IL17F基因人源化的非人动物及其构建方法和应用与流程

il17f基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
技术领域
1.本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种il17a和/或il17f基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。


背景技术：

2.白细胞介素(interleukin，il)17细胞因子(简称il17)家族是一类特征性细胞因子，主要由活化的th17细胞分泌。il17家族目前已经发现了6个成员，分别是il17a、il17b、il17c、il17d、il17e(又称il25)和il17f。il17受体(简称il17r)也形成了一个独特的家族，目前发现了5个同源亚基，分别是il17ra、il17rb、il17rc、il17rd、il17re。il17通过与受体结合，启动其下游信号通路(包括map激酶途径、nf
‑
kb途径、mrna稳定信号途径、erk信号途径以及jak/stat信号途径等)，刺激多种细胞产生炎症介质，已成为免疫和炎性疾病的关键参与因子，并可导致器官特异性或全身性自身免疫疾病，例如银屑病、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎等。
3.ill7a和ill7f作为th17细胞分泌的主要效应因子，具有很强的同源性，并有相似的调控、信号通路及功能。激活的th17细胞既能分泌il17a和il17f的同源二聚体，也表达由il17a和il17f组成的异源二聚体(il17a/il17f)，它们与il17受体家族的il17rc和il17ra组成的异源二聚受体复合物结合，启动下游细胞信号转导通路，诱导一系列促炎症细胞因子及化学趋化因子及基质金属蛋白酶(mmps)等促进组织炎症损伤。目前fda已经批准的三款靶向人il
‑
17/il
‑
17r相关抗体，包括il
‑
17a单抗secukinumab、ixekizumab和il
‑
17ra单抗brodalumab，适应症主要是中重度斑块状银屑病。然而，这些药物存在明显的副作用，比如感染、腹泻等，以及brodalumab与患者自杀倾向相关。考虑到现有治疗自身免疫性疾病的药物大多只能改善疾病症状，远不能充分满足临床需求，仍需要开发更多靶向il
‑
17/il
‑
17r的药物。
4.由于人il17氨基酸序列与啮齿类动物中的对应蛋白存在显著差异，如人il17a和小鼠il17a蛋白序列的一致性仅为60％，人il17f与小鼠il17f蛋白序列的一致性仅为56％，因此，识别人il17a蛋白和il17f蛋白的抗体通常无法识别小鼠的il17a和il17f，即无法用普通小鼠来筛选和评价靶向il17/il17r信号通路药物的药效。
5.鉴于il17/il17r在疾病发生过程中的广泛参与性和靶向该信号通路的巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域仍急需开发人源化il17/il17r信号通路相关的非人动物模型。因此，本技术提供了一种实验动物疾病模型，用于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和药物。


技术实现要素：

6.本发明的第一方面，提供了一种人源化il17f蛋白，所述人源化il17f蛋白包含人il17f蛋白的全部或部分。优选不包含il17f蛋白信号肽。
7.优选的，所述的人源化il17f蛋白还包含非人动物il17f蛋白的部分，优选包含非
人动物il17f蛋白的信号肽。
8.优选的，所述的人源化il17f蛋白包含人il17f基因的1号至3号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选包含2号至3号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选不含编码信号肽的氨基酸序列。更进一步优选的，包含seq id no：11编码的氨基酸序列。
9.优选的，所述的人源化il17f蛋白还包含非人动物il17f基因的1号至2号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选包含非人动物il17f基因的1号外显子的全部和2号外显子的部分编码的氨基酸序列。其中，2号外显子的部分包含编码信号肽的核苷酸序列。
10.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化il17f蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：
11.a)seq id no：8第31
‑
163位氨基酸序列的全部或部分；
12.b)与seq id no：8第31
‑
163位氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
13.c)与seq id no：8第31
‑
163位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
14.d)与seq id no：8第31
‑
163位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
15.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化il17f蛋白包含与seq id no：7第1
‑
28位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者与seq id no：7第1
‑
28位所示氨基酸序列一致。
16.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化il17f蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：
17.i)seq id no：16氨基酸序列的全部或部分；
18.ii)与seq id no：16氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
19.iii)与seq id no：16所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
20.iv)与seq id no：16所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
21.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
22.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
23.在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物为il17a基因人源化的非人动物。
24.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为
优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
‑
prkdc
scid il
‑
2rγ
null
小鼠、nod
‑
rag 1
‑
/
‑
‑
il2rg
‑
/
‑
(nrg)小鼠、rag 2
‑
/
‑
‑
il2rg
‑
/
‑
(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
25.本发明的第二方面，提供了一种人源化il17f基因，所述的人源化il17f基因包含人il17f基因的部分。
26.优选的，所述的人源化il17f基因包含人il17f基因1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选包含人il17f基因的2号至3号外显子的全部或部分。更进一步优选包含2号外显子的部分和3号外显子的部分，优选还包含2
‑
3号内含子的全部，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、50、70、100、150、160、161、162、163、164、165、170、200、220、221bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含164bp的核苷酸序列；2号外显子的部分优选包含编码seq id no：8第31
‑
85位的核苷酸序列，3号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、150、200、220、230、231、232、233、234、235、238、250、270、300、350、400、450、480、488bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含238bp的核苷酸序列；3号外显子的部分从3号外显子的第1个核苷酸至终止密码子。
27.优选的，所述的人源化il17f基因包含编码人il17f蛋白的核苷酸序列。进一步优选不含编码人il17f蛋白信号肽的核苷酸序列。更进一步优选包含编码seq id no：8第31
‑
163位的核苷酸序列。
28.优选的，所述的人源化il17f基因包含编码人il17f蛋白的cdna。
29.优选的，所述的人源化il17f基因还包含人il17f非编码区。
30.优选的，所述的人源化il17f基因还包含非人动物il17f基因的部分。进一步优选包含非人动物il17f基因1号至2号外显子的全部或部分。更进一步优选包含非人动物il17f基因1号外显子的全部和/或2号外显子的部分，优选还包含1
‑
2号内含子全部，其中2号外显子的部分优选包含编码信号肽的核苷酸序列。
31.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化il17f基因包含的人il17f基因的核苷酸序列包含下列组中的一种：
32.(a)seq id no：11所示核苷酸序列的全部或部分；
33.(b)与seq id no：11所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
34.(c)与seq id no：11所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
35.(d)具有seq id no：11所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
36.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化il17f基因包含的人il17f基因转录的mrna包含下列组中的一种：
37.(i)seq id no：55所示核苷酸序列的全部或部分；
38.(ii)与seq id no：55所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
39.(iii)与seq id no：55所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
40.(iv)与seq id no：55所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或
多个核苷酸的核苷酸序列。
41.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化il17f基因包含与seq id no：12、seq id no：13、seq id no：14或seq id no：56具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含seq id no：12、seq id no：13、seq id no：14或seq id no：56所示的核苷酸序列。
42.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化il17f基因转录的mrna包含下列组中的一种：
43.(i)seq id no：15所示核苷酸序列的全部或部分；
44.(ii)与seq id no：15所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
45.(iii)与seq id no：15所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
46.(iv)与seq id no：15所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
47.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
48.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
49.在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物为il17a基因人源化的非人动物。
50.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
‑
prkdc
scid il
‑
2rγ
null
小鼠、nod
‑
rag 1
‑
/
‑
‑
il2rg
‑
/
‑
(nrg)小鼠、rag 2
‑
/
‑
‑
il2rg
‑
/
‑
(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
51.优选的，所述的人源化il17f基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规诱导或阻遏的物质。
52.在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(tet
‑
off system/tet
‑
on system)或他莫昔芬系统(tamoxifen system)。
53.本发明的第三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含人il17f基因的部分。
54.优选的，所述的靶向载体包含人il17f基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选包含人il17f基因的2号至3号外显子的全部或部分。更进一步优选包含2号外显子的部分和3号外显子的部分，优选还包含2
‑
