1,2,4-噁二唑类Nrf2激活剂-他克林拼合产物及其制备方法与用途与流程

1，2，4
‑
噁二唑类nrf2激活剂
‑
他克林拼合产物及其制备方法与用途
技术领域
1.本发明涉及化工医药，特别涉及1，2，4
‑
噁二唑类nrf2激活剂
‑
他克林拼合产物及其制备方法与用途。


背景技术：

2.阿尔茨海默症(alzheimer’s disease，ad)是导致痴呆症的最常见原因，估计占全球病例的60％
‑
70％。在≥65岁的人群中，大约有10％的人被认为患有ad；在＞85岁的人群中，这一数字上升到32％，其中ad的年发病率估计为6.48％。ad患者的记忆和认知功能逐渐丧失，涉及语言、视觉空间和执行领域。脑内阿尔茨海默症的病理特征是淀粉样蛋白(aβ)斑块和异常tau蛋白缠结。根据淀粉样蛋白和tau蛋白病变的暂时出现以及aβ过度生产导致ad的证据，提出了淀粉样蛋白级联假说，该假说假设aβ积聚是导致最终导致神经元损伤的一通式效应的主要事件。然而，越来越多的证据表明，单独的淀粉样级联不能解释ad的大部分发病机制，这表明其他病理过程也参与其中。特别是，在发现ad患者炎症标志物水平升高以及与先天免疫功能相关的ad风险基因后，炎症已成为至关重要的因素。
3.神经炎症一般是指中枢神经系统内的一种炎症反应，可由各种病理损伤引起，包括感染、创伤、缺血和毒素。这一过程以产生促炎细胞因子(包括il
‑
1β、il
‑
6、il
‑
18和tnf)、趋化因子(如ccl1、ccl5和cxcl1)、小分子信使(包括前列腺素和一氧化氮)以及天然免疫细胞产生活性氧等多种因子为标志。参与这一过程的先天免疫细胞主要是小胶质细胞和星形胶质细胞，但毛细血管内皮细胞和浸润的血细胞也会导致神经炎症，特别是当血脑屏障(blood
‑
brain barrier，bbb)遭受生化或机械损伤时。促炎分子的释放可能导致突触功能障碍、神经元死亡和神经发生抑制。il
‑
1β通过增加前列腺素e2的产生来诱导突触丢失，从而导致突触前谷氨酸的释放和突触后n
‑
甲基
‑
d
‑
天冬氨酸受体的激活，当nf
‑
κb途径被抑制时，肿瘤坏死因子通过激活肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor 1，tnfr1)和募集caspase8而导致神经元死亡。此外，补体系统可以被激活，促进小胶质细胞的吞噬功能，这可能导致不适当的突触修剪。抗炎细胞因子也在神经炎症过程中产生，可能是防止过度神经炎症的复杂机制的一部分。然而，在神经退行性疾病的背景下，神经炎症往往是一个无法自行解决的慢性过程，被认为是疾病的重要驱动因素。
4.神经炎症可能是ad病理启动的重要组成部分。流行病学研究表明，痴呆症与先前关于感染、吸烟和糖尿病的报告呈正相关。非甾体抗炎药(nonsteroidal antiinflammatory drugs，nsaids)对ad的潜在保护作用也已被提出，尽管这些药物的疗效仍有争议。上述危险因素引起的全身炎症可通过脑室周围器官、迷走神经、主动转运或破坏bbb诱导中枢神经系统炎症。对经历了全身炎症的年轻患者进行的尸检研究发现，小胶质细胞的形态和免疫学变化与在老年人或痴呆症患者中观察到的相似。被怀疑会增加ad风险的创伤性脑损伤，也被发现会引发持续性的神经炎症。在ad的动物模型中观察到斑块前阶段的小胶质细胞激活，一项人类神经影像学研究报告称，在缺乏淀粉样蛋白示踪剂的情况下，
轻度认知功能障碍(mild cognitive impairment，mci)患者的小胶质细胞激活增加。这两项发现都表明神经炎是阿尔茨海默症的早期事件。进一步的研究发现，单独向大脑注射aβ不足以在灵长类动物模型中诱导淀粉样蛋白病理，但在慢性全身炎症的动物模型中联合注射脂多糖和aβ或aβ可能会导致淀粉样斑块的形成。更令人信服的证据来自一项人类尸检研究，该研究发现，在不同年龄的淀粉样蛋白负荷升高的无症状个体中，小胶质细胞没有相关的形态学变化，这有力地表明，除了aβ沉积之外，神经炎症是ad发病的先决条件。全基因组关联研究的证据也支持了神经炎症在ad中的启动作用，该研究发现，小胶质细胞或先天免疫基因的突变，如cd33、trem2和补体受体1型，与人群中ad发病率的增加有关。越来越多的证据表明，小胶质细胞启动是在ad的背景下发生的，指的是慢性低水平刺激(包括全身炎症和衰老)导致幼稚的小胶质细胞采取一种改变状态的过程，当这些小胶质细胞暴露在重复的病理刺激时，这种改变会导致夸大或不适当的炎症反应。
5.到目前为止，只有五种药物被美国fda批准上市用于治疗ad。包括利凡斯的明(rivastigmine)，加兰他敏(galantamine)，多奈哌齐(donepezil)，美金刚(memantine)，及其由于会造成肝毒性等原因后来被撤市的他克林(tacrine)。而在中国，除了上面提到四个仍在美国市场销售药物外，还有石杉碱甲也被批准用于治疗ad。以上几个药物中除了美金刚以外均为乙酰胆碱酯酶抑制剂。这些药物都只能在患者发病早期阶段暂时延缓病程，而且在患者中疗效的差异很大。由于ad是一种病因复杂的系统性疾病，只针对其众多疾病过程中的个别环节很难达到治疗的目的。因此，同时针对其多个靶点设计多靶点药物分子(multiple
‑
target directed ligands，mtdls)已经成为治疗ad药物研发的新热点。相比于传统的“单药单靶(one
‑
drug，one
‑
target)”方案，这种策略更适应ad复杂的病理环境。
6.nrf2作为一个具有广泛活性的转录因子，可以同时对ad的多个环节产生积极的作用。通过激活其下游基因，可以缓解ad患者脑组织细胞内异常严重的氧化应激状态，也同时起到对抗神经炎症的作用。并且，激活nrf2可以促进细胞将其中过多的金属离子排到细胞外。另外，nrf2对于能量代谢也有着重要的影响，可以调整线粒体的功能。因此，激活nrf2可以系统性的对ad患者的脑细胞的损伤起到缓解与保护作用。另外一个常见的多靶点抗ad药物的分子靶标是乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，ache)。抑制ache可以激活患者脑内低迷的胆碱能系统，提高患者的认识能力。目前已有的治疗ad的药物主要也是针对该靶点的抑制剂。此外，ache也被报道可以通过其催化口袋中的外周阴离子区域(peripheral anionic site，pas)加速aβ的聚集过程。


