使后作甘蔗提早种植，还可节省整地筑畦等作业费用。但是此种种植方式的问题是甘蔗鞭黑穗病和稻瘟病两种病害同时出现时，防控难度显著增大。为此，有必要寻找到一种能一次同时治疗稻瘟病和甘蔗黑穗病这两种在水稻和甘蔗中常见的植物病害的生防菌，提高病害防治效果，并给使用者在防治植物病害时带来更大的便利性。
[0008]
申请人前期的研究cn110791448b提供了一种解淀粉芽孢杆菌cgb15菌株，对甘蔗鞭黑粉菌、稻瘟菌等都具有强烈的防治效果。但是因为生防菌会存在退化问题，因此不断地探索新的菌系、补充生防菌库具有重要的意义。
[0009]
另外现有技术中也有对针对这两种病菌的生防菌的相关报道，比如专利申请cn107502570a公布了一种枯草芽孢杆菌bj
‑
1可有效抑制稻瘟病菌，专利申请cn102899280b公布一种枯草芽孢杆菌has对甘蔗黑穗病的发生有很好的抑制作用。但是这两株菌不能同时防控甘蔗鞭黑穗病和稻瘟病两种病害。


技术实现要素：

[0010]
针对现有技术中存在的缺陷或不足，本发明要解决的技术问题是提高一种新的可以同时防控甘蔗鞭黑穗病和稻瘟病两种病害的生防菌。本发明从甘蔗叶片中分离出一株对甘蔗鞭黑穗病菌和稻瘟病菌均具有强烈的抑制作用的菌株cgb12，经鉴定为枯草芽孢杆菌，其在农作物的真菌病害防治中具有潜在的应用价值。
[0011]
本发明的首要目的是提供一株枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cgb12菌株。
[0012]
本发明的另一个目的是提供上述枯草芽孢杆菌cgb12菌株在抑制甘蔗鞭黑粉菌和稻瘟病菌中的应用。
[0013]
本发明的另一个目的是提供枯草芽孢杆菌cgb12菌株在制备抑制甘蔗鞭黑粉菌和稻瘟病菌药物中的应用。
[0014]
本发明的另一个目的是提供枯草芽孢杆菌cgb12菌株在防治甘蔗鞭黑粉菌和稻瘟病菌引发的植物病害中的应用。
[0015]
本发明的另一个目的是提供枯草芽孢杆菌cgb12菌株在制备防治甘蔗鞭黑粉菌和稻瘟病菌引发的植物病害的药物中的潜在应用。
[0016]
本发明的再一目的是提供一种微生物制剂。
[0017]
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
[0018]
本发明从甘蔗叶片中分离出一株枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cgb12菌株，所述枯草芽孢杆菌cgb12菌株于2021年3月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：61561，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0019]
将上述枯草芽孢杆菌cgb12菌株在lb培养基上28℃培养22～26h后，cgb12菌株形成的菌落表面褶皱及边缘光滑，菌落较干燥且不透明。
[0020]
将上述枯草芽孢杆菌cgb12菌株置于甘蔗鞭黑粉菌菌液及稻瘟病菌菌块周围培养，发现其对菌丝生长有强烈的抑菌作用，造成了甘蔗鞭黑粉菌孢子和稻瘟病菌孢子的畸形萌发。因此可以用于同时防控甘蔗鞭黑穗病和稻瘟病两种病害。
[0021]
因此，上述枯草芽孢杆菌cgb12菌株在抑制甘蔗鞭黑粉菌和稻瘟病菌中的应用，以及在制备抑制甘蔗鞭黑粉菌和稻瘟病菌的药物中的应用，都在本发明的保护范围之内。
[0022]
而且，上述枯草芽孢杆菌cgb12菌株在防治甘蔗黑粉菌和稻瘟病菌引发的植物病害中的应用，以及在制备防治甘蔗鞭黑粉菌和稻瘟病菌引发的植物病害的药物中的应用，也在本发明的保护范围之内。
[0023]
基于上述应用，一种含有上述枯草芽孢杆菌cgb12菌株和/或其发酵液的微生物制剂也在本发明的保护范围之内。
[0024]
进一步地，上述发酵液的制备方法是：
[0025]
s1.将所述枯草芽孢杆菌cgb12菌株活化培养得到菌悬液；
[0026]
s2.将步骤s1所得菌悬液接种至lb培养基中，发酵培养得培养液；
[0027]
s3.将步骤s2所得培养液离心取上清，即得发酵液。
[0028]
优选地，步骤s1所述活化培养的条件为：lb培养基，28℃～30℃，摇床速率150～350rpm，时间22～25小时。
[0029]
更优选地，步骤s1所述活化培养的条件为：lb培养基，28℃，摇床速率为200rpm下培养24h。
[0030]
优选地，步骤s2所述发酵培养的条件为26℃～30℃，摇床速率为150～350rpm下发酵培养10～20h。
[0031]