3号内含子的全部，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、50、70、100、150、160、161、162、163、164、165、170、200、220、221bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含164bp的核苷酸序列；2号外显子的部分优选包含编码seq id no：8第31
‑
85位的核苷酸序列，3号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、150、200、220、230、231、232、233、234、235、238、250、270、300、350、400、450、480、488bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含238bp的核苷酸序列；
3号外显子的部分从3号外显子的第1个核苷酸至终止密码子。最为优选包含与seq id no：11具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者与seq id no：11所示核苷酸序列一致。
55.优选的，所述的靶向载体还包含5’臂(5’同源臂)，其选自非人动物il17f基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000067.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述5’臂序列与seq id no：9或24至少具有90％同源性，或者如seq id no：9或24所示。和/或，所述的靶向载体还包含3’臂(3’同源臂)，其选自非人动物il17f基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸。优选的，所述的3’臂与ncbi登录号为nc_000067.6至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述的3’臂序列与seq id no：10或25至少具有90％同源性，或者如seq id no：10或25所示。
56.优选的，所述的靶向载体还包含seq id no：12、13、14和/或56。
57.优选的，所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的dna片段。
58.优选的，所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的dna片段。
59.优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物il17f基因座上。进一步优选的，位于il17f基因的1号至3号外显子上。更进一步优选的，位于il17f基因的2号至3号外显子上。
60.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
61.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
62.在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物为il17a基因人源化的非人动物。
63.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
‑
prkdc
scid il
‑
2rγ
null
小鼠、nod
‑
rag 1
‑
/
‑
‑
il2rg
‑
/
‑
(nrg)小鼠、rag 2
‑
/
‑
‑
il2rg
‑
/
‑
(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
64.优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素a亚基的编码基因(dta)。
65.在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列neo。
66.在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为frt重组位点(也可选择常规的loxp重组系统)。所述的特异性重组系统为具有两个frt重组位点，分别连接在抗性基因的两侧。
67.本发明的第四方面，提供了一种sgrna，所述的sgrna靶向非人动物il17f基因，同时所述sgrna的序列在待改变的il17f基因上的靶序列上。
68.优选的，所述sgrna的靶位点位于il17f基因的1号外显子至3号外显子序列上。
69.优选的，所述sgrna的靶位点位于il17f基因的2号外显子至3号外显子序列上。
70.优选的，所述sgrna的靶位点位于il17f基因的2号外显子和/或3号外显子序列上。
71.优选的，所述的sgrna靶向5’端靶位点序列如seq id no：26
‑
33中的任一项。进一步优选为seq id no：29。
72.优选的，所述的sgrna靶向3’端靶位点序列如seq id no：34
‑
41中的任一项。进一步优选为seq id no：34。
73.在本发明的一个具体实施方式中，sgrna靶位点序列选择seq id no：29和34。
74.本发明的第五方面，提供了一种编码上述sgrna的dna分子。
75.优选的，所述的dna分子的双链为sgrna的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。
76.在本发明的一个具体实施方式中，所述的dna分子双链的核苷酸序列如seq id no：42和44，seq id no：46和48，seq id no：43和45，seq id no：47和49。
77.本发明的第六方面，提供了一种包含上述sgrna或上述dna分子的sgrna载体。
78.本发明的第七方面，提供了一种包含上述靶向载体、sgrna、dna分子和/或sgrna载体的细胞。
79.本发明的第八方面，提供了上述靶向载体，上述的sgrna、上述的dna分子、上述的sgrna载体或者上述的细胞在il17f基因修饰中的应用。优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
80.本发明的第九方面，提供了一种il17f基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化il17f蛋白。
81.优选的，所述的非人动物的内源il17f蛋白表达降低或缺失。
82.优选的，所述的非人动物体内表达上述的人源化il17f蛋白。
83.优选的，所述的非人动物体内包含人il17f基因的部分，更优选包含上述的人源化il17f基因。
84.优选的，所述人il17f基因或者人源化il17f基因的核苷酸序列可操作的连接至非人动物内源调控元件。
85.优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化il17a蛋白。
86.进一步优选的，所述的人源化il17a蛋白包含人il17a基因的1号至3号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。
87.在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物体内表达全人il17a蛋白。该全人il17a蛋白可以是包含前导信号肽的全长il17a蛋白或者切割前导信号肽后的成熟il17a蛋白。
88.在本发明的一个具体实施方式中，所述的il17a基因人源化的非人动物表达seq id no：2所示的氨基酸序列。
89.优选的，所述的非人动物体内包含人或人源化il17a基因。进一步优选的，所述的人源化il17a基因包含人il17a基因的1号至3号外显子的全部或部分。更进一步优选的，所述的人源化il17a基因包含il17a基因的1号外显子的部分、2号外显子和3号外显子的部分，优选还包含1
‑
2号内含子和/或2
‑
3号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、25、26、27、28、29、30、50、70、80、84bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含27bp的核苷酸序列；1号外显子的部分从起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸，3号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、220、
230、235、236、237、238、239、240、250、300、500、700、900、1000、1300、1500、1584bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含238bp的核苷酸序列；3号外显子的部分从3号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。
90.在本发明的一个具体实施方式中，所述的il17a基因人源化的非人动物体内包含seq id no：5所示人il17a基因。
91.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化il17a基因包含seq id no：5所述的核苷酸序列。
92.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
93.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
94.在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物为il17a基因人源化的非人动物。
95.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
‑
prkdc
scid il
‑
2rγ
null
小鼠、nod
‑
rag 1
‑
/
‑
‑
il2rg
‑
/
‑
(nrg)小鼠、rag 2
‑
/
‑
‑
il2rg
‑
/
‑
(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
96.本发明的第十方面，提供了一种上述的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化il17f蛋白。
97.优选的，所述的人源化il17f蛋白如上述的人源化il17f蛋白。
98.优选的，所述的非人动物的基因组中还包含人或人源化il17f基因，所述的人源化il17f基因如上述的人源化il17f基因。
99.优选的，所述的构建方法包括用包含编码人il17f蛋白的核苷酸序列导入非人动物il17f基因座。进一步优选的，编码人il17f蛋白的核苷酸序列不含编码信号肽的核苷酸序列。更进一步优选的，包括用包含编码与seq id no：8第31
‑
163位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性或者与seq id no：8第31
‑
163位一致的核苷酸序列导入非人动物il17f基因座。
100.优选的，包括用包含编码人源化il17f蛋白的核苷酸序列导入非人动物il17f基因座。
101.优选的，包括用包含编码人il17f蛋白的cdna序列导入非人动物il17f基因座。
102.优选的，所述的构建方法包括用包含人il17f基因的部分导入非人动物il17f基因座。进一步优选的，包括用包含人il17f基因的1号至3号外显子的全部或部分导入非人动物il17f基因座。更进一步优选的，包括用包含人il17f基因的2号至3号外显子的全部或部分导入非人动物il17f基因座。再进一步优选的，包括用包含2号外显子的部分和3号外显子的部分核苷酸序列导入非人动物il17f基因座，优选还包含2
‑
3号内含子的全部，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、50、70、100、150、160、161、162、163、164、165、170、200、220、221bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含164bp的核苷酸序列；2号外显子的部分优选包含编码seq id no：8第31
‑
85位的核苷酸序列，3号外显子的部分至
少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、150、200、220、230、231、232、233、234、235、238、250、270、300、350、400、450、480、488bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含238bp的核苷酸序列；3号外显子的部分从3号外显子的第1个核苷酸至终止密码子。更进一步优选的，包括用包含与seq id no：11具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者与seq id no：11所示核苷酸序列一致的核苷酸序列导入非人动物il17f基因座。
103.优选的，包括用包含人源化il17f基因的核苷酸序列导入非人动物il17f基因座。
104.优选的，包括用包含人il17f基因的cds序列导入非人动物il17f基因座。
105.优选的，所述的构建方法包括将人il17f基因的部分导入非人动物2号至3号外显子。
106.优选的，所述的构建方法包括将人il17f基因的部分导入非人动物2号外显子的部分和3号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、50、70、100、150、160、161、162、163、164、165、170、200、220、221bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含164bp的核苷酸序列；2号外显子的部分优选包含编码seq id no：7第29
‑
83位的核苷酸序列，3号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、150、200、220、230、235、236、237、238、239、240、250、300、500、700、800、850、859bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含238bp的核苷酸序列；3号外显子的部分从3号外显子的第1个核苷酸至终止密码子。