技术实现要素：

7.发明目的：本发明目的是提供具有良好的体外、体内活性和极高的选择性等效果的1，2，4
‑
噁二唑类nrf2激活剂
‑
他克林拼合产物。
8.本发明另一目的是提供上述化合物的制备方法和用途。
9.技术方案：本发明提供一种1，2，4
‑
噁二唑类nrf2激活剂
‑
他克林拼合产物或其药学上可接受的盐，结构如通式i、ii、iii所示：
[0010][0011]
其中，
[0012]
r代表氢、任意取代的卤素、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基。
[0013]
进一步地，该化合物为如下任一种：
[0014][0015]
[0016]
进一步地，所述药学上可接受的盐选自盐酸盐、马来酸盐或枸橼酸盐。
[0017]
制备方法包括：
[0018]
通式i所示的具有抗阿尔茨海默症的化合物的制备方法，包括：以为起始原料，经苄基保护得到使用2
‑
甲基
‑
5氰基吡啶作为原料，与盐酸羟胺、三乙胺在乙醇中回流，得到中间体将与n，n
’‑
羰基二咪唑溶于n，n
’‑
二甲基甲酰胺于室温搅拌，将加入反应瓶，得到具有1，2，4
‑
噁二唑环系中间体后去苄基保护得到以邻氨基苯甲酸甲酯为原料，经水解，环合，胺化，卤代反应得到与经威廉姆逊反应得到通式i结构的目标化合物。反应式如下：
[0019][0020]
(a)i：bnbr，k2co3，ch3cn，reflux，8h；ii：2n naoh(aq)，meoh，105℃，6h；(b)hydroxylamine hydrochloride，k2co3，etoh，reflux，10h；(c)i：cdi，dmf，110℃，5h；ii：hcl(aq)，etoh，reflux，6h；(d)naoh，h2o，r.t.，12h；(e)6
‑
amino
‑1‑
hexanol，pocl3，reflux，3h；(f)i：6
‑
amino
‑1‑
hexanol，1
‑
pentanol，150℃，24h；ii：ccl4，ph3p，dcm，r.t.，24h；(g)
k2co3，dmf，90℃，36h.
[0021]
通式ii所示的具有抗阿尔茨海默症的化合物的制备方法，包括：以为原料，经酯化后与溴代丙炔反应，经水解得到与环合得到以邻氨基苯甲酸甲酯为原料，经水解，环合，胺化，然后以乙醇胺氨解，用对甲苯磺酰氯进行酰化反应，再与tmsn3反应得到，与经点击反应得到通式ii结构的目标化合物。反应式如下
[0022][0023]
(a)i：h2so4，meoh，reflux，6h；ii：3
‑
bromopropyne，k2co3，me2co，reflux，6h；iii：2nnaoh(aq)，meoh，100℃，6h；(b)hydroxylamine hydrochloride，k2co3，etoh，reflux，10h；(c)cdi，dmf，110℃，5h；(d)naoh，h2o，r.t.，12h；(e)cyclohexanone，pocl3，reflux，3h；(f)i：ethanolamine，1
‑
pentanol，150℃，24h；ii：tscl，tea，dcm，60℃，18h；(g)tmsn3，dmf，110℃，12h；(h)cuso
4 5h2o，ascorbic acid，meoh，h2o，r.t.，24h.
[0024]
通式iii所示的具有抗阿尔茨海默症的化合物的制备方法，包括：以为原料，经酯化后与溴代丙炔反应，经水解得到以6
‑
甲基烟酸甲酯与水合肼反应得到与反应后环合得到以邻氨基苯甲酸甲酯为原料经水解，环合，然后以乙醇胺氨
解，用对甲苯磺酰氯进行酰化反应，再与tmsn3反应得到与经点击反应得到通式iii结构的目标化合物。
[0025][0026]
(a)i：h2so4，meoh，reflux，6h；ii：3
‑
bromopropyne，k2co3，me2co，reflux，6h；iii：2nnaoh(aq)，meoh，100℃，6h；(b)hydrazine hydrate，meoh，reflux，6h；(c)i：cdi，dmf，110℃，5h；ii：pocl3，110℃，6h；(d)naoh，h2o，r.t.，12h；(e)cyclohexanone，pocl3，reflux，3h；(f)i：ethanolamine，1
‑
pentanol，150℃，24h；ii：tscl，tea，dcm，60℃，18h；(g)tmsn3，dmf，110℃，12h；(h)cuso
4 5h2o，ascorbic acid，meoh，h2o，r.t.，24h.
[0027]
所述1，2，4
‑
噁二唑类nrf2激活剂
‑
他克林拼合产物在制备预防或治疗阿尔茨海默氏病药物中的应用。
[0028]
一种药物组合物，包括权利要求1
‑
3任一项所述的以通式i、ii、iii所示的化合物或其药学上可接受的盐为有效成分或主要有效成分和药学上可接受的载体。
[0029]
进一步地，药物组合物制剂为片剂、胶囊、粉剂、糖浆、液剂、悬浮剂或针剂。
[0030]
有益效果：本发明以乙酰胆碱酯酶抑制活性、nrf2激活活性、选择性的筛选以及morris水迷宫实验为载体来评价通式i、ii、iii所示的化合物治疗阿尔茨海默症(尤其是中重度阿尔茨海默症)，发现具有良好的体外、体内活性和极高的选择性，可作为进一步开发通过选择性抑制乙酰胆碱酯酶和激活nrf2来发挥抗阿尔茨海默症作用的前体物质。本发明合成出同时具备nrf2激活活性与ache抑制活性的多靶点化合物，可以同时作用于ad发展过程中多个病理过程，达到缓解病人脑损伤，延缓疾病进程的目的。在多靶点胆碱酯酶抑制剂的设计中，他克林是最常见的胆碱酯酶抑制活性片段。作为活性片段，他克林具有分子量小，活性高等优点。因此，首先使用他克林片段作为胆碱酯酶抑制活性片段，将其与1，2，4
‑
噁二唑类nrf2激活剂片段进行拼合，通过这一策略，得到一类新型的多靶点化合物。
附图说明
[0031]
图1为待测化合物神经细胞毒性测定结果；
[0032]
图2为待测化合物nrf2激活活性测定结果；
[0033]
图3为化合物15的ros实验结果；
[0034]
图4为化合物15对tnf
‑
α生成的elisa实验结果；
[0035]
图5为化合物15对il
‑
1β生成的elisa实验结果；
[0036]
图6为化合物15对inos生成的elisa实验结果；
[0037]
图7为小鼠到达平台的平均距离；
[0038]
图8为小鼠到达平台的平均时间；
[0039]
图9为小鼠到达平台的轨迹。
具体实施方式
[0040]
实施例1
[0041]
(1)3
‑
(3
‑
(6
‑
甲基吡啶基))
‑5‑
(3
‑
羟基苯基)
‑
1，2，4
‑
噁二唑(中间体1)的合成
[0042]
将3
‑
苄氧基苯甲酸与n，n
’‑
羰基
‑
二咪唑溶于n，n
’‑
二甲基甲酰胺，室温搅拌45min。将6
‑
甲基
‑
n
‑
羟基
‑3‑
吡啶甲脒加入反应瓶，后升温至110℃搅拌5h。将反应液冷却至室温，倒入饱和碳酸氢钠水溶液中，有白色固体析出。抽滤，滤饼水洗两次。烘干得白色粉末。将白色粉末溶于乙醇，加入浓盐酸，105℃回流过夜。冷却至室温，有白色固体析出。抽滤，水洗两次，石油醚洗两次。烘干，得白色固体。1h nmr(300mhz，dmso
‑
d6)：δ10.12(s，1h)，9.11(d，j＝1.9hz，1h)，8.31(dd，j＝8.1，2.1hz，1h)，7.62(d，j＝7.7hz，1h)，7.56(s，1h)，7.48(dd，j＝17.5，8.2hz，2h)，7.12(dd，j＝8.2，2.3hz，1h)，2.58(s，3h).
[0043]
注：3
‑
苄氧基苯甲酸为自制，方法为：将3
‑
羟基苯甲酸，溴化苄，碳酸钾溶于乙腈，回流8h。反应结束后冷却至室温，加入水，二氯甲烷萃取，合并有机层，减压蒸发除去溶剂，得到白色固体，加入茄形瓶中，加入2n的氢氧化钠水溶液，甲醇，油浴加热100℃。反应液回流约6h，反应结束后，冷却至室温。用2m的盐酸水溶液调节ph＝3，析出大量白色固体，抽滤，烘干得白色固体物。
[0044]6‑
甲基
‑
n
‑
羟基
‑3‑
吡啶甲脒为自制，方法为：将5
‑
氰基
‑2‑
甲基吡啶溶于乙醇，加入盐酸羟胺和碳酸钾，回流搅拌10h。反应结束后趁热抽滤。滤液冷却后向其中加入乙醚，此时有白色晶体析出。抽滤后，滤饼使用乙醚冲洗两次，烘干得白色晶体。
[0045]
(2)n
‑
(6
‑
氯己基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶(中间体2)的合成
[0046]
将9
‑
氯
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶和6
‑
氨基
‑1‑
己醇溶于正戊醇，150℃搅拌24h。反应完毕后冷却至室温，将反应液倒入石油醚中。有黑色油状物生成，倾去石油醚。黑色油状物通过硅胶色谱柱纯化(展开剂二氯甲烷∶甲醇∶三乙胺＝100∶2∶1)，得黄棕色油状物。将其与三苯基磷溶于二氯甲烷，冰浴中搅拌。将四氯化碳分批加入反应瓶，后转入室温搅拌24h。反应结束后，反应液水洗两次，有机层以无水硫酸钠干燥过夜。滤去无水硫酸钠，减压蒸发去溶剂，得黑色油状物。黑色油状物通过硅胶色谱柱纯化(展开剂二氯甲烷∶甲醇∶三乙胺＝200∶2∶1)，得黄棕色油状物。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ7.98(dd，j＝4.1，1.0hz，1h)，7.95(dd，j＝3.9，1.0hz，1h)，7.57(ddd，j＝8.4，6.8，1.3hz，1h)，7.37(ddd，j＝8.2，6.8，1.2hz，1h)，3.53(td，j＝6.9，4.9hz，4h)，3.09(s，2h)，2.73(s，2h)，1.94(dt，j＝6.7，3.5hz，4h)，1.85
‑
1.75(m，2h)，1.75
‑
1.66(m，2h)，1.48(dd，j＝8.4，5.9hz，4h).
[0047]
注：9
‑
氯
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶为自制，方法为：将邻氨基苯甲酸甲酯加入2n naoh水溶液中，室温条件下搅拌12h，滴加浓盐酸ph至4
‑
5，有白色固体析出，抽滤，将滤饼放置在红外灯下烘干，得到白色固体邻氨基苯甲酸。
[0048]
取上述邻氨基苯甲酸与环己酮加入茄形瓶中，将三氯氧磷加入恒压滴液漏斗中，
在冰浴条件下缓慢滴入反应瓶中，并与搅拌5min后，转移至油浴加热115℃。反应液回流3h，冷却至室温，冰浴中加水淬灭反应，用饱和nahco3溶液调ph至9，有黄色固体析出，抽滤，滤饼用二氯甲烷溶解，并用无水硫酸钠干燥。减压蒸发除去溶剂，硅胶色谱柱纯化(洗脱剂石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)，得到亮黄色固体，即9
‑
氯
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶。
[0049]
(3)n
‑
(6
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑
苯氧基)己基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶的合成
[0050]
将3
‑
(3
‑
(6
‑
甲基吡啶基))
‑5‑
(3
‑
羟基苯基)
‑
1，2，4
‑
噁二唑(中间体1)、n
‑
(6
‑
氯己基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶(中间体2)和碳酸钾溶于n，n
’‑
二甲基甲酰胺，90℃搅拌36h。将反应液冷却至室温，加入乙酸乙酯。有机层用饱和碳酸氢钠水溶液洗三次，卤水洗两次。减压蒸发去溶剂，得到黑色油状物。黑色油状物通过硅胶色谱柱纯化(展开剂石油醚∶二氯甲烷∶甲醇∶三乙胺＝100∶100∶2∶1)，得黄棕色油状物，即为n
‑
(6
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
甲基
‑
苯氧基)己基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ9.29(d，j＝1.9hz，1h)，8.33(dd，j＝8.1，2.2hz，1h)，7.98(d，j＝8.5hz，1h)，7.92(d，j＝8.1hz，1h)，7.81(d，j＝7.7hz，1h)，7.72(dd，j＝2.3，1.6hz，1h)，7.57(ddd，j＝8.2，6.7，1.2hz，1h)，7.47(t，j＝8.0hz，1h)，7.41
‑
7.30(m，2h)，4.08(t，j＝6.3hz，2h)，3.53(t，j＝7.2hz，2h)，3.08(s，2h)，2.74(s，2h)，2.67(s，3h)，1.93(t，j＝3.2hz，4h)，1.89
‑
1.84(m，2h)，1.77
‑
1.71(m，2h)，1.54(dt，j＝11.1，5.9hz，4h).hrms(esi)：found 534.2869，calcd for c
33
h
36
n5o2[m h]

