一种鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶的发酵制备方法与流程

技术特征：
1.一种鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶的发酵制备方法，其特征在于，所述鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶的发酵制备方法包括：进行鸡白痢沙门菌、沙门菌噬菌体ysp2的培养，并提取沙门菌噬菌体ysp2基因组；以噬菌体ysp2的全基因组为模板，利用引物lysp2
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zf/lysp2
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zr对裂解酶目的基因lysp2进行pcr扩增；进行表达载体p picz
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lysp2的构建与鉴定，进行重组毕赤酵母菌株x33
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p picz
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lysp2的筛选和鉴定；同时进行重组毕赤酵母菌x33
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p picz
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lysp2的诱导发酵及条件优化。2.如权利要求1所述鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶的发酵制备方法，其特征在于，所述进行鸡白痢沙门菌、沙门菌噬菌体ysp2的培养包括：所述进行鸡白痢沙门菌的培养包括：接种环挑取鸡白痢沙门菌于lb平板上划线，37℃过夜培养；选取单菌落接种至lb液体培养基中，37℃、160r/min震荡培养至菌浓度为108cfu/ml；所述进行沙门菌噬菌体ysp2的培养包括：挑取宿主菌接种于5ml的lb液体培养基中，37℃，160r/min震荡培养至od600为0.6；加入100μl噬菌体液，37℃，160r/min震荡培养至培养液清亮透明；用0.22μm微孔滤膜过滤培养液，收集滤液，加入30％甘油分装至1.5ml离心管中，
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4℃、
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80℃分别保存。3.如权利要求1所述鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶的发酵制备方法，其特征在于，所述进行沙门菌噬菌体ysp2基因组的提取包括：在1.5m l离心管中分别加入20μlproteinase k和200μl样品混匀；加入200μlbb，涡旋震荡15s后，56℃孵育15min；加入250μl无水乙醇，涡旋震荡15s，室温静置5min；10000r/min离心1min，弃废液；加入500μlwb，10000r/min离心1min弃废液，重复一次；10000r/min离心1min待晾干，转移至新的1.5ml rnase
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free离心管中；加入20μl无菌水，室温10000r/min离心1min洗脱收集dna，
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20℃保存备用。4.如权利要求1所述鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶的发酵制备方法，其特征在于，所述引物lysp2
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zf/lysp2
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zr根据鸡白痢沙门菌噬菌体ysp2裂解酶ly sp2基因的序列设计，通过于5’端和3’端插入限制性内切酶xho i和xba i的酶切位点得到，用于进行裂解酶lysp2基因的克隆及真核表达载体的构建；所述引物lysp2
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zf/lysp2
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zr理论扩增片段大小为495bp；引物lysp2
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zf序列如seq id no：1所示；引物lysp2
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zr序列如seq id no：2所示。5.如权利要求1所述鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶的发酵制备方法，其特征在于，所述进行表达载体p picz
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lysp2的构建与鉴定包括：(1)双酶切酵母表达载体p picz
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αa，利用t4 dna连接酶将载体与lysp2基因片段连接；连接产物转化到感受态dh5α中，筛选阳性转化子并提取质粒，进行pcr和测序鉴定；(2)挑转化的单菌落到5ml含zeocin 低盐lb培养基中，37℃培养6
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8小时，以菌液为模板进行pcr鉴定，鉴定所用引物为p picz
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αa载体上通用引物5’aox和目的基因下游引物lysp2
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zr，利用pcr mix体系进行扩增；(3)提取质粒，双酶切鉴定，1％凝胶电泳鉴定，阳性质粒，进行测序，对测序结果进行比对分析，检测是否存在碱基的突变和移码。6.如权利要求5所述鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶的发酵制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述pcr扩增程序如下：94℃预变性10min 1个循环；94℃预变性30s，63℃退火35s，
72℃延伸40s，反应29个循环；72℃延伸10min，4℃10min。7.如权利要求1所述鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶的发酵制备方法，其特征在于，所述进行重组毕