107.优选的，本技术中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因，所述的替换优选为原位替换。
108.优选的，所述的人il17f基因、编码人il17f蛋白的核苷酸序列、人源化il17f或编码人源化il17f蛋白的核苷酸序列通过内源调控元件调控。
109.优选的，所述的插入或替换的位点为il17f基因的内源调控元件之后。
110.优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源il17f基因的编码框或者破坏插入序列之后的内源il17f基因的编码框，随后进行插入操作。或者所述的插入步骤即可给内源il17f基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。
111.进一步优选的，可在插入序列中加入辅助序列(例如终止密码子或含有终止功能的序列等)或其他方法(例如，翻转序列，或敲除序列)使得插入位点后的非人动物内源il17f蛋白不能正常表达。
112.优选的，所述的非人动物是纯合或者杂合的。
113.优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人源化il17f基因。
114.优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人或人源化il17f蛋白。
115.优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、规律成簇间隔短回文重复(crispr/cas9)技术、锌指核酸酶(zfn)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(talen)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。
116.优选的，使用靶向载体进行非人动物的构建，其中，所述的靶向载体包含人il17f基因的部分。进一步优选包含人il17f基因的1号至3号外显子的全部或部分。更进一步优选包含人il17f基因的2号至3号外显子的全部或部分。再进一步优选包含2号外显子的部分和
3号外显子的部分，优选还包含2
‑
3号内含子的全部，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、50、70、100、150、160、161、162、163、164、165、170、200、220、221bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含164bp的核苷酸序列；2号外显子的部分优选包含编码seq id no：8第31
‑
85位的核苷酸序列，3号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、150、200、220、230、231、232、233、234、235、238、250、270、300、350、400、450、480、488bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含238bp的核苷酸序列；3号外显子的部分从3号外显子的第1个核苷酸至终止密码子。最为优选包含与seq id no：11具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者与seq id no：11所示核苷酸序列一致。
117.优选的，所述的靶向载体还包含5’臂，其选自非人动物il17f基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000067.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述5’臂序列与seq id no：9或24至少具有90％同源性，或者如seq id no：9或24所示。和/或，所述的靶向载体还包含3’臂，其选自非人动物il17f基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸。优选的，所述的3’臂与ncbi登录号为nc_000067.6至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述的3’臂序列与seq id no：10或25至少具有90％同源性，或者如seq id no：10或25所示。
118.优选的，所述的靶向载体还包含seq id no：12、13、14和/或56。
119.优选的，所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的dna片段。
120.优选的，所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的dna片段。
121.优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物il17f基因座上。进一步优选的，位于il17f基因的1号至3号外显子上。更进一步优选的，位于il17f基因的2号至3号外显子上。
122.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得il17f基因人源化的非人动物。
123.优选的，为提高重组效率，还可以使用sgrna与上述靶向载体一起进行非人动物的构建。其中，所述的sgrna靶向非人动物il17f基因，同时所述sgrna的序列在待改变的il17f基因上的靶序列上。
124.优选的，所述sgrna的靶位点位于il17f基因的1号外显子至3号外显子序列上。
125.优选的，所述sgrna的靶位点位于il17f基因的2号外显子至3号外显子序列上。
126.优选的，所述sgrna的靶位点位于il17f基因的2号外显子和/或3号外显子序列上。
127.优选的，所述的sgrna靶向5’端靶位点序列如seq id no：26
‑
33中的任一项。进一步优选为seq id no：29。
128.优选的，所述的sgrna靶向3’端靶位点序列如seq id no：34
‑
41中的任一项。进一步优选为seq id no：34。
129.在本发明的一个具体实施方式中，sgrna靶位点序列选择seq id no：29和34。
130.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、sgrna及cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得il17f基因人源化的非人动物。
131.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基
因编辑制备基因人源化的非人动物。
132.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
133.在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物为il17a基因人源化的非人动物。
134.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
‑
prkdc
scid
il
‑
2rγ
null
小鼠、nod
‑
rag 1
‑
/
‑
‑
il2rg
‑
/
‑
(nrg)小鼠、rag 2
‑
/
‑
‑
il2rg
‑
/
‑
(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
135.优选的，所述非人哺乳动物还表达人或人源化il17a、il12、il23、il4r和il6蛋白中的至少一种。
136.优选的，所述的人源化il17a蛋白包含人il17a基因的1号至3号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。
137.优选的，所述的非人动物体内包含人或人源化il17a基因，优选的，所述的人源化il17a基因包含人il17a基因的1号至3号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化il17a基因包含人il17a基因的1号外显子的部分、2号外显子和3号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、25、26、27、28、29、30、50、70、80、84bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含27bp的核苷酸序列；1号外显子的部分从起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸，3号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、220、230、235、236、237、238、239、240、250、300、500、700、900、1000、1300、1500、1584bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含238bp的核苷酸序列；3号外显子的部分从3号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。
138.优选的，所述的构建方法包括用包含人il17a基因的1号至3号外显子的全部或部分导入非人动物il17a基因座，优选包括用包含人il17a基因的1号外显子的部分、2号外显子和3号外显子的部分导入非人动物il17a基因座，其中，1号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、25、26、27、28、29、30、50、70、80、84bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含27bp的核苷酸序列；1号外显子的部分从起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸，3号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、220、230、235、236、237、238、239、240、250、300、500、700、900、1000、1300、1500、1584bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含238bp的核苷酸序列；3号外显子的部分从3号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。
139.本发明的第十一方面，提供了一种il17f基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失il17f基因的全部或部分核苷酸序列。
140.优选的，所述的非人动物缺失il17f基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选的，缺失2号至3号外显子的全部或部分。
141.在本发明的一个具体实施方式中，2号外显子的部分和3号外显子的部分，优选还包含2
‑
3号内含子的全部，其中，缺失的2号外显子的部分包含编码seq id no：8第31
‑
85位的核苷酸序列，缺失的3号外显子的部分包含编码区。
142.在本发明的一个具体实施方式中，采用上述sgrna制备il17f基因缺失的非人动物。
143.本发明的第十二方面，提供了一种il17a和il17f基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：
144.(一)提供表达人或人源化il17a蛋白的il17a基因人源化的非人动物；
145.(二)采用il17f基因人源化的非人动物的构建方法对步骤(一)提供的非人动物基因修饰，得到il17a和il17f基因修饰的非人动物。
146.优选的，所述的人源化il17a蛋白包含人il17a基因的1号至3号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。
147.在本发明的一个具体实施方式中，所述的il17a基因人源化的非人动物体内表达全人il17a蛋白。该全人il17a蛋白可以是包含前导信号肽的全长il17a蛋白或者切割前导信号肽后的成熟il17a蛋白。
148.在本发明的一个具体实施方式中，所述的il17a基因人源化的非人动物表达seq id no：2所示的氨基酸序列。
149.优选的，所述的il17a基因人源化的非人动物体内包含人或人源化il17a基因。进一步优选的，所述的人源化il17a基因包含人il17a基因的1号至3号外显子的全部或部分。更进一步优选的，所述的人源化il17a基因包含人il17a基因的1号外显子的部分、2号外显子和3号外显子的部分，优选还包含1
‑
2号内含子和/或2
‑
3号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、25、26、27、28、29、30、50、70、80、84bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含27bp的核苷酸序列；1号外显子的部分从起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸，3号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、220、230、235、236、237、238、239、240、250、300、500、700、900、1000、1300、1500、1584bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含238bp的核苷酸序列；3号外显子的部分从3号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。
150.在本发明的一个具体实施方式中，所述的il17a基因人源化的非人动物体内包含seq id no：5所示人il17a基因。
151.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化il17a基因包含seq id no：5所述的核苷酸序列。
152.优选的，所述步骤(一)中il17a基因人源化的非人动物的构建方法包括用包含编码人il17a蛋白的全部或部分核苷酸序列导入非人动物il17a基因座。
153.优选的，所述步骤(一)中il17a基因人源化的非人动物的构建方法包括用包含人il17a基因的1号至3号外显子的全部或部分核苷酸序列导入非人动物il17a基因座上。进一步优选包括用包含人il17a基因的1号外显子的部分、2号外显子和3号外显子的部分核苷酸序列导入非人动物il17a基因座，优选还包含1