534.2864.
[0051]
实施例2
[0052]
n
‑
(6
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
甲基
‑
苯氧基)己基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶的合成
[0053]
参考实施例1的合成方法，实施例1中的中间体1替换为3
‑
(3
‑
(6
‑
甲基吡啶基))
‑5‑
(4
‑
甲基
‑3‑
羟基苯基)
‑
1，2，4
‑
噁二唑，得浅棕色油状物，即为n
‑
(6
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
甲基
‑
苯氧基)己基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ9.29(d，j＝2.0hz，1h)，8.33(dd，j＝8.1，2.2hz，1h)，7.97(dd，j＝10.6，8.9hz，2h)，7.74(dd，j＝7.7，1.0hz，1h)，7.58(dd，j＝14.3，4.3hz，2h)，7.38(d，j＝7.3hz，1h)，7.31(d，j＝7.8hz，2h)，4.12(t，j＝6.2hz，2h)，3.55(t，j＝7.1hz，2h)，3.09(s，2h)，2.73(s，2h)，2.67(s，3h)，2.31(s，3h)，1.93(s，6h)，1.80
‑
1.72(m，2h)，1.62
‑
1.52(m，4h).hrms(esi)：found 548.3024，calcd for c
34
h
38
n5o2[m h]

548.3020.
[0054]
实施例3
[0055]
n
‑
(6
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
甲氧基
‑
苯氧基)己基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶的合成
[0056]
参考实施例1的合成方法，实施例1中的中间体1替换为3
‑
(3
‑
(6
‑
甲基吡啶基))
‑5‑
(4
‑
甲氧基
‑3‑
羟基苯基)
‑
1，2，4
‑
噁二唑，得浅棕色油状物，即为n
‑
(6
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
甲氧基
‑
苯氧基)己基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ9.27(s，1h)，8.32(d，j＝7.6hz，1h)，8.15(d，j＝7.8hz，1h)，8.06(d，j＝8.4hz，1h)，7.84(d，j＝8.3hz，2h)，7.68(s，1h)，7.65
‑
7.58(m，1h)，7.40(d，j＝7.6hz，1h)，7.31(d，j＝8.1hz，1h)，7.01(d，j＝8.3hz，1h)，4.16(t，j＝6.3hz，2h)，3.95(s，3h)，3.71(t，j＝7.0hz，2h)，3.16(s，2h)，2.66(s，5h)，1.91(s，6h)，1.86
‑
1.77(m，2h)，1.59(s，4h)
.hrms(esi)：found 564.2967，calcd for c
34
h
38
n5o3[m h]

564.2969.
[0057]
实施例4
[0058]
n
‑
(6
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
氟
‑
苯氧基)己基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶的合成
[0059]
参考实施例1的合成方法，实施例1中的中间体1替换为3
‑
(3
‑
(6
‑
甲基吡啶基))5
‑
(4
‑
氟
‑3‑
羟基苯基)
‑
1，2，4
‑
噁二唑，得深棕色油状物，即为n
‑
(6
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
氟
‑
苯氧基)己基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ9.28(s，1h)，8.38
‑
8.28(m，1h)，7.99(d，j＝8.2hz，1h)，7.95(d，j＝7.5hz，1h)，7.78(dd，j＝8.0，1.7hz，1h)，7.73(d，j＝3.5hz，1h)，7.60
‑
7.53(m，2h)，7.40
‑
7.36(m，1h)，7.35
‑
7.31(m，1h)，7.29(s，1h)，4.25
‑
4.09(m，2h)，3.56(d，j＝6.3hz，2h)，3.10(s，2h)，2.73(s，2h)，2.68(s，3h)，1.94(s，6h)，1.76(d，j＝6.3hz，2h)，1.63(d，j＝5.6hz，2h)，1.55(d，j＝5.4hz，2h).hrms(esi)：found 552.2771，calcd for c
33
h
35
fn5o2[m h]

552.2769.
[0060]
实施例5
[0061]
n
‑
(6
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
氯
‑
苯氧基)己基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶的合成
[0062]
参考实施例1的合成方法，实施例1中的中间体1替换为3
‑
(3
‑
(6
‑
甲基吡啶基))5
‑
(4
‑
氯
‑3‑
羟基苯基)
‑
1，2，4
‑
噁二唑，得浅棕色油状物，即为n
‑
(6
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
氯
‑
苯氧基)己基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ9.27(d，j＝1.5hz，1h)，8.32(dd，j＝8.1，2.2hz，1h)，7.95(dd，j＝13.9，8.5hz，2h)，7.76(dd，j＝8.2，1.6hz，1h)，7.72(d，j＝1.5hz，1h)，7.56(t，j＝8.2hz，2h)，7.34(dd，j＝16.4，8.2hz，2h)，4.18(t，j＝6.1hz，2h)，3.54(t，j＝7.2hz，2h)，3.08(s，2h)，2.73(s，2h)，2.67(s，3h)，1.93(s，6h)，1.75(dt，j＝14.3，7.3hz，2h)，1.67
‑
1.50(m，4h).hrms(esi)：found 568.2483，calcd for c
33
h
35
cln5o2[m h]