更优选地，步骤s2所述发酵培养的条件为28℃，摇床速率为200rpm下发酵培养12h。
[0032]
将上述所得的微生物制剂直接喷施到作物表面可用于病害的防治。
[0033]
本发明具有以下有益效果：
[0034]
1、本发明得到的植物内生枯草芽孢杆菌cgb12菌株来自健康的甘蔗植株种，排除了菌株对植物的致病性的风险，由于与植物长期共生，避免了其代谢产物施用于植株表面时对植物生长产生的负面影响，施用之后并不会造成残留的危害。
[0035]
2、本发明的枯草芽孢杆菌cgb12菌株代谢产物粗提物对甘蔗鞭黑粉菌和稻瘟病菌均具有强烈的抑制作用以及优异的防治作用，可以应用两种病害的同时防控。
[0036]
3、本发明的枯草芽孢杆菌cgb12菌株，培养条件要求低，通过离心收集上清即可，具有很好的开发应用价值。
附图说明
[0037]
图1为枯草芽孢杆菌cgb12菌株在培养基上得单菌落图；
[0038]
图2为枯草芽孢杆菌cgb12菌株的系统发育树；
[0039]
图3为枯草芽孢杆菌cgb12菌株对甘蔗鞭黑粉菌和稻瘟病菌的抑制效果图；
[0040]
图4为枯草芽孢杆菌cgb12菌株抑制甘蔗鞭黑粉菌冬孢子萌发图；
[0041]
图5为枯草芽孢杆菌cgb12菌株对甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长抑制效果图。
具体实施方式
[0042]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0043]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0044]
实施例1 甘蔗叶片内生枯草芽孢杆菌cgb12菌株的分离、纯化、鉴定和保藏
[0045]
1、lb培养基的配制
[0046]
称取胰蛋白胨(tryptone，oxoid ltd lp0042，england)10g，酵母提取物(yeast extract，oxoid ltd lp0021，england)5g，氯化钠10g，加水1000ml搅拌均匀，再加15g琼脂，充分加热溶解后分装，121℃灭菌20min后贮存备用。
[0047]
2、甘蔗叶片内生枯草芽孢杆菌的分离、纯化
[0048]
(1)叶片采集：用于分离的甘蔗叶片采自华南农业大学农学院沈万宽研究员的甘蔗种田，并且根据叶片的空间位置(上、中、下)粗略的分为新叶、成熟叶、老叶三组。
[0049]
(2)叶片消毒：用灭菌的超纯水洗3次，用3％过氧化氢浸泡1min，100ml乙醇浸泡1min，6.15％含有吐温
‑
20的次氯酸浸泡5min，3％过氧化氢浸泡1min，灭菌的超纯水洗5～6次，收集最后一次洗涤叶片的水。
[0050]
(3)消毒检测：最后一次洗涤的水，涂在无抗生素的lb平板上，吹干封口，37℃保存三天，观察是否有菌落产生，如果有说明消毒不完全，需要重新采集叶片进行消毒。
[0051]
(4)叶片研磨：取消毒成功的叶片2～3块的叶片，研磨完全，加1ml灭菌的超纯水，转移到2ml无菌的离心管，低速离心，取上清稀释，稀释倍数分别为：10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5。叶片研磨液加等体积的60％甘油，
‑
80℃保存。
[0052]
(5)菌落纯化：稀释后的叶片提取液，每个梯度涂3个lb平板，吹干，封口，28℃培养3～5天。根据菌落形态挑选不同的形态的菌，用lb液体培养基28℃过夜摇菌，后在lb固体培养基上划线。挑取单菌落，用lb液体培养基28℃过夜摇菌，取1ml菌液添加等体积的60％甘油，
‑
80℃冻存，待用。
[0053]
(6)菌株挑选：通过平板对峙筛选对甘蔗鞭黑粉菌和稻瘟病菌具有抑制作用的菌株，并对菌丝生长抑制活性最高的菌株(命名为菌株cgb12)进行鉴定。
[0054]
(7)菌株cgb12的鉴定
[0055]
如图1所示，菌株cgb12在lb培养基上28℃培养，培养24h，菌株形成的菌落表面褶皱及边缘光滑，菌落较干燥且不透明。
[0056]
对菌株cgb12进行16s_rdna测序。通过美国国立生物技术信息中心(ncbi，national center for biotechnology information)blast序列比对，构建系统发育树(见
图2)，可以确定cgb12属于枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cgb12。
[0057]
(8)菌株保藏
[0058]
枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cgb12菌株于2021年3月15日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmcc no：61561，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0059]
实施例2 对峙培养法测定枯草芽孢杆菌cgb12菌株的抑制甘蔗鞭黑粉菌和稻瘟病菌的活性
[0060]
1、培养基的准备
[0061]
(1)lb液体培养基的配制：除不加琼脂，其他与实施例1中lb固体培养基的配方相同，将称得的配方药剂充分溶解后分装于锥形瓶(每瓶100ml培养液)，加塞、包扎，121℃灭菌20min，冷却后贮存备用。
[0062]
(2)pda培养基的制备：pda肉汤(购自鼎国)，用法见其说明书。
[0063]
(3)cm培养基的配制：硝酸钙(10g/100ml)10ml，盐溶液(2g磷酸二氢钾、2.5g七水合硫酸镁、1.5g氯化钠溶于100ml水)10ml，酵母浸粉1.0g，酪蛋白水解物0.5g，酸性酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖10g，水980ml。
[0064]
2、枯草芽孢杆菌cgb12单菌落的制备
[0065]
将芽孢杆菌cgb12划线接种至lb培养基平板上培养24h后，即获得单菌落。
[0066]
3、枯草芽孢杆菌cgb12发酵液的制备
[0067]
取步骤2中制备得到的枯草芽孢杆菌cgb12单菌落接入步骤1中制备的lb液体培养基中，置于28℃，摇床速率为200rpm下培养24h，即可得到枯草芽孢杆菌cgb12菌悬液；将获得的菌悬液添加到装有lb培养基的500ml锥形瓶中，置于28℃，摇床速率为200rpm下发酵培养12h，离心取上清液，即得所需发酵液。
[0068]
4、抑制真菌活性的测定
[0069]
(1)枯草芽孢杆菌cgb12对甘蔗鞭黑粉菌和稻瘟病菌的抑制作用测定：
[0070]
将步骤2制得的枯草芽孢杆菌cgb12接种到pda平板上，与平板中心甘蔗鞭黑粉菌菌液距离约2cm左右，实验中以不接种芽孢杆菌为对照，3个重复，置于28℃下恒温培养；将步骤2制得的枯草芽孢杆菌cgb12接种到稻瘟病菌(灰梨孢菌)菌饼周围，与菌饼距离约2cm左右，实验中以不接种芽孢杆菌为对照，3个重复，置于28℃下恒温培养，当约三天后观察实验结果，结果如图3所示。
[0071]
(2)对稻瘟病菌产孢量的影响：取接稻瘟病菌菌饼于倒好的cm培养基平板中，28℃培养约一周左右，取无菌水于平板中清洗孢子制成孢子悬浮液(镜检调节孢子浓度到约每毫升107个孢子)。按照步骤3中摇菌方法，待芽孢杆菌到od600≈0.8时，取发酵液于平板中洗孢子制成孢子悬液。孢子悬浮液均取20μl点在疏水玻片上，28℃培养6h后镜检观察孢子产量情况，如表1和表2所示。
[0072]
表1 cgb12对稻瘟菌菌丝的影响
[0073][0074]
表2 cgb12对稻瘟菌孢子的影响
[0075][0076][0077]
(3)对甘蔗鞭黑粉菌冬孢子萌发的影响：倒好的pda平板铺上一层玻璃纸，按照步骤3中摇菌方法，待芽孢杆菌&大肠杆菌(大肠杆菌为负对照)到od
600
≈0.8时，取细菌菌液小心涂于玻璃纸上(注意不要涂到未被玻璃纸覆盖的区域)，吹干封板，28℃培养约一天，小心揭掉玻璃纸，涂甘蔗鞭黑粉菌冬孢子于平板上，于28℃培养约一天，观察孢子萌发情况，并拍照(体视镜)，结果见图4所示。
[0078]
5、抑制甘蔗鞭黑粉菌菌丝的生长
[0079]
利用红绿荧光定位测定枯草芽孢杆菌cgb12对甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长的影响：摇培分别用红绿荧光标记的甘蔗鞭黑粉菌的单倍体菌株，两天后测od值(od值大约为1.0)后将混合菌液接种于pda平板中间，将步骤2制得的枯草芽孢杆菌cgb12接种到平板上，与平板中心甘蔗鞭黑粉菌菌液距离约2cm左右，实验中以不接种芽孢杆菌为对照，置于28℃下恒温培养，当约三天后观察实验结果(倒置荧光显微镜下观察荧光)，结果如图5所示。
[0080]
6、结果分析
[0081]
由图3、图4、图5可以看出甘蔗叶片内生枯草芽孢杆菌cgb12对甘蔗鞭黑粉菌和稻瘟病菌的生长都具有强烈的抑制作用，且造成了甘蔗鞭黑粉菌冬孢子萌发畸形，其中枯草芽孢杆菌cgb12菌株的发酵液对甘蔗鞭黑粉菌冬孢子萌发具有显著的抑制作用。
[0082]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。