‑
2号内含子和/或2
‑
3号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、25、26、27、28、29、30、50、70、80、84bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含27bp的核苷酸序列；1号外显子的部分从起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸，3号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、220、230、235、236、237、238、239、240、250、300、500、700、900、1000、1300、1500、1584bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含238bp的核苷酸序列；3号外显子的部
分从3号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。
154.优选的，使用il17a基因的靶向载体进行il17a基因人源化的非人动物的构建，所述的靶向载体包含人il17a基因的部分，优选包含1号至3号外显子的全部或部分核苷酸序列，进一步优选包含人il17a基因的1号外显子的部分、2号外显子和3号外显子的部分核苷酸序列，优选还包含1
‑
2号内含子和/或2
‑
3号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、25、26、27、28、29、30、50、70、80、84bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含27bp的核苷酸序列；1号外显子的部分从起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸，3号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、220、230、235、236、237、238、239、240、250、300、500、700、900、1000、1300、1500、1584bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含238bp的核苷酸序列；3号外显子的部分从3号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。
155.在本发明的一个具体实施方式中，所述的il17a基因的靶向载体包含seq id no：5所示的核苷酸序列。
156.优选的，所述il17a基因的靶向载体还包含5’和/或3’臂。
157.在本发明的一个具体实施方式中，所述的5’臂与seq id no：3至少具有90％同源性，或者如seq id no：3所示。
158.在本发明的一个具体实施方式中，所述的3’臂与seq id no：4至少具有90％同源性，或者如seq id no：4所示。
159.本发明的第十三方面，提供了一种il17a和il17f基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：
160.(一)提供上述il17f基因人源化的非人动物或其构建方法获得的非人动物；
161.(二)对步骤(一)提供的非人动物进行基因修饰，使其表达人或人源化il17a蛋白，得到il17a和il17f基因修饰的非人动物。
162.优选的，所述步骤(二)中基因修饰包括用包含编码人il17a蛋白的全部或部分核苷酸序列插入或替换至非人动物il17a基因座上。
163.优选的，所述步骤(二)中基因修饰包括用包含人il17a基因的1号至3号外显子的全部或部分核苷酸序列导入非人动物il17a基因座。进一步优选包括用包含人il17a基因的1号外显子的部分、2号外显子和3号外显子的部分核苷酸序列导入非人动物il17a基因座，优选还包含1
‑
2号内含子和/或2
‑
3号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、25、26、27、28、29、30、50、70、80、84bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含27bp的核苷酸序列；1号外显子的部分从起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸，3号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、220、230、235、236、237、238、239、240、250、300、500、700、900、1000、1300、1500、1584bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含238bp的核苷酸序列；3号外显子的部分从3号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。
164.优选的，使用il17a基因的靶向载体进行非人动物的构建，所述的靶向载体包含人il17a基因的部分。优选的，所述的靶向载体包含人il17a基因的1号至3号外显子的全部或部分核苷酸序列，优选包含人il17a基因的1号外显子的部分、2号外显子和3号外显子的部分核苷酸序列，优选还包含1
‑
2号内含子和/或2
‑
3号内含子，其中，1号外显子的部分至少包
含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、25、26、27、28、29、30、50、70、80、84bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含27bp的核苷酸序列；1号外显子的部分从起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸，3号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、220、230、235、236、237、238、239、240、250、300、500、700、900、1000、1300、1500、1584bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含238bp的核苷酸序列；3号外显子的部分从3号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。
165.在本发明的一个具体实施方式中，所述的il17a基因的靶向载体包含seq id no：5所示的核苷酸序列。
166.优选的，所述il17a基因的靶向载体还包含5’和/或3’臂。
167.在本发明的一个具体实施方式中，所述的5’臂与seq id no：3至少具有90％同源性，或者如seq id no：3所示。
168.在本发明的一个具体实施方式中，所述的3’臂与seq id no：4至少具有90％同源性，或者如seq id no：4所示。
169.本发明的第十四方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：
170.(一)提供il17f基因人源化的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物；
171.(二)将步骤(一)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
172.优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因il12、il23、il4r或il6中的一种或两种以上的组合修饰的的非人动物。
173.优选的，所述的修饰可以是敲除、突变、插入或替换等等方式或其组合。
174.优选的，所述的多基因修饰的非人动物为三基因修饰的非人动物、四基因修饰的非人动物、五基因修饰的非人动物、六基因修饰的非人动物、七基因修饰的非人动物、八基因修饰的非人动物或九基因修饰的非人动物。
175.优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。
176.本发明的第十五方面，提供了一种上述的构建方法获得的非人动物或其子代。
177.本发明的第十六方面，提供了一种il17a和il17f基因修饰的非人动物，所述的非人动物表达人或人源化il17f蛋白，和人或人源化il17a蛋白。
178.优选的，所述的人源化il17f蛋白选自本发明所述的人源化il17f蛋白。
179.优选的，所述的人源化il17a蛋白包含人il17a基因的1号至3号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。
180.优选的，所述的非人动物体内包含人或人源化il17f基因，和人或人源化il17a基因。
181.优选的，所述的人源化il17f基因选自本发明所述的人源化il17f基因。
182.优选的，所述的人源化il17a基因包含人il17a基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化il17a基因包含il17a基因的1号外显子的部分、2号外显子和3号外显子的部分，优选还包含1
‑
2号内含子和/或2
‑
3号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、25、26、27、28、29、30、50、70、80、84bp的
核苷酸序列，进一步优选的，包含27bp的核苷酸序列；1号外显子的部分从起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸，3号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、220、230、235、236、237、238、239、240、250、300、500、700、900、1000、1300、1500、1584bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含238bp的核苷酸序列；3号外显子的部分从3号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。
183.本发明的第十七方面，提供了一种动物的荷瘤或炎症模型，所述的荷瘤或炎症模型来源于上述的非人动物或其子代、上述的构建方法获得的非人动物。
184.本发明的第十八方面，提供了一种动物的荷瘤或炎症模型的制备方法，包括本发明任一所述的构建非人动物的构建方法获得。
185.本发明的第十九方面，提供了一种上述的非人动物或其子代、上述的构建方法获得的非人动物或上述的荷瘤或炎症模型在制备疾病动物模型中的应用。
186.优选的，所述的疾病动物模型选自多发性硬化、银屑病、哮喘、过敏动物模型。进一步优选为银屑病模型。
187.本发明的第二十方面，提供了一种上述的非人动物或其子代、上述的构建方法获得的非人动物或上述的荷瘤或炎症模型在制备治疗免疫相关疾病、肿瘤和/或炎症的药物中的应用。
188.本发明的第二十一方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物或其子代、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的荷瘤或炎症模型。优选的，所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物不能发育为动物个体。
189.本发明的第二十二方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的非人动物或其子代、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的荷瘤或炎症模型。优选的，所述的组织或器官或其培养物不能发育为动物个体。
190.本发明的第二十三方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的非人动物或其子代、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的荷瘤或炎症模型。优选的，所述的荷瘤后的瘤组织不能发育为动物个体。
191.本发明的第二十四方面，提供了一种il17f基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化il17f蛋白。优选的，所述的细胞表达上述的人源化il17f蛋白。
192.优选的，所述的细胞表达人或人源化il17a蛋白。进一步优选的，所述的人源化il17a蛋白包含人il17a基因的1号至3号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。
193.优选的，所述的细胞的基因组中包含人il17f基因的部分。进一步优选的，所述的细胞包含上述的人源化il17f基因。
194.优选的，所述的细胞的基因组中包含人il17a基因的部分。进一步优选的，包含人il17a基因的1号至3号外显子的全部或部分。更进一步优选的，所述的人源化il17a基因包含il17a基因的1号外显子的部分、2号外显子和3号外显子的部分，优选还包含1
‑
2号内含子和/或2
‑
3号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、25、26、27、28、29、30、50、70、80、84bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含27bp的核苷酸序列；1号外显子的部分从起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸，3号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、220、230、235、236、237、238、239、
240、250、300、500、700、900、1000、1300、1500、1584bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含238bp的核苷酸序列；3号外显子的部分从3号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。
195.优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。