568.2474.
[0063]
实施例6
[0064]
n
‑
(6
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
溴
‑
苯氧基)己基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶的合成
[0065]
参考实施例1的合成方法，实施例1中的中间体1替换为3
‑
(3
‑
(6
‑
甲基吡啶基))5
‑
(4
‑
溴
‑3‑
羟基苯基)
‑
1，2，4
‑
噁二唑，得浅棕色油状物，即为n
‑
(6
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
溴
‑
苯氧基)己基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ9.27(d，j＝1.5hz，1h)，8.32(dd，j＝8.1，2.1hz，1h)，7.95(dd，j＝15.5，8.6hz，2h)，7.78
‑
7.66(m，3h)，7.56(t，j＝7.1hz，1h)，7.43
‑
7.27(m，3h)，4.18(t，j＝6.2hz，2h)，3.54(t，j＝7.1hz，2h)，3.08(s，2h)，2.73(s，2h)，2.67(s，3h)，1.93(s，6h)，1.79
‑
1.72(m，2h)，1.68
‑
1.51(m，4h).hrms(esi)：found 612.1963，calcd for c
33
h
35
brn5o2[m h]

612.1969.
[0066]
实施例7
[0067]
n
‑
(6
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
碘
‑
苯氧基)己基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶的合成
[0068]
参考实施例1的合成方法，实施例1中的中间体1替换为3
‑
(3
‑
(6
‑
甲基吡啶基))5
‑
(4
‑
碘
‑3‑
羟基苯基)
‑
1，2，4
‑
噁二唑，得浅棕色油状物，即为n
‑
(6
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶
基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
碘
‑
苯氧基)己基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ9.27(d，j＝1.8hz，1h)，8.32(dd，j＝8.1，2.1hz，1h)，8.05
‑
7.88(m，3h)，7.64
‑
7.51(m，3h)，7.34(dd，j＝15.1，7.6hz，2h)，4.17(t，j＝6.1hz，2h)，3.56(t，j＝7.1hz，2h)，3.08(s，2h)，2.74(s，2h)，2.67(s，3h)，1.93(s，6h)，1.77(dt，j＝14.4，7.3hz，2h)，1.67(dd，j＝15.7，7.4hz，2h)，1.61
‑
1.52(m，2h).hrms(esi)：found 660.1824，calcd for c
33
h
35
in5o2[m h]

660.1830.
[0069]
实施例8：
[0070]
(1)3
‑
(6
‑
甲基吡啶
‑3‑
基)
‑5‑
(3
‑
(丙
‑2‑
基
‑1‑
基氧基)苯基)
‑
1，2，4
‑
噁二唑(中间体1)的合成
[0071]
将3
‑
(丙
‑2‑
炔
‑1‑
基氧基)苯甲酸与n，n
’‑
羰基
‑
二咪唑溶于n，n
’‑
二甲基甲酰胺，室温搅拌45min。将6
‑
甲基
‑
n
‑
羟基
‑3‑
吡啶甲脒加入反应瓶，后升温至110℃搅拌5h。将反应液冷却至室温，倒入饱和碳酸氢钠水溶液中，有白色固体析出。抽滤，滤饼水洗两次。烘干得白色粉末。1h nmr(500mhz，cdcl3)δ7.80(dt，j＝7.6，1.3hz，1h)，7.74(dd，j＝2.7，1.5hz，1h)，7.44(t，j＝8.0hz，1h)，7.28(dd，j＝2.7，1.0hz，1h)，4.79(d，j＝2.4hz，2h)，2.58(d，j＝2.4hz，1h).
[0072]
注：3
‑
(丙
‑2‑
炔
‑1‑
基氧基)苯甲酸为自制，方法为：将3
‑
羟基苯甲酸加入茄形瓶中，加入甲醇和浓硫酸，回流6h，加入水冷却至室温，有白色析出，抽滤后烘干，得到白色固体。将白色固体加入茄形瓶中，加入溴丙炔、碳酸钾、丙酮，回流6h，冷却至室温，加水用二氯甲烷萃取三次，有机层用无水硫酸钠干燥后减压蒸发去溶剂，得到无色油状物。向瓶中加入2n的氢氧化钠水溶液，甲醇，油浴加热100℃。反应液回流约6h，反应结束后，冷却至室温。用2m的盐酸水溶液调节ph＝3析出大量白色固体，抽滤，烘干得白色固体物。
[0073]6‑
甲基
‑
n
‑
羟基
‑3‑
吡啶甲脒为自制，方法同实施例1(1)注。
[0074]
(2)n
‑
(2
‑
叠氮基乙基)
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶
‑9‑
胺(中间体2)的合成
[0075]
将2
‑
((1，2，3，4
‑
四氢吖啶
‑9‑
基)氨基)乙基甲磺酸盐和tmsn3溶于dmf，110℃搅拌12h后冷却至室温。向反应瓶中加入卤水，二氯甲烷萃取三次，二氯甲烷层无水硫酸钠干燥过夜。滤去无水硫酸钠，减压蒸发去溶剂，得棕色油状物。棕色油状物通过硅胶色谱柱纯化(展开剂二氯甲烷∶甲醇∶三乙胺＝100∶2∶1)，得棕色固体。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ7.96(d，j＝7.6hz，2h)，7.60(ddd，j＝8.3，6.7，1.4hz，1h)，7.41(ddd，j＝8.1，6.8，1.2hz，1h)，3.83(t，j＝5.8hz，2h)，3.70(t，j＝5.4hz，2h)，3.11(t，j＝5.3hz，2h)，2.83(d，j＝6.1hz，2h)，1.95(q，j＝3.4hz，4h)。
[0076]
注：2
‑
((1，2，3，4
‑
四氢吖啶
‑9‑
基)氨基)乙基甲磺酸盐为自制，方法为：将9
‑
氯
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶和乙醇胺溶于正戊醇，150℃搅拌24h。反应完毕后冷却至室温，将反应液倒入200ml石油醚中。有黑色油状物生成，倾去石油醚。黑色油状物通过硅胶色谱柱纯化(展开剂二氯甲烷∶甲醇∶三乙胺＝100∶2∶1)，得黄色固体。将黄色固体和4ml三乙胺溶于二氯甲烷，室温下加入tscl，60℃搅拌18h。将反应液冷却至室温，盐酸水溶液两遍，水层用二氯甲烷萃取两遍，减压蒸发去溶剂，得到棕色油状物。棕色油状物通过硅胶色谱柱纯化(展开剂二氯甲烷∶甲醇∶三乙胺＝100∶2∶1)，得黄棕色油状物。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ7.96(d，j＝7.6hz，2h)，7.60(ddd，j＝8.3，6.7，1.4hz，1h)，7.41(ddd，j＝8.1，6.8，1.2hz，1h)，3.83(t，j＝5.8hz，2h)，3.70(t，j＝5.4hz，2h)，3.13
‑
3.09(m，3h)，2.82(d，j＝5.4hz，2h)，1.95(q，j
＝3.4hz，4h)，1.36(t，j＝7.2hz，2h).
[0077]9‑
氯
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶为自制，方法同实施例1(2)注。
[0078]
(3)n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶的合成
[0079]
将3
‑
(6
‑
甲基吡啶
‑3‑
基)
‑5‑
(3
‑
(丙
‑2‑
基
‑1‑
基氧基)苯基)
‑
1，2，4
‑
噁二唑(中间体1)和n
‑
(2
‑
叠氮基乙基)
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶
‑9‑
胺(中间体2)加入反应瓶，加入反应瓶中加入水，后加入催化量五水硫酸铜和抗坏血酸，室温搅拌过夜。使用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥5h。减压旋蒸除去乙酸乙酯后得白色粉末，通过硅胶色谱柱纯化(展开剂dcm∶meoh＝200∶1)，得淡黄色粉末，即为n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ9.24(d，j＝2.1hz，1h)，8.30(dd，j＝8.1，2.2hz，1h)，8.11
‑
8.06(m，3h)，7.80(d，j＝7.7hz，1h)，7.75(t，j＝2.0hz，1h)，7.47(dt，j＝18.2，7.8hz，2h)，7.32(t，j＝7.5hz，2h)，7.21(dd，j＝8.3，2.6hz，1h)，5.31(s，1h)，5.28(s，2h)，4.91(t，j＝5.6hz，2h)，4.37(q，j＝5.7hz，2h)，3.10
‑
3.06(m，3h)，2.66(s，4h)，1.84(h，j＝6.6，5.2hz，4h).hrms(esi)：found 559.2558，calcd for c
32
h
30
n8o2[m h]