196.本发明的第二十五方面，提供了一种il17f基因缺失的细胞，所述的细胞缺失il17f基因的全部或部分核苷酸序列。
197.优选的，所述的细胞缺失il17f基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选的，缺失2号至3号外显子的全部或部分。
198.在本发明的一个具体实施方式中，2号外显子的部分和3号外显子的部分，优选还包含2
‑
3号内含子的全部，其中，缺失的2号外显子的部分包含编码seq id no：8第31
‑
85位的核苷酸序列，缺失的3号外显子的部分包含编码区。
199.在本发明的一个具体实施方式中，采用上述sgrna制备il17f基因缺失的细胞。
200.优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。
201.本发明的第二十六方面，提供了一种表达上述的人源化il17f蛋白的构建体。
202.优选的，所述的构建体表达人或人源化il17a蛋白。进一步优选的，所述的人源化il17a蛋白包含人il17a基因的1号至3号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。
203.优选的，所述的构建体中包含人il17f基因的部分。进一步优选的，所述的构建体包含本发明所述的人源化il17f基因。
204.优选的，所述的构建体表达人或人源化il17f蛋白，所述的人源化il17f蛋白如上述的人源化il17f蛋白。
205.优选的，所述的构建体的基因组中包含人il17a基因的部分。进一步优选的，包含人il17a基因的1号至3号外显子的全部或部分。更进一步优选的，所述的人源化il17a基因包含il17a基因的1号外显子的部分、2号外显子和3号外显子的部分，优选还包含1
‑
2号内含子和/或2
‑
3号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、25、26、27、28、29、30、50、70、80、84bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含27bp的核苷酸序列；1号外显子的部分从起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸，3号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、220、230、235、236、237、238、239、240、250、300、500、700、900、1000、1300、1500、1584bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含238bp的核苷酸序列；3号外显子的部分从3号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。
206.优选的，所述的构建体还表达人il17a蛋白。
207.本发明的第二十七方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。
208.本发明的第二十八方面，提供了一种包含上述细胞的组织。优选的，所述的组织不能发育为动物个体。
209.本发明的第二十九方面，提供了来源于上述的人源化il17f蛋白、上述的人源化il17f基因、上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的荷瘤或炎症模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织、上述的细胞、上述的构建体、上述的细胞或上述的组织在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；或者在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应
用；或者在筛选、验证、评价或研究il17f通路功能、人il17f通路信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，炎症药物、免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。
210.优选的，所述应用不是疾病的治疗和/或诊断方法。
211.本发明的第三十方面，提供了一种人il17f特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的荷瘤或炎症模型。
212.优选的，所述的调节剂选自car
‑
t、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体。
213.优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
214.优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。
215.优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
216.优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
217.优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
218.优选的，所述人il17f特异性调节剂的筛选方法不是治疗方法。该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
219.本发明的第三十一方面，提供了一种干预方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体植入肿瘤细胞，向植入肿瘤细胞的个体施加干预方案，对施加干预方案后的个体进行肿瘤抑制效果检测和评价；其中，所述的个体选自上述的非人动物，上述的构建方法获得的非人动物，上述的非人动物或其子代，或者上述的荷瘤或炎症模型。
220.优选的，所述的干预方案选自car
‑
t、药物治疗。进一步优选的，所述的药物为抗原结合蛋白。所述的抗体结合蛋白为抗体。
221.优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
222.优选的，所述干预方案的评价方法不是治疗方法。该评价方法对干预方案的效果进行检测和评价，以确定该干预方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
223.本发明的第三十二方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的荷瘤或炎症模型在制备人il17f特异性调节剂中的用途。
224.本发明制备的il
‑
17f基因人源化的非人动物，其体内可以正常表达人或人源化il
‑
17f蛋白，且表达的人或人源化il
‑
17f蛋白可以特异性结合人il
‑
17f抗体。本发明制备的il
‑
17f和il
‑
17a基因双人源化的非人动物，其体内可以正常表达人或人源化il
‑
17f蛋白和人或人源化il
‑
17a蛋白，且表达的蛋白可以特异性结合il
‑
17f或il
‑
17a抗体。本技术制备的非人动物可以诱导制备多种疾病模型，例如哮喘、过敏、银屑病或多发性硬化等。并可用于针对人il
‑
17f通路靶位点的药物筛选、药效评估，筛选或评估治疗免疫相关疾病、炎症
或肿瘤的药物。同时，现有技术中显示：il17a和il
‑
17f在银屑病关节炎患者的皮损和炎症性滑膜中均有表达，与单纯阻断il
‑
17a相比，对il
‑
17a和il
‑
17f双重中和导致炎症相关基因和细胞因子表达水平降低，对疾病相关基因表达抑制作用增强。此外，在临床前模型中，il
‑
17a和il
‑
17f均已被证实与tnf协同刺激关键促炎性细胞因子的产生并放大组织炎症。本技术制备的il
‑
17f和il
‑
17a基因双人源化的非人动物，无论是在制备疾病动物模型还是在筛选、评估治疗免疫相关疾病、炎症或肿瘤的抗体时，均具有相当的优势。
225.本发明保护的主题“细胞”、“细胞或细胞系或原代细胞培养物”、“组织”、“组织或器官或其培养物”均不能发育为动物，其中，所述的细胞不是干细胞或受精卵细胞。所述的细胞可以是体细胞、淋巴细胞(优选为t细胞或b细胞)或肿瘤细胞等等。所述的组织可以是脾脏、淋巴结、骨髓、肿瘤或其培养物等等。
226.本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、银屑病、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。在本发明的一个具体实施方式中，可以为银屑病。
227.本发明所述的“炎症”可以为各个组织或器官的炎症，包括急性和慢性。优选为变质性炎症、渗出性炎症(例如浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎、增生性炎症、特异性炎症(例如结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。在本发明的一个具体实施方式中，可以为溃疡性结肠炎或强直性脊柱炎等等。
228.本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、脑胶质瘤、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为结肠癌、直肠癌、胃癌、卵巢癌或前列腺癌。
229.本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。
230.本发明所述的“人源化il17f蛋白”，包含来源于人il17f蛋白的部分和非人il17f蛋白的部分。
231.其中，所述的“人源化il17f蛋白”包含连续或间隔的5
‑
163个氨基酸序列与人il17f蛋白的氨基酸序列一致，优选为连续或间隔10
‑
133个，更优选为连续5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160或163个氨基酸序列与人il17f蛋白的氨基酸序列一致。
232.本发明所述的“人源化il17a蛋白”，包含来源于人il17a蛋白的部分和非人il17a蛋白的部分。
233.其中，所述的“人源化il17a蛋白”包含连续或间隔的5
‑
155个氨基酸序列与人il17a蛋白的氨基酸序列一致，优选为连续或间隔10
‑
155个，更优选为连续5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或155个氨基酸序列与人il17a蛋白的氨基酸序列一致。
234.本发明所述的“人源化il17f基因”，包含来源于人il17f基因的部分和非人il17f基因的部分。
235.其中，所述的“人源化il17f基因”包含连续或间隔的20bp
‑
9000bp个核苷酸序列与人il17f基因的核苷酸序列一致，优选为连续或间隔的20
‑
1963个，20
‑
402个更优选为20、50、100、200、300、400、402、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、1963、2000、2500、3000、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500或9000bp个核苷酸序列与人il17f基因的核苷酸序列一致。
236.本发明所述的“人源化il17a基因”，包含来源于人il17a基因的部分和非人il17a基因的部分。
237.其中，所述的“人源化il17a基因”包含连续或间隔的20bp
‑
3591bp个核苷酸序列与人il17a基因的核苷酸序列一致，优选为连续或间隔的20
‑
2861个，20
‑
468个更优选为20、50、100、200、300、400、468、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、2861、3000或3591bp个核苷酸序列与人il17a基因的核苷酸序列一致。
238.本发明所述的“xx号至xxx号外显子”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“1号至2号外显子”包含1号外显子、1
‑
2号内含子、2号外显子的全部核苷酸序列。
239.本发明所述的“x
‑
xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“1
‑
2号内含子”表示1号外显子与2号外显子之间的内含子。
240.本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段dna片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“il17f基因座”表示il17f基因1号至3号外显子上的任选一段的dna片段。在本发明的一个具体实施方式中，被插入或替换的il17f基因座可以是il17f基因1号至3号外显子上的任选一段的dna片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的il17f基因座可以是il17f基因2号至3号外显子上的任选一段的dna片段。
241.本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为dna、cdna、pre
‑
mrna、mrna、rrna、hnrna、mirnas、scrna、snrna、sirna、sgrna、trna。
242.本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
243.本发明所述“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调
整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
244.本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
245.在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述基因人源化的非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
246.在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自balb/c、a、a/he、a/j、a/wysn、akr、akr/a、akr/j、akr/n、ta1、ta2、rf、swr、c3h、c57br、sjl、c57l、dba/2、km、nih、icr、cfw、faca、c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kalwn、c57bl/6、c57bl/6j、c57bl/6byj、c57bl/6nj、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl/10cr和c57bl/ola的c57bl、c58、cba/br、cba/ca、cba/j、cba/st、cba/h品系的小鼠。
247.除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：molecular cloning a laboratory manual，2nded.，ed.by sambrook，fritschandmaniatis(cold spring harbor laboratory press：1989)；dna cloning，volumes i and ii(d.n.glovered.，1985)；oligonucleotide synthesis(m.j.gaited.，1984)；mullisetal.u.s.pat.no.4，683，195；nucleic acid hybridization(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；transcription and translation(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；culture of animal cells(r.i.freshney，alanr.liss，inc.，1987)；immobilized cells and enzymes(irl press，1986)；b.perbal，a practical guide to molecular cloning(1984)；the series，methods in enzymology(j.abelson and m.simon，eds.inchief，academic press，inc.，new york)，specifically，vols.154and 155(wuetal.eds.)and vol.185，
″
gene expression technology
″
(d.goeddel，ed.)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.h.miller and m.p.caloseds.，1987，cold spring harbor laboratory)；immunochemical methods in cell and molecular biology(mayer and walker，eds.，academic press，london，1987)；
handbook of experimental immunology，volumes v(d.m.weir and c.c.blackwell，eds.，1986)；and manipulating the mouse embryo，(cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，n.y.，1986)。
248.以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
249.本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。
250.下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
251.以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
252.图1：人和小鼠il17a基因座对比示意图(非按比例)。
253.图2：人源化il17a基因座示意图(非按比例)。
254.图3：il17a打靶策略示意图(非按比例)。
255.图4：利用本发明公开的人源化il17a小鼠诱导eae模型，各组小鼠的体重情况。
256.图5：利用本发明公开的人源化il17a小鼠诱导eae模型，各组小鼠的临床症状。
257.图6：利用本发明公开的人源化il17a小鼠诱导eae模型，雌性小鼠he染色观察组织病理学改变。
258.图7：利用本发明公开的人源化il17a小鼠诱导eae模型，雌性小鼠ihc染色观察组织病理学改变。
259.图8：利用本发明公开的人源化il17a小鼠诱导eae模型，经mog免疫后的小鼠淋巴结的cd3 cd4 t细胞中hil17 cd3 cd4 t细胞和ifnγ t细胞的百分比结果。
260.图9：人和小鼠il17f基因座对比示意图(非按比例)。
261.图10：人源化il17f基因座示意图(非按比例)。
262.图11：il17f基因打靶策略及靶向载体设计示意图一(非按比例)。
263.图12：f1代il17f人源化小鼠基因型检测结果，其中m为marker，wt为野生型对照，h2o为水对照，f1
‑
01、f1
‑
02、f1
‑
03、f1
‑
04为小鼠编号。
264.图13：f1代il17a/il17f双基因人源化小鼠基因型检测结果，其中m为marker，wt为野生型对照，pc为阳性对照，h2o为水对照，f1
‑
01、f1
‑
02为小鼠编号。
265.图14：il17f基因打靶策略及靶向载体设计示意图二(非按比例)。
266.图15：sgrna1
‑
sgrna16活性检测结果，其中，con为阴性对照，pc为阳性对照。
267.图16：f0代小鼠基因型鉴定结果，其中m为marker，wt为野生型对照，h2o为水对照，pc1和pc2为阳性对照，f0
‑
01、f0
‑
02、f0
‑
03为小鼠编号。
268.图17：f1代小鼠鼠尾基因型鉴定结果，其中，m为marker，wt为野生型对照，h2o为水对照；pc、pc1、pc2为阳性对照，f1
‑
01、f1
‑
02、f1
‑
03、f1
‑
04、f1
‑
05、f1
‑
06、f1
‑
07、f1
‑
08、f1
‑
09为小鼠编号。
269.图18：f1代southern blot检测结果，其中，wt为野生型对照，f1
‑
01、f1
‑
02、f1
‑
03、f1
‑
04、f1
‑
05、f1
‑
06、f1
‑
07、f1
‑
08、f1
‑
09为小鼠编号。
270.图19：il17a/il17f双基因人源化小鼠il17a蛋白表达检测结果，其中b
‑
hil17a/hil17f mice为il17a/il17f双基因人源化杂合子小鼠。
271.图20：il17a/il17f双基因人源化小鼠il17f蛋白表达检测结果，其中b
‑
hil17a/hil17f mice为il17a/il17f双基因人源化杂合子小鼠。
272.图21：野生型c57bl/6小鼠和il17a/il17f双基因人源化纯合子小鼠脾脏中白细胞亚型百分比。
273.图22：野生型c57bl/6小鼠和il17a/il17f双基因人源化纯合子小鼠脾脏中t细胞亚型百分比。
274.图23：野生型c57bl/6小鼠和il17a/il17f双基因人源化纯合子小鼠淋巴结中白细胞亚型百分比。
275.图24：野生型c57bl/6小鼠和il17a/il17f双基因人源化纯合子小鼠淋巴结中t细胞亚型百分比。
276.图25：使用il17a/il17f双基因人源化纯合子小鼠评估抗人il17a/il17f抗体ab在imq诱导的银屑病模型中的实验设计。
277.图26：使用il17ail17f双基因人源化纯合子小鼠，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中对照组(g1)、模型组(g2)和不同浓度的抗人il17a/il17f抗体给药组(g3
‑
g4)小鼠的体重统计图。
278.图27：使用il17ail17f双基因人源化纯合子小鼠，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中对照组(g1)、模型组(g2)和不同浓度的抗人il17a/il17f抗体给药组(g3
‑
g4)小鼠的银屑病样皮损处红斑评分统计图。
279.图28：使用il17ail17f双基因人源化纯合子小鼠，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中对照组(g1)、模型组(g2)和不同浓度的抗人il17a/il17f抗体给药组(g3
‑
g4)小鼠的银屑病样鳞屑评分统计图。
280.图29：使用il17ail17f双基因人源化纯合子小鼠，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中对照组(g1)、模型组(g2)和不同浓度的抗人il17a/il17f抗体给药组(g3
‑
g4)小鼠的pasi综合评分统计图。
281.图30：使用il17a/il17f双基因人源化纯合子小鼠，在咪喹莫特诱导的银屑病模型对照组(g1)、模型组(g2)和不同浓度的抗人il17a/il17f抗体给药组(g3
‑
g4)在诱导后第8天小鼠背部组织切片的he染色结果。
282.图31：使用il17a/il17f双基因人源化纯合子小鼠，在咪喹莫特诱导的银屑病模型对照组(g1)、模型组(g2)和不同浓度的抗人il17a/il17f抗体给药组(g3
‑
g4)小鼠背部组织表皮厚度统计图。
283.图32：使用il17a/il17f双基因人源化纯合子小鼠，在咪喹莫特诱导的银屑病模型对照组(g1)、模型组(g2)和不同浓度的抗人il17a/il17f抗体给药组(g3
‑
g4)小鼠背部组织切片的病理学评分统计图。
284.图33：使用il17a/il17f双基因人源化纯合子小鼠，在咪喹莫特诱导的银屑病模型对照组(g1)、模型组(g2)和不同浓度的抗人il17a/il17f抗体给药组(g3
‑
g4)在诱导后第6天小鼠背部皮肤状况；
285.图34：野生型和il17a/il17f双基因人源化纯合子小鼠rt
‑
pcr的检测结果，其中，
图a为il17a的检测结果，图b为il17f的检测结果， / 为野生型，h/h为il17a/il17f双基因人源化纯合子小鼠；
286.图35：野生型c57bl/6小鼠和il17a/il17f双基因人源化纯合子小鼠胸腺中白细胞亚型百分比；
287.图36：野生型c57bl/6小鼠和il17a/il17f双基因人源化纯合子小鼠胸腺中t细胞亚型百分比；
288.图37：野生型c57bl/6小鼠和il17a/il17f双基因人源化纯合子小鼠血常规检测结果；
289.图38：野生型c57bl/6小鼠和il17a/il17f双基因人源化纯合子小鼠血生化检测结果。
具体实施方式
290.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
291.在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
292.bbsi、ecori、bamhi、ncoi、scai酶购自neb，货号分别为r0539s、r0101m、r0136m、r0193m、r3122m；
293.c57bl/6小鼠和flp工具鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
294.ambion体外转录试剂盒购自ambion，货号am1354；
295.cas9mrna来源sigma，货号cas9mrna
‑
1ea；
296.uca试剂盒来源百奥赛图公司，货号bcg
‑
dx
‑
001；
297.humanil17a elisa试剂盒购自biolegend，货号为433917；
298.mouse il17a elisa试剂盒购自biolegend，货号为432507；
299.humanil17f elisa试剂盒购自biolegend，货号为435707；
300.mouse il17f elisa试剂盒购自biolegend，货号为436107；
301.pe抗人il17a抗体(抗人il17a pe)购自biolegend，货号为512305；
302.apc抗小鼠ifn
‑
γ抗体(抗小鼠ifn
‑
γapc)购自biolegend，货号为505809；
303.alexa 488抗小鼠cd3抗体购自biolegend，货号为100212；
304.brilliant violet 421
tm
抗小鼠cd4抗体购自biolegend，货号为100443；
305.brilliant violet 510
tm
抗小鼠cd45抗体购自biolegend，货号为103137；
306.ebioscience
tm
foxp3/transcription factor staining buffer set购自thermofisher，货号为00
‑
5523
‑
00；
307.in vivomab anti
‑
mouse cd3抗体购自bioxcell，货号be0001
‑
1；
308.in vivomab anti
‑
mouse cd28抗体购自bioxcell，货号be0015
‑
5；
309.ultra
‑
leaf
tm
purified anti
‑
mouse ifn
‑
γantibody购自biolegend，货号505834；
310.recombinant mouse tgf
‑
beta1 protein(mtgfβ)购自r&d，货号7666
‑
mb
‑
005；
311.cd4 t cell isolation kit mouse购自miltenyibiotec，货号130
‑
104
‑
454；
312.ultra
‑
leaf
tm
purified anti
‑
mouse il
‑
4antibody购自biolegend，货号504121；
313.recombinant mouse il
‑
6(carrier
‑
free)(mil6)购自biolegend，货号575702；
314.pma购自sigma，货号p1585；
315.ionomycin购自sigma，货号407952；
316.咪喹莫特乳膏(艾达乐)购自3m health care limited，规格为250mg:12.5mg，批准文号为h20160079；
317.mog35
‑
55购自prospec，规格100mg；
318.百日咳毒素(ptx)购自millipore，货号516560。
319.实施例1il17a基因人源化小鼠的制备