559.2485.
[0080]
实施例9
[0081]
n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
甲基
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶的合成
[0082]
参考实施例8的合成方法，实施例8中的中间体1替换为5
‑
(4
‑
甲基
‑3‑
(丙
‑2‑
炔
‑1‑
基氧基)苯基)
‑3‑
(6
‑
甲基吡啶
‑3‑
基)
‑
1，2，4
‑
噁二唑，得到淡黄色粉末，即为n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
甲基
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶。1h nmr(500mhz，cdcl3)δ9.22(d，j＝2.2hz，1h)，8.30(dd，j＝8.1，2.3hz，1h)，7.93(d，j＝8.4hz，1h)，7.79
‑
7.73(m，2h)，7.69(s，1h)，7.63
‑
7.60(m，1h)，7.54(s，1h)，7.37
‑
7.32(m，2h)，7.32
‑
7.29(m，1h)，5.33(s，2h)，4.62(dd，j＝6.5，4.5hz，2h)，4.07(d，j＝5.5hz，2h)，3.06(t，j＝6.2hz，2h)，2.68(s，3h)，2.62(t，j＝6.1hz，2h)，2.28(s，3h)，1.92
‑
1.82(m，4h).hrms(esi)：found 573.2713，calcd for c
33
h
32
n8o2[m h]

573.2641.
[0083]
实施例10
[0084]
n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
甲氧基
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶的合成
[0085]
参考实施例8的合成方法，实施例8中的中间体1替换为5
‑
(4
‑
甲氧基
‑3‑
(丙
‑2‑
炔
‑1‑
基氧基)苯基)
‑3‑
(6
‑
甲基吡啶
‑3‑
基)
‑
1，2，4
‑
噁二唑，得到淡黄色粉末，即为n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
甲氧基
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ9.22(s，1h)，8.29(dd，j＝8.2，2.2hz，1h)，8.19(d，j＝8.5hz，1h)，8.09(s，2h)，7.84(dd，j＝11.3，3.4hz，2h)，7.54(t，j＝7.7hz，1h)，7.38
‑
7.31(m，2h)，7.00(d，j＝8.4hz，1h)，6.85(s，1h)，5.33(s，2h)，4.94(s，2h)，4.39(d，j＝6.1hz，2h)，3.92(s，3h)，3.06(s，2h)，2.65(s，5h)，1.84(s，4h).hrms(esi)：found 589.2669，calcd for c
33
h
32
n8o3[m h]

589.2597.
[0086]
实施例11
[0087]
n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
氟
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶的合成
[0088]
参考实施例8的合成方法，实施例8中的中间体1替换为5
‑
(4
‑
氟
‑3‑
(丙
‑2‑
炔
‑1‑
基氧基)苯基)
‑3‑
(6
‑
甲基吡啶
‑3‑
基)
‑
1，2，4
‑
噁二唑，得到淡黄色粉末，即为n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
氟
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ9.26(s，1h)，8.31(dd，j＝8.3，2.2hz，1h)，8.01
‑
7.90(m，2h)，7.88
‑
7.80(m，1h)，7.74(d，j＝8.4hz，1h)，7.67(s，1h)，7.56(t，j＝7.6hz，1h)，7.38
‑
7.28(m，3h)，5.39(s，2h)，4.58(t，j＝5.6hz，2h)，4.04(d，j＝5.9hz，2h)，3.05(d，j＝7.3hz，2h)，2.64(d，j＝16.0hz，5h)，1.93
‑
1.83(m，4h).hrms(esi)：found 577.2646，calcd for c
32
h
29
fn8o2[m h]

577.2391.
[0089]
实施例12
[0090]
n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
氯
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶的合成
[0091]
参考实施例8的合成方法，实施例8中的中间体1替换为5
‑
(4
‑
氯
‑3‑
(丙
‑2‑
炔
‑1‑
基氧基)苯基)
‑3‑
(6
‑
甲基吡啶
‑3‑
基)
‑
1，2，4
‑
噁二唑，得到淡黄色粉末，即为n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
氯
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ9.20
‑
9.16(s，1h)，8.23(dd，j＝8.2，2.2hz，1h)，7.90
‑
7.81(m，2h)，7.78
‑
7.66(m，3h)，7.52
‑
7.43(m，2h)，7.32
‑
7.24(m，2h)，5.33(s，2h)，4.84(s，1h)，4.61(t，j＝5.2hz，2h)，4.01(s，2h)，2.99(d，j＝6.2hz，2h)，2.77(q，j＝7.3hz，2h)，2.59(d，j＝8.3hz，3h)，1.87
‑
1.72(m，4h).hrms(esi)：found 593.2166，calcd for c
32
h
29
cln8o2[m h]

593.2094.
[0092]
实施例13
[0093]
n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
溴
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶的合成
[0094]
参考实施例8的合成方法，实施例8中的中间体1替换为5
‑
(4
‑
溴
‑3‑
(丙
‑2‑
炔
‑1‑
基氧基)苯基)
‑3‑
(6
‑
甲基吡啶
‑3‑
基)
‑
1，2，4
‑
噁二唑，得到淡黄色粉末，即为n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
溴
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ9.20
‑
9.16(s，1h)，8.23(dd，j＝8.2，2.2hz，1h)，7.90
‑
7.81(m，2h)，7.78
‑
7.66(m，3h)，7.52
‑
7.43(m，2h)，7.32
‑
7.24(m，2h)，5.33(s，2h)，4.84(s，1h)，4.61(t，j＝5.2hz，2h)，4.01(s，2h)，2.99(d，j＝6.2hz，2h)，2.77(q，j＝7.3hz，2h)，2.59(d，j＝8.3hz，3h)，1.87
‑
1.72(m，4h).hrms(esi)：found 593.2166，calcd for c
32
h
29
cln8o2[m h]

593.2094.
[0095]
实施例14
[0096]
n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
碘
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶的合成
[0097]
参考实施例8的合成方法，实施例8中的中间体1替换为5
‑
(4
‑
碘
‑3‑
(丙
‑2‑
炔
‑1‑
基氧基)苯基)
‑3‑
(6
‑
甲基吡啶
‑3‑
基)
‑
1，2，4
‑
噁二唑，得到淡黄色粉末，即为n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，2，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
碘
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ9.25(s，1h)，8.31(dd，j＝8.1，
2.1hz，1h)，8.06(d，j＝8.5hz，1h)，8.02
‑
7.92(m，3h)，7.74(d，j＝1.6hz，1h)，7.60
‑
7.48(m，2h)，7.34(t，j＝8.7hz，2h)，5.93(s，1h)，5.39(s，2h)，4.83(s，2h)，4.28(s，2h)，3.12(s，2h)，2.66(s，5h)，1.86(s，4h).hrms(esi)：found 685.1526calcd for c
32
h
29
in8o2[m h]