320.小鼠il17a基因(ncbi gene id：16171，primary source：mgi：107364，uniprot id：q62386，位于1号染色体nc_000067.6的第20730905至20734496位，基于转录本nm_010552.3及其编码蛋白np_034682.1(seq id no：1))和人il17a基因(ncbi gene id：3605，primary source：hgnc:5981，uniprot id：q16552，位于6号染色体nc_000006.12的第52186387至52190638位，基于转录本nm_002190.3及其编码蛋白np_002181.1(seq id no：2))对比示意图如图1所示。
321.为了达到本发明的目的，可在小鼠内源il17a基因座引入编码人il17a蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人il17a蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术在小鼠内源il17a基因座上用人il17a基因的序列替换特定小鼠il17a基因序列，如将至少包含小鼠il17a基因的起始密码子atg至终止密码子taa的约2.9kb的序列用对应的人dna序列替换，得到人源化il17a基因座(示意图如图2所示)，实现对小鼠il17a基因的人源化改造。
322.进一步设计如图3所示的打靶策略示意图，图中的靶向载体上含有5’同源臂、3’同源臂以及包含人dna片段(il17a)的a片段。其中，5’同源臂(seq id no：3)与ncbi登录号与nc_000067.6的第20727254
‑
20730961位核苷酸序列相同；3’同源臂(seq id no：4)与ncbi登录号与nc_000067.6的第20735137
‑
20739901位核苷酸序列相同；人dna片段(seq id no：5)与ncbi登录号为nc_000006.12的第52186432
‑
52189292位核苷酸序列相同。改造后的人源化小鼠il17a的mrna序列及其蛋白序列分别如seq id no：6和seq id no：2所示。
323.靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入c57bl/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用pcr和southern blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产f0代嵌合体鼠(黑白相间)。将f0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得f1代鼠，再将f1代杂合小鼠互相交配即可获得f2代纯合子鼠。
324.利用本发明公开的人源化小鼠可以诱导制备多种人类疾病模型，包括多发性硬化、哮喘、过敏等模型，可以用于测试人特异性抗体的体内药效。以实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，eae)模型的制备为例，选取本发明
制备的il17a基因人源化小鼠(10周龄)，采用mog免疫1次(第0天，皮下注射200μg/只)，并给予腹腔注射百日咳毒素(ptx)两次(第0天和第1天，剂量为400μg/只)。首次免疫后每天对小鼠称重并连续观察，待小鼠发病后分组，通过灌胃、腹腔注射或鼠尾静脉注射等多种途径给药。可通过行为学评分、脑/脊髓ihc(immunohistochemist ry)病理、he病理学检查、血清/脑匀浆的th17型多细胞因子检测和cns及脾、淋巴结的流式细胞术等多重检测指标评定不同人用药物的体内药效情况。实验分组如表1所示。
325.表1：实验分组
326.组别免疫周龄小鼠数量性别基因型g1(对照组)pbs104雌性il17a(h/h)g2(建模组)mog105雌性il17a(h/h)g3(对照组)pbs105雄性il17a(h/h)g4(建模组)mog105雄性il17a(h/h)
327.使用上述方法诱导后，pbs对照组(g1、g3)无一小鼠发病，仅在建模组(g2、g4)发现小鼠患病，临床症状表现为精神萎靡、体重下降、鼠尾张力消失、后肢或四肢麻痹、大小便失禁，个别小鼠表现为共济失调。两个建模组共10只小鼠全部发病，发病时间为首次免疫后第10
‑
12天，并且g1、g2和g3组小鼠出现体重减轻。随着致敏后天数的增加发病例数逐渐增加，发病后3
‑
5天临床症状达高峰，此后进入缓解期，体重逐渐增加，呈现“发病
‑
缓解”的趋势。
328.比较建模组雌性和雄性小鼠的发病情况，每天测量动物体重并根据4点评分体系(临床评分)评价神经病学指标：0＝正常；1＝尾巴软弱无力；2＝部分后肢麻痹；3＝全部后肢麻痹；4＝四肢麻痹。发现两性小鼠在建模过程中发病率、发病时间、达峰时间及症状严重程度无明显差别，但雌性小鼠体重和临床症状自行恢复程度较好(见图4、图5)，在实验结束时(第45天)取雌性小鼠的脊髓组织进行多聚甲醛固定、石蜡包埋切片后he和ihc染色观察组织病理学改变。对脊髓腰膨大白质纵切面进行染色，如图6和图7中的结果所示，mog免疫小鼠(建模组)的脊髓中有大量炎症细胞浸润，髓鞘蛋白大大减少，对照组小鼠脊髓未见异常。
329.在eae模型中，il17a主要由疾病发展期间的cd4 th17细胞产生。为了检测小鼠中人il17的产生，分离mog免疫的il17a人源化小鼠纯合子(雌性，n＝5)的淋巴结细胞，并在布雷菲德菌素a的存在下用pma和离子霉素刺激6小时。通过facs分析产生il17和ifnγ的细胞。图8显示了示例性的流式细胞术结果。结果表明，mog免疫后小鼠淋巴结的cd3 cd4 t细胞中hil17 cd3 cd4 t细胞和ifnγ t细胞的百分比均增加，从分子层面证明eae模型建造成功。
330.以上结果表明，使用本发明的方法制备的基因人源化小鼠可以用于建立稳定的eae模型。
331.实施例2il17f基因人源化小鼠的制备
332.小鼠il17f基因(ncbi gene id：257630，primary source：mgi：2676631，uniprot：q7tni7，位于1号染色体nc_000067.6的第20777146至20785274位，基于转录本nm_145856.2及其编码蛋白np_665855.2(seq id no：7))和人il17f基因(ncbi gene id：112744，primary source：hgnc：16404，uniprot id：q96pd4，位于6号染色体nc_000006.12的第52236681至52245689位，基于转录本nm_052872.4及其编码蛋白np_443104.1(seq id no：
8))对比示意图如图9所示。
333.为了达到本发明的目的，可在小鼠内源il17f基因座引入部分编码人il17f蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人源化il17f蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术将小鼠il17f基因2号至3号外显子的部分序列替换为人il17f的相应dna序列，得到人源化il17f基因序列(示意图如图10所示)，实现对小鼠il17f基因的人源化改造。
334.设计如图11所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体上含有小鼠il17f基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人il17f dna序列的a1片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，seq id no：9)与ncbi登录号为nc_000067.6第20782346
‑
20779455位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，seq id no：10)与ncbi登录号为nc_000067.6第20776845
‑
20772788位核苷酸序列相同；人il17f dna序列(seq id no：11)与ncbi登录号为nc_000006.12的第52238893
‑
52236931位核苷酸序列有99％的同源性，区别在于第52237842位的“g”替换为“a”；a1片段中人il17f序列转录的mrna序列为seq idno：55；a1片段中人il17f dna序列上游与小鼠的连接设计为dna序列上游与小鼠的连接设计为其中序列“cagct”中的“t”是小鼠的最后一个核苷酸，序列中的“c”是人的第一个核苷酸；人il17f dna序列下游与小鼠的连接设计为计为其中序列“agtaa”中的最后一个“a”是人的最后一个核苷酸，序列中的第一个“c”是小鼠的第一个核苷酸。
335.靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统frt重组位点，组成neo盒(neo cassette)。其中neo盒5’端与小鼠的连接设计为端与小鼠的连接设计为端与小鼠的连接设计为内，其中序列“caaag”的“g”是小鼠的最后一个核苷酸，序列的“g”是neo盒的第一个核苷酸；neo盒3’端与小鼠的连接设计为端与小鼠的连接设计为端与小鼠的连接设计为内，其中序列“gatcc”的最后一个“c”是neo盒的最后一个核苷酸，序列序列的第一个“c”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素a亚基的编码基因(dta))。改造后的人源化小鼠il17f的mrna序列如seq id no：15所示，表达的蛋白序列如seq id no：16所示。
336.靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入野生型小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用pcr检测外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产f0代嵌合体鼠(黑白相
间)。将f0代嵌合鼠与野生型小鼠回交获得f1代鼠，再将f1代杂合小鼠互相交配即可获得f2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后，再通过互相交配即可得到il17f基因人源化纯合子小鼠。可通过pcr鉴定子代小鼠体细胞的基因型。示例性的f1代小鼠(已去除neo标记基因)的鉴定结果见图12，其中，编号为f1
‑
01、f1
‑
02、f1
‑
03、f1
‑
04的小鼠为阳性杂合小鼠。
337.pcr检测引物序列如下：
338.l
‑
f1
‑
f(seq id no：17)：5
’‑
ccgaactatagtgactttcagtcttgct
‑3’
339.l
‑
f1
‑
r(seq id no：18)：5
’‑
atttatcctgccagcttgccattgt
‑3’
340.实施例3双基因人源化小鼠和多基因人源化小鼠
341.利用实施例1获得的il17a和/或实施例2获得的il17f人源化小鼠还可以制备含有il17a和/或il17f的双基因人源化或多基因人源化小鼠。例如，前述实施例2中，电转时使用的es细胞选择实施例1得到的il17a基因人源化阳性克隆细胞，可以进一步得到il17a和il17f基因人源化的双基因人源化小鼠。也可将本方法得到的il17a和/或il17f小鼠纯合或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到il17a和/或il17f人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子。
342.以il17a/il17f双基因人源化小鼠为例。由于小鼠il17a与il17f基因均位于1号染色体，在得到il17a人源化阳性es细胞后，按照实施例2的方法进行二次打靶，通过阳性子代小鼠的筛选，最终得到il17a/il17f双基因人源化小鼠。可通过pcr鉴定子代小鼠体细胞的基因型，示例性的f1代小鼠(已去除neo标记基因)的鉴定结果见图13(pcr检测引物序列及目的片段长度见表2)，其中，编号f1
‑
01、f1
‑
02的小鼠为阳性杂合小鼠。
343.表2：pcr检测引物序列及目的片段长度
[0344][0345][0346]
其中，引物l
‑
f1
‑
f位置位于il17f的5’同源臂左侧，r
‑
f1
‑
r位于il17f的3’同源臂右侧，l
‑
f1
‑
r和r
‑
f1
‑
f均位于il17f的人源序列上；引物wt
‑
f位于il17a的5’同源臂上，mut
‑
r位于il17a的人源序列上，wt
‑
r位于小鼠第1
‑
2内含子序列上。
[0347]
此外，还可以引入crispr/cas系统进行基因编辑，设计如图14所示的打靶策略，图中显示了靶向载体上含有小鼠il17f基因上游和下游的同源臂序列，以及人il17f dna序列，其中，上游同源臂序列(5’同源臂，seq id no：24)与ncbi登录号为nc_000067.6第
20781021
‑
20779455位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，seq id no：25)与ncbi登录号为nc_000067.6第20777766
‑
20776366位核苷酸序列相同；人il17f dna序列与图11中a1片段的人il17f dna序列相同。改造后的人源化小鼠il17f的mrna序列和蛋白序列分别与seq id no：15和seq id no：16相同。
[0348]
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体用于后续实验。
[0349]
靶序列决定了sgrna的靶向特异性和诱导cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgrna表达载体的前提。设计并合成识别靶位点的sgrna序列。靶位点位于il17f基因2号和3号外显子上，各sgrna在il17f上的靶位点序列如下：
[0350]
sgrna1靶位点序列(seq id no：26)：5
’‑
agcggttctggaattcacgtggg
‑3’
[0351]
sgrna2靶位点序列(seq id no：27)：5
’‑
gctcggaagaaccccaaagcagg
‑3’
[0352]
sgrna3靶位点序列(seq id no：28)：5
’‑
cgaatcttcaaccaaaaccaggg
‑3’
[0353]
sgrna4靶位点序列(seq id no：29)：5
’‑
atggggaactggagcggttctgg
‑3’
[0354]
sgrna5靶位点序列(seq id no：30)：5
’‑
acagtgttatcctccaggggagg
‑3’
[0355]
sgrna6靶位点序列(seq id no：31)：5
’‑
ctctcacagtgttatcctccagg
‑3’
[0356]
sgrna7靶位点序列(seq id no：32)：5
’‑
tgggaactgtcctcccctggagg
‑3’
[0357]
sgrna8靶位点序列(seq id no：33)：5
’‑
ttcccagccttctgcaaggcagg
‑3’
[0358]
sgrna9靶位点序列(seq id no：34)：5
’‑
agcgttgtcaggccgcttggtgg
‑3’
[0359]
sgrna10靶位点序列(seq id no：35)：5
’‑
tgcagcgttgtcaggccgcttgg
‑3’
[0360]
sgrna11靶位点序列(seq id no：36)：5
’‑
caggccgcttggtggacaatggg
‑3’
[0361]
sgrna12靶位点序列(seq id no：37)：5
’‑
tcaggccgcttggtggacaatgg
‑3’
[0362]
sgrna13靶位点序列(seq id no：38)：5
’‑
gtggacaatgggcttgacacagg
‑3’
[0363]
sgrna14靶位点序列(seq id no：39)：5
’‑
agggctgttctaattccttcagg
‑3’
[0364]
sgrna15靶位点序列(seq id no：40)：5
’‑
gaaggaattagaacagccctggg
‑3’
[0365]
sgrna16靶位点序列(seq id no：41)：5
’‑
gagaagatgctcctaaaagttgg
‑3’
[0366]
表3：sgrna相对活性检测结果
[0367][0368]
利用uca试剂盒检测多个sgrna的活性，从结果可见sgrna具有不同活性，其中，虽然sgrna6、sgrna8活性相对较低，这可能由于靶位点序列的特殊性导致，但根据我们的实
验，sgrna6、sgrna8的数值仍显著高于对照组数值，仍可判断sgrna6、sgrna8是具有活性的，活性满足基因打靶实验要求，具体检测结果见表3和图15。从中随机选择sgrna4和sgrna9进行后续实验。在其5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸(见表4)，退火后将退火产物分别连接至pt7
‑
sgrna质粒(质粒先用bbsi线性化)，获得表达载体pt7
‑
il17f
‑
4和pt7
‑
il17f
‑
9。
[0369]
表4：sgrna4和sgrna9正、反向寡核苷酸序列
[0370][0371][0372]
pt7
‑
sgrna载体由质粒合成公司合成含有t7启动子及sgrna scaffold的片段dna(seq id no：50)并依次通过酶切(ecori及bamhi)连接至骨架载体(来源takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。
[0373]
取实施例1获得的il17a人源化小鼠的原核期受精卵，利用显微注射仪将pt7
‑
il17f
‑
4和pt7
‑
il17f
‑
9质粒的体外转录产物(使用ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)、靶向载体与cas9 mrna预混好后注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(安德拉斯
·
纳吉，化学工业出版社，2006)中的方法进行受精卵的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，将获得的小鼠(f0代)通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的il17a/il17f双基因突变小鼠品系。
[0374]
可通过与本实施例前述相同的pcr方法鉴定f0代小鼠体细胞的基因型(引物序列相同)，部分f0代小鼠的鉴定结果见图16，图中编号为f0
‑
01、f0
‑
02、f0
‑
03的3只小鼠为阳性小鼠，经测序进一步验证这3只小鼠为阳性小鼠且无随机插入。
[0375]
将f0鉴定为阳性的il17a/il17f双基因人源化小鼠与il17a人源化小鼠交配得到f1代小鼠。可使用同样的pcr方法对f1代小鼠进行基因型鉴定，示例性结果见图17，图17中显示编号为f1
‑
01到f1
‑
09的9只小鼠均为阳性小鼠。对这9只f1代pcr鉴定为阳性的小鼠进行southern blot检测，确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组dna，选用bsphi酶或econi酶消化基因组，转膜，杂交。探针5’probe、3’probe分别位于5’同源臂左侧及3’同源臂上，具体探针及目的片段的长度见表5。
[0376]
表5：具体探针及目的片段的长度
[0377]
限制性内切酶探针野生型片段大小重组序列片段大小bsphi5’probe——5.6kbeconi3’probe20.0kb11.4kb
[0378]
探针合成引物如下：
[0379]5’
probe
‑
f(seq id no：51)：5
’‑
gcatcatcaatgaaaaccagcgcgt
‑3’
[0380]5’
probe
‑
r(seq id no：52)：5
’‑
agaaccctctcttccaacacaggaa
‑3’
[0381]3’
probe
‑
f(seq id no：53)：5
’‑
cctatctgggagttggtttggggtc
‑3’
[0382]3’
probe
‑
r(seq id no：54)：5
’‑
gaactcggagcctgcagatccaatc
‑3’
[0383]
southern blot检测结果见图18。综合5’probe和3’probe的结果，并进一步经测序验证，编号为f1
‑
02、f1
‑
03、f1
‑
04、f1
‑
08、f1
‑
09的5只小鼠均无随机插入，证实这5只小鼠为阳性杂合小鼠且不存在随机插入。这表明使用本方法能构建出可稳定传代，且无随机插入的il17a/il17f双基因人源化基因工程小鼠。
[0384]
可采用rt
‑
pcr检测il17a/il17f基因人源化小鼠体内人源化il17amrna和人源化il17f mrna的表达情况。分别选取7周龄野生型c57bl/6小鼠和人源化il17a/il17f纯合子小鼠各3只，脱颈安乐死后取脾脏组织，提取细胞总rna，利用逆转录试剂盒逆转录成cdna后进行pcr扩增，引物序列如表6所示。
[0385]
表6 rt
‑
pcr检测引物序列及目的片段长度
[0386]
[0387][0388]
部分检测结果显示(见图34)，在野生型c57bl/6小鼠细胞中可检测到鼠il17f和il17a mrna表达，未检测出人源化il17f和il17a mrna表达；在人源化il17a/il17f纯合子小鼠细胞中检测到人源化il17f和人源化il17a mrna表达，未检测出鼠il17f和il17a mrna表达。可通过常规检测方法确认获得的阳性小鼠体内人il17a蛋白和人源化il17f蛋白的表达情况，例如使用elisa方法。选取雌性野生型c57bl/6小鼠和il17a/il17f双基因人源化杂合子小鼠各3只，每只小鼠腹腔注射7.5μg抗鼠cd3抗体(mcd3)和4μg抗鼠cd28抗体(mcd28)，2h后取血清检测人il17a蛋白表达情况，检测结果(见图19)显示，在野生型c57bl/6小鼠体内检测到鼠il17a蛋白的表达，未检测到人il17a蛋白的表达；在il17a/il17f双基因人源化杂合子小鼠体内既检测到鼠il17a蛋白的表达，也检测到人il17a蛋白的表达。同样使用elisa方法检测小鼠体内人源化il17f蛋白的表达情况。分别取雌性野生型c57bl/6小鼠和il17a/il17f双基因人源化杂合子小鼠的脾细胞，分选出cd4 t细胞后加入2ug/ml的anti
‑
mouse cd3抗体和5ug/ml的anti
‑
mouse cd28抗体预包被的96孔板，再加入3ng/ml的mtgfβ、20ng/ml的mil6、10ug/ml的anti
‑
mouseifn
‑
γ、10ug/ml的anti
‑
mouse il
‑
4抗体培养72h，培养结束前5h加入50ng/ml的pma和1ug/ml的离子霉素(ionomycin)，诱导cd4 t细胞分化为th17细胞，培养结束后离心取上清进行elisa检测。检测结果(见图20)显示，在野生型c57bl/6小鼠体内检测到鼠il17f蛋白的表达，未检测到人源化il17f蛋白的表达；在il17a/il17f双基因人源化杂合子小鼠体内检测到鼠il17f蛋白的表达，也检测到人源化il17f蛋白的表达。
[0389]
进一步采用流式细胞术对野生型c57bl/6小鼠和il17a/il17f双基因人源化纯合子小鼠体内免疫细胞亚型进行分析。图21和图22分别为脾脏中白细胞亚型和t细胞亚型百分比，图23和图24分别为淋巴结中白细胞亚型和t细胞亚型百分比，图35和图36分别为胸腺细胞中白细胞亚型和t细胞亚型百分比，从图中可以看出，il17a/il17f双基因人源化纯合子小鼠体内白细胞亚群的表达谱与c57bl/6小鼠相似，il17a和il17f的人源化不影响t细胞(t cells)、b细胞(b cells)、nk细胞(nk cells)、粒细胞(granulacytes)、单核细胞(monocytes)、dc细胞(dendritic cells)和巨噬细胞(macrophages)的分化，也不影响t细胞中dn细胞、dp细胞、cd4

t细胞、cd8

t细胞、tregs细胞的分化。
[0390]
分别选取8周龄野生型c57bl/6小鼠和人源化il17a/il17f纯合子小鼠各1只，取外周血，进行血常规和血生化指标检测，其中，血常规包括白细胞计数(wbc)、红细胞计数(rbc)、血红蛋白浓度(hb)、红细胞压积(hct)、平均红细胞体积(mcv)、平均红细胞血红蛋白含量(mch)、平均红细胞血红蛋白浓度(mchc)、血小板计数(plt)、淋巴细胞计数(ly)、单核细胞计数(mo)、中性粒细胞计数(neut)、红细胞分布宽度(rdw)和平均血小板体积(mpv)；血生化指标检测包括白蛋白(alb)、谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)、总胆固醇(chol)、肌酐(cr)、血糖(glu)、甘油三酯(tg)和尿素(urea)，血常规指标检测结果如图37所示，人源化il17a/il17f纯合子小鼠与野生型小鼠相比，血常规参数一致，表明本发明实施例的方法对
小鼠进行il17a和il17f基因的人源化，未改变血细胞组成和形态；血生化指标检测结果如图38所示，人源化il17a/il17f纯合子小鼠与野生型小鼠相比，血清alt(丙氨酸转氨酶)和ast(天冬氨酸转氨酶)水平无统计学差异，表明本发明实施例的方法对小鼠进行il17a和il17f基因的人源化，未改变小鼠alt和ast水平或肝脏健康。
[0391]
实施例4动物模型体内药效验证
[0392]
利用本发明公开的il17a和/或il17f人源化小鼠可以诱导制备多种人类疾病模型，包括银屑病、多发性硬化、哮喘、过敏等模型，用于测试人特异性抗体的体内药效。以实施例3制得的il17a/il17f双基因人源化小鼠纯合子通过咪喹莫特(imiquimod，imq)诱导的方法建立银屑病模型。将il17a/il17f双基因人源化纯合子小鼠按照体重分为对照组(g1：凡士林)、模型组(g2：imq 凡士林)、低剂量给药组(g3：1mg/kg ab)和高剂量给药组(g4：3mg/kg ab)，每组5只。实验前3天用剃毛器去除小鼠背部毛发，露出2cm
×
4cm的皮肤区域。3天后(d0)，模型组和给药组小鼠使用10mg/cm2imq乳膏每天对背部皮肤区域进行涂抹，连续涂抹6天；对照组小鼠涂抹凡士林。给药组小鼠在d0、d3腹腔注射抗人il17a/il17f抗体(ab，使用常规方法免疫小鼠得到，参见janeway'simmunobiology(9thedition))，共给药2次。全部实验周期为8天，具体实验方案如图25所示。
[0393]
从d0开始每天称量小鼠体重，对小鼠进行拍照并观察小鼠背部情况，并对小鼠发病情况进行临床评分。评分项目包括小鼠皮损处红斑及鳞屑。每项根据严重程度分为0
‑
4分，pasi评分标准如下：0
‑
无；1
‑
轻度；2
‑
中度；3
‑
重度；4
‑
极重度。对各组小鼠每项评分和两项总分取平均值后进行比较。实验结束(d8)时，取小鼠背部皮肤标本切片处理后用苏木精和伊红染色(he)。对各组小鼠背部糜烂、棘突出现、角化不全、混合炎细胞浸润情况按照严重程度进行评分(0.5
‑
2分)：0.5
‑
轻微、1
‑
轻度、1.5
‑
中度、2
‑
重度；对基质细胞增生进行评分(0.5
‑
2分)：0.5为2
‑
4层、1为4
‑
6层、1.5为6
‑
8层、2为8
‑
10层；出现痂皮：0.5分。进行结果统计和组间病理学分析评分，并测量表皮厚度。
[0394]
从小鼠体重随时间的变化情况(图26)可知，对照组整个实验周期内体重平稳；模型组、给药组体重趋势一致，均从d0开始先下降，d3左右降至最低，再缓慢上升，实验过程中两组体重差异不大，实验终点时所有组小鼠体重接近且无明显差异。如图27
‑
29所示的背部皮肤红斑、鳞屑和综合pasi评分结果表明，对照组无一小鼠发病，而模型组和给药组表现出不同程度的疾病。对比模型组和给药组而言，给药组(g3、g4)的小鼠皮肤pasi评分明显低于模型组(g2)，而且3mg/kg治疗组(g4)评分又低于1mg/kg治疗组(g3)，说明对给药组小鼠给予抗人il17a/il17f抗体治疗对银屑病具有治疗作用，而且不同给药剂量对治疗组小鼠银屑病的治疗作用不同，3mg/kg治疗组(g4)治疗效果优于1mg/kg治疗组(g3)，呈现剂量依赖趋势。小鼠的背部组织切片的he染色结果(图30)、背部组织表皮厚度统计结果(图31)和背部组织切片的病理学评分统计结果(图32)表明，给药组背部皮肤在基质细胞增生、表皮增厚方面的病变程度均低于模型组。另外，模型组中部分小鼠的背部皮肤可见痂皮，而给药组中未见此种病变(图33)，提示模型组动物皮肤出现过溃破或糜烂，病变严重程度高于给药组。
[0395]
上述结果证明，本发明的人源化小鼠可以用于建立银屑病模型以评估针对人il17a/il17f的药物的体内功效。
[0396]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中
的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0397]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0398]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。