685.1454.
[0098]
实施例15
[0099]
(1)2
‑
(6
‑
甲基吡啶
‑3‑
基)
‑5‑
(3
‑
(丙
‑2‑
炔
‑1‑
基氧基)苯基)
‑
1，3，4
‑
噁二唑(中间体1)的合成
[0100]
将3
‑
(丙
‑2‑
炔
‑1‑
基氧基)苯甲酸与n，n
’‑
二羰基咪唑溶于n，n
’‑
二甲基甲酰胺，室温搅拌45min。将6
‑
甲基烟酰肼加入反应瓶，后升温至110℃搅拌5h。将反应液冷却至室温，倒入饱和碳酸氢钠水溶液中，有白色固体析出。抽滤，滤饼水洗两次。烘干得白色粉末。将白色固体溶于三氯氧磷回流6h。将反应液冷却至室温，向其中缓慢加入饱和碳酸钠溶液至ph＝9，有灰色晶体析出，静置过夜后抽滤，滤饼使用水冲洗两次，得到灰色固体。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ9.24(s，1h)，8.33(d，j＝7.8hz，1h)，7.76
‑
7.62(m，2h)，7.35(t，j＝7.7hz，2h)，4.86(q，j＝2.3hz，2h)，2.71
‑
2.66(m，3h)，2.60
‑
2.55(m，1h)，2.35(d，j＝2.8hz，3h).
[0101]
注：3
‑
(丙
‑2‑
炔
‑1‑
基氧基)苯甲酸为自制，方法同实施例8(1)注。
[0102]6‑
甲基烟酰肼为自制，方法为：将6
‑
甲基烟酸甲酯溶于甲醇，加入水合肼，回流搅拌6h。减压旋蒸除去甲醇，冷却后向其中加入石油醚，此时有灰色晶体析出。抽滤后，滤饼使用石油醚冲洗两次，烘干得灰色晶体。
[0103]
(2)n
‑
(2
‑
叠氮基乙基)
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶
‑9‑
胺(中间体2)的合成
[0104]
方法同实施例8(2)。
[0105]
(3)n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，3，4
‑
噁二唑基)
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶的合成
[0106]
参考实施例8的合成方法，实施例8中的中间体1替换为2
‑
(6
‑
甲基吡啶
‑3‑
基)
‑5‑
(3
‑
(丙
‑2‑
炔
‑1‑
基氧基)苯基)
‑
1，3，4
‑
噁二唑，得到淡黄色粉末，即为n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，3，4
‑
噁二唑基)
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶。1h nmr(500mhz，cdcl3)δ9.20(s，1h)，8.29(d，j＝8.1hz，1h)，7.98(d，j＝17.4hz，3h)，7.70(d，j＝7.2hz，2h)，7.50(t，j＝6.9hz，1h)，7.44(t，j＝7.6hz，1h)，7.33(dd，j＝16.4，7.7hz，2h)，7.16(d，j＝8.0hz，1h)，6.01(s，1h)，5.27(s，2h)，4.82(s，2h)，4.27(s，2h)，3.07(q，j＝7.3hz，4h)，2.67(s，3h)，1.84(s，4h).hrms(esi)：found 559.2567，calcd for c
32
h
30
n8o2[m h]

559.2492.
[0107]
实施例16
[0108]
n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，3，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
甲基
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶的合成
[0109]
参考实施例8的合成方法，实施例8中的中间体1替换为2
‑
(4
‑
甲基
‑3‑
(丙
‑2‑
炔
‑1‑
基氧基)苯基)
‑5‑
(6
‑
甲基吡啶
‑3‑
基)
‑
1，3，4
‑
噁二唑，得到淡黄色粉末，即为n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，3，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
甲基
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶。1h nmr(500mhz，cdcl3)δ9.22(d，j＝2.3hz，1h)，8.30(dd，j＝8.1，2.3hz，1h)，7.93(d，j＝8.4hz，1h)，7.78
‑
7.72(m，2h)，7.69(s，1h)，7.63
‑
7.60
(m，1h)，7.54(t，j＝7.6hz，1h)，7.36
‑
7.29(m，3h)，5.33(s，2h)，4.62(dd，j＝6.6，4.4hz，2h)，4.07(q，j＝6.0hz，2h)，3.06(t，j＝6.2hz，2h)，2.68(s，3h)，2.62(d，j＝12.2hz，2h)，2.28(s，3h)，1.91
‑
1.84(m，4h).hrms(esi)：found 573.2724，calcd for c
33
h
32
n8o2[m h]

573.2651.
[0110]
实施例17
[0111]
n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，3，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
甲氧基
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶的合成
[0112]
参考实施例8的合成方法，实施例8中的中间体1替换为2
‑
(4
‑
甲氧基
‑3‑
(丙
‑2‑
炔
‑1‑
基氧基)苯基)
‑5‑
(6
‑
甲基吡啶
‑3‑
基)
‑
1，3，4
‑
噁二唑，得到淡黄色粉末，即为n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，3，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
甲氧基
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶。1h nmr(500mhz，cdcl3)δ9.21(s，1h)，8.31
‑
8.26(m，1h)，7.94(d，j＝8.3hz，1h)，7.79(d，j＝16.7hz，2h)，7.76
‑
7.71(m，2h)，7.54(t，j＝7.6hz，1h)，7.34(d，j＝8.4hz，2h)，7.01(d，j＝8.4hz，1h)，5.37(s，2h)，4.62(t，j＝5.5hz，2h)，4.07(d，j＝6.4hz，2h)，3.93(s，3h)，3.06(d，j＝6.5hz，2h)，2.68(s，3h)，2.61(d，j＝6.0hz，2h)，1.92
‑
1.81(m，4h).hrms(esi)：found 589.2669，calcd for c
33
h
32
n8o2[m h]

589.2597.
[0113]
实施例18
[0114]
n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，3，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
氟
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶的合成
[0115]
参考实施例8的合成方法，实施例8中的中间体1替换为2
‑
(4
‑
氟
‑3‑
(丙
‑2‑
炔
‑1‑
基氧基)苯基)
‑5‑
(6
‑
甲基吡啶
‑3‑
基)
‑
1，3，4
‑
噁二唑，得到淡黄色粉末，即为n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，3，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
氟
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ9.20(s，1h)，8.30(dd，j＝8.3，2.4hz，1h)，8.01(d，j＝7.5hz，2h)，7.91(t，j＝6.9hz，2h)，7.67(d，j＝5.7hz，1h)，7.50(t，j＝7.7hz，1h)，7.38
‑
7.30(m，2h)，7.22(dd，j＝10.7，8.4hz，1h)，5.87(s，1h)，5.35(s，2h)，4.81(s，2h)，4.26(s，2h)，3.09(s，2h)，2.68(s，3h)，2.61(s，2h)，1.84(s，4h).hrms(esi)：found 577.2472，calcd for c
32
h
29
fn8o2[m h]

577.24.
[0116]
实施例19
[0117]
n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，3，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
氯
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶的合成
[0118]
参考实施例8的合成方法，实施例8中的中间体1替换为2
‑
(4
‑
氯
‑3‑
(丙
‑2‑
炔
‑1‑
基氧基)苯基)
‑5‑
(6
‑
甲基吡啶
‑3‑
基)
‑
1，3，4
‑
噁二唑，得到淡黄色粉末，即为n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，3，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
氯
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶。1h nmr(500mhz，cdcl3)δ9.21(d，j＝2.2hz，1h)，8.30(dd，j＝8.1，2.3hz，1h)，7.93
‑
7.86(m，2h)，7.79(d，j＝20.2hz，2h)，7.64(dd，j＝8.2，1.8hz，1h)，7.51(dt，j＝7.7，3.6hz，2h)，7.35(d，j＝8.1hz，1h)，7.32(d，j＝7.8hz，1h)，5.30(s，2h)，4.66(t，j＝5.6hz，2h)，4.09(q，j＝5.8hz，2h)，3.04(t，j＝6.0hz，2h)，2.68(s，3h)，2.60(t，j＝6.0hz，2h)，1.90
‑
1.80(m，4h).hrms(esi)：found 593.2176，calcd for c
32
h
29
cln8o2[m h]

593.2104.
[0119]
实施例20
[0120]
n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，3，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
溴
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶的合成
[0121]
参考实施例8的合成方法，实施例8中的中间体1替换为2
‑
(4
‑
溴
‑3‑
(丙
‑2‑
炔
‑1‑
基氧基)苯基)
‑5‑
(6
‑
甲基吡啶
‑3‑
基)
‑
1，3，4
‑
噁二唑，得到淡黄色粉末，即为n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，3，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
溴
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ9.25(s，1h)，8.32(d，j＝8.2hz，1h)，7.95(d，j＝8.4hz，1h)，7.86(s，1h)，7.73(d，j＝9.4hz，3h)，7.63
‑
7.52(m，2h)，7.34(d，j＝12.1hz，2h)，5.42(s，2h)，5.32(q，j＝1.2hz，1h)，4.62(s，2h)，4.07(s，2h)，3.07(s，2h)，2.70(s，3h)，2.63(s，2h)，1.88(s，4h).hrms(esi)：found 637.1669，calcd for c
32
h
29
brn8o2[m h]

637.1597.
[0122]
实施例21
[0123]
n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，3，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
碘
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶的合成
[0124]
参考实施例8的合成方法，实施例8中的中间体1替换为2
‑
(4
‑
碘
‑3‑
(丙
‑2‑
炔
‑1‑
基氧基)苯基)
‑5‑
(6
‑
甲基吡啶
‑3‑
基)
‑
1，3，4
‑
噁二唑，得到淡黄色粉末，即为n
‑
(2
‑
(1
‑
(4
‑
(2
‑
(5
‑
(5
‑
(6
‑
(2
‑
甲基吡啶基))1，3，4
‑
噁二唑基)
‑2‑
碘
‑
苯氧基)乙基)
‑
1，2，3
‑
三氮唑基)乙基)
‑9‑
氨基
‑
1，2，3，4
‑
四氢吖啶。1h nmr(500mhz，cdcl3)δ9.21(s，1h)，8.31
‑
8.27(m，1h)，8.21(d，j＝8.4hz，1h)，8.17(s，1h)，8.12(d，j＝8.7hz，1h)，7.90(d，j＝8.0hz，1h)，7.71
‑
7.67(m，1h)，7.52(s，1h)，7.42(d，j＝8.0hz，1h)，7.35(d，j＝8.0hz，2h)，7.28(s，1h)，5.33(s，2h)，5.01(t，j＝5.6hz，2h)，4.44(d，j＝5.8hz，2h)，3.16(d，j＝5.7hz，2h)，2.68(d，j＝10.8hz，5h)，1.83(d，j＝5.5hz，4h).hrms(esi)：found 685.1530，calcd for c
32
h
29
in8o2[m h]

685.1456.
[0125]
表1实施例1
‑
21中合成的化合物结构式
[0126]
[0127]
[0128][0129]
下面是本发明部分化合物药效学试验及结果：
[0130]
1.胆碱酯酶抑制活性测定：
[0131]
药品与试剂：待测化合物、eeache(e.c.3.1.1.7，type vi
‑
s，选自电鳗)、eqbche(e.c.3.1.1.8，选自马血清)、huache(ec 3.1.1.7，选自人源)，hubche(ec 3.1.1.8，选自人源)。5，5
′‑
二硫双(2
‑
硝基苯甲酸)(dtnb)、乙酰硫代胆碱(atc)碘化物以及丁酰硫代胆碱(btc)碘化物均购于西格玛公司；他克林盐酸盐(9
‑
amin
‑
1，2，3，4
‑
tetrahydroacridine hydrochloride hydrate)购自biotrend公司。
[0132]
仪器：thermo varioskan flash全波长多功能酶标仪。
[0133]
实验方法：
[0134]
(1)配制缓冲液：13.6g磷酸二氢钾溶于1l水中，以氢氧化钾调节ph＝8.0
±
0.1。溶液于4℃保存，备用。
[0135]
(2)配制0.01m dtnb溶液：将0.396g dtnb及0.15g碳酸氢钠溶于100ml水中制得0.01m dtnb溶液，于
‑
30℃保存，备用。
[0136]
(3)配制0.075m atc、btc溶液：将0.217g atc溶于10ml水中制得0.075m atc及btc溶液，于
‑
30℃保存，备用；将0.237g btc溶于10ml水中制得0.075m btc溶液，于
‑
30℃保存，备用。
[0137]
(4)配制ache、bche溶液：将5000单位的ache溶于1ml 1％的凝胶溶液中，然后用水
稀释至100ml制得浓度为5单位/ml的ache溶液，于
‑
30℃保存，备用；将5000单位的bche溶于1ml 1％的凝胶溶液中，然后用水稀释至100ml制得浓度为5单位/ml的ache/bche溶液，于
‑
30℃保存，备用。
[0138]
(5)配制受试物溶液：将受试化合物溶于乙醇中以制得浓度为10
‑3m的溶液(乙醇不影响测试结果)，然后用水稀释分别制得浓度为10
‑4、10
‑5、10
‑6、10
‑7、10
‑8、10
‑9、10
‑
10
m的溶液。
[0139]
实验开始前，所用溶液均加温至室温，并将ache，buche溶液用水稀释一倍制成浓度为2.5单位/ml的酶溶液。用空白缓冲液(3ml)测得背景紫外吸收。先将100μl受试化合物溶液、100μl dtnb溶液、100μl酶溶液加至3ml缓冲液中，待加入20μl atc或btc溶液触发反应后立即计时并同时快速混匀测试溶液，2min后于412nm波长下测量紫外吸收度。空白对照组用等容积的水代替受试物溶液测得。所有测试均平行操作三次。以空白对照组的紫外吸收值作为100％，记录受试化合物在各个浓度下的吸光度值，所得结果用graphpad prism tm(graphpad software，san diego，ca，usa)软件以非线性衰退分析模式(non
‑
linear regression analysis model)计算得相应的ic
50
值，结果如表2所示。
[0140]
表2化合物靶标活性测定结果
[0141]
[0142][0143]
表2中的21个化合物均表现出了对aches和bches较好的抑制活性，且经过结构改造后，通式ii和通式iii对ches的抑制活性显著增强，甚至可达到纳摩尔级活性水平。在健康大脑中，aches的活性占主导地位(80％)，而bches似乎只起支撑作用。然而，在进行性的ad中，大脑中ache的水平逐渐下降到正常值的55～67％，而buche的水平则增加到正常值的120％。并且抑制bches表现出的外周胆碱能样副作用较弱。这表明在进行性ad发展过程中，对aches和bches的抑制对减缓ad的发病进程都极为重要。本发明所涉及化合物对ches有很好的抑制活性，有望对ad产生很好的疗效。
[0144]
2.pc 12神经细胞毒性测定：
[0145]
药品与试剂：待测化合物、dmem培养基(01
‑
050
‑
1a)购入于biological industries、fbs胎牛血清(04
‑
001
‑
1a)购入于biological industries、mtt噻唑兰试剂(kgt525500)购入于凯基生物。
[0146]
仪器：thermo varioskan flash全波长多功能酶标仪。
[0147]
实验方法：
[0148]
(1)接种细胞：首先收集对数期细胞，配制浓度为1
×
105/ml的细胞悬液，在96孔细胞培养板中每孔加入100μl细胞悬液(每孔1
×
104个细胞)，板置于37℃，5％co2培养箱中培养24h。
[0149]
(2)弃去培养液，用pbs缓冲盐溶液清洗1次，每孔加入100μl用dmem培养液配制的不同浓度的化合物，空白对照组只加不含化合物的dmem培养液。96孔板置于37℃，5％co2培养箱中培养24h，
[0150]
(3)避光每孔加入15μl mtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，继续培养3
‑
4h。
[0151]
(4)弃去培养基，每孔加入100μl二甲基亚砜，轻微震荡，使结晶物充分溶解在二甲基亚砜中。在多功能酶标测仪490nm处测量各孔的吸光值(od)。正常组od值被设定为100％，细胞存活率的计算公式如下：细胞存活率＝(给药组od值
‑
空白组od值)/(正常组od值
‑
空白组od值)
×
100％。实验结果如图1所示。
[0152]
当以直链己烷链为连接链的通式i化合物1～7浓度高于5μm时，pc12细胞基本不能存活，化合物对pc12细胞表现出较强的细胞毒性。当使用点击化学反应替换连接链时，得到的通式ii化合物8～14在浓度为15μm时，pc12细胞的存活率均可达到90％，而将1，2，4
‑
噁二唑环系替换为1，3，4
‑
噁二唑环系时，当化合物的浓度升高至20μm，pc12细胞存活率仍然可以保持在80％以上，化合物的细胞毒性得到明显的改善。
[0153]
3.nrf2激活活性测定：
[0154]
实验方法：
[0155]
(1)体外细胞培养。将转染含有are萤光素酶报告基因质粒的hepg2细胞使用10％胎牛血清的rpmi
‑
1640培养基，与37℃、5％co2条件下培养。
[0156]
(2)将处于对数生长期的hepg2
‑
are
‑
c8细胞用0.25％胰酶消化液处理，制成浓度为4
×
105的细胞悬浊液。分别向96孔酶标板中加入100μl培养过夜。
[0157]
(3)将待测化合物用培养基配置成2倍测试浓度，分别向对应的孔中加入100μl，叔丁基氢醌(tbhq)作为阳性对照，dmso为阴性对照。将加好化合物的96孔酶标板置于37℃、5％co2条件下孵育12h。
[0158]
(4)将萤光素酶检测试剂盒中的5
×
裂解液配置成1
×
裂解液，备用。
[0159]
(5)取出96孔板，将培养液从孔中吸出，用1
×
pbs缓冲液洗涤细胞，洗涤结束后将pbs缓冲液吸出。每孔中加入25或者30μl的1
×
细胞裂解液，冰上裂解15min。裂解完毕，静置3
‑
5min，吸取20μl上清液加入对应的96孔白色酶标板中。
[0160]
(6)将白色酶标版放入thermo scientific luminoskanasent化学发光微孔读数仪中，测试前向每个孔加入100μl荧光素酶测检测试剂(将荧光素酶检测试剂盒中1瓶萤光素酶检测底物与1瓶萤光素酶检查缓冲液均匀混合制得)，加入检测试剂后1min之内进行读数。
[0161]
其结果如图2所示。待测化合物在不同浓度下于测试细胞中对于are
‑
萤光素酶的诱导倍数为纵坐标，其结果显示，所有测试化合物在5个不同测试浓度下均表现出了一定的are报告基因诱导活性。对于通式ii和iii的化合物，无取代的化合物8和15较好，引入供电子基后化合物的nrf2诱导活性反而下降。化合物14表现出6倍的nrf2诱导活性，但是该化合物具有明显的细胞毒性，其对细胞的损伤可能在一定程度上激活了细胞的防御作用，使nrf2水平上调，造成化合物在本身的nrf2激活作用叠加了细胞防御性的are激活活性。
[0162]
4.抗炎活性测定
[0163]
ros检测方法：
[0164]
实验试剂：lps(sigma
‑
aldrich，shanghai，china)、活性氧检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，待测化合物，dmem培养基(01
‑
050
‑
1a)购入于biological industries、fbs胎牛血清(04
‑
001
‑
1a)购入于biological industries，mtt噻唑兰试剂(kgt525500)购入于凯基生物。
[0165]
实验耗材及仪器：96孔板(corning公司)，thermo varioskan flash全波长多功能酶标仪。
[0166]
实验步骤：
[0167]
选取对数生长期的bv2细胞，调整细胞浓度至1.0
×
105个/ml，在96孔细胞培养板中每孔加入100μl细胞悬液(每孔1
×
104个细胞)，置于37℃，5％co2培养箱中培养24h。弃去培养基，用pbs清洗一次，分别向各孔中加入含不同浓度化合物的dmem培养基，孵育2h(正常组不加化合物，空白组不加细胞，其余试剂正常加入，每个浓度设3个复孔)。2h后，加入lps溶液(5μg/ml)，并与测试化合物共同孵育24h。去除培养基，每孔加入用dmen培养基配置(1∶1000稀释)的浓度为10μm的dcfh
‑
da 0.1ml，37℃细胞培养箱内孵育20min，使探针和细胞充分接触。去除细胞培养液，用不含血清的dmem培养基洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的dafh
‑
da。使用多功能酶标仪读取发光值，整个操作需在10min内结束，以防止荧光猝灭。
[0168]
elisa检测方法：
[0169]
实验试剂及仪器：脂多糖(lipopolysaccharides，lps)，小鼠tnf
‑
a、1l
‑
1β、inos elisa检测试剂盒(sigma
‑
aldrich，中国上海)，待测化合物，dmem培养基(01
‑
050
‑
1a)购入于biological industries、fbs胎牛血清(04
‑
001
‑
1a)购入于biological industries，mtt噻唑兰试剂(kgt525500)购入于凯基生物。
[0170]
实验耗材及仪器：thermo varioskan flash全波长多功能酶标仪。
[0171]
实验步骤
[0172]
将bv2细胞接种于96孔板中，每孔100μl的细胞悬浮液(1x104cells孔)，在培养箱中培养24h后加入待测化合物。将各孔中的培养基吸净，分别向各孔加入含不同浓度化合物的dmem培养基，孵育2h(正常组不加化合物，空白组不加细胞，其余试剂正常加入，每个浓度设3个复孔)。2h后，加入lps溶液(5μg/ml)，并与测试化合物共同孵育24h后，按照elisa说明书进行测试，先将试剂盒在室温下平衡60min，把所需板条从铝箔袋中取出，剩余的板条用自封袋密封放回4℃。测试包括标准品孔和样本孔，分别向标准品孔各加50μl不同浓度的标准品；样本孔加入50μl待测样本，用封板膜封住反应孔，轻微混匀后在37℃恒温箱温育45min。移除样品，用洗涤液洗板4次。除空白孔外，其余待测孔每孔分别加入50μl过氧化物酶标记的检测抗体，用封板膜封住反应孔，37℃恒温箱温育30min。弃去液体，洗涤液洗板4次。在每个孔内加入50μl的辣根过氧化物酶，封板后轻微混匀，37℃恒温箱温育15min。弃去液体，洗涤液洗板4次。将50μl辣根过氧化物酶底物a和b依加入孔内，用封板膜封住反应孔，恒温孵育15min。加入50μl反应终止液轻微混匀，可以观察到孔内液体由蓝色变为黄色。使用多功能酶标仪在450nm读数，整个操作需在15min内结束，以防止荧光猝灭。
[0173]
结果如图3所示，化合物15在以上活性评价中有较好的活性表现，因此将其作为优
选分子检测其抗炎活性。与对照组相比，经lps处理后的细胞内的ros水平升高，经不同浓度的化合物15处理后，细胞内的ros水平可下降至与对照组相当，表明化合物15具有抗氧化应激作用。
[0174]
在lps的刺激作用下，bv2细胞内的促炎症因子tnf
‑
α、il
‑
1β及inos水平明显升高，如图4、5、6所示，经化合物15处理后，细胞内的tnf
‑
α、il
‑
1β及inos水平随着化合物浓度的升高降低至于空白组水平相当，初步表明化合物15有较好的抗炎作用。
[0175]
5.morris水迷宫研究小鼠行为学研究
[0176]
仪器：panlab smart 3.0行为学视频分析仪
[0177]
动物：成年雄性icr小鼠(8
‑
10周，体重20
‑
25g)购自扬州大学医学中心。
[0178]
试剂：氢溴酸东莨菪碱购自阿拉丁试剂公司(nat107418，上海)，他克林(纯度＞95％)，化合物15。
[0179]
实验方法：将40只小鼠随机分为4组(每组10只小鼠)：对照组，模型组，他克林组，化合物15处理组。将他克林，化合物15分别溶于cmc
‑
na溶液(0.5g cmc
‑
na，100ml蒸馏水)，进行灌胃给药(10mg/kg体重)。30min后，模型组，他克林组，化合物15处理组小鼠腹腔注射东莨菪碱(1mg/kg)，对照组小鼠腹腔注射生理盐水。通过水迷宫测试小鼠的认知功能和记忆能力。在一个圆形水池(直径120cm，高60cm)中固定一个逃生平台(直径10cm)，平台上固定一个5cm高的小旗子，水池中填充高度为40cm的水，并且保持温度在25℃组成水迷宫。服药第1
‑
2天将小鼠放在逃生平台进行训练，第3
‑
5天将平台放置到水下1cm，对小鼠进行训练，最后一天(第6天)将平台移走，对小鼠进行评估，记录小鼠到达平台所在位置的时间，轨迹及速度。实验结果如下。
[0180][0181]
结果分析：结合图7、8、9及表可知，与对照组相比，模型组小鼠到达平台的平均时间和距离高出很多，表明东莨菪碱会导致小鼠记忆缺陷，同时表明造模成功。相对于模型组，他克林组所耗时间和距离都显著降低，表明他克林对于小鼠的记忆和认知功能有显著性的改善。而化合物15组小鼠到达平台的平均时间和距离都略高于他克林组，但是明显低于模型组。表明化合物15对小鼠记忆和认知功能具有改善效果，但略逊于他克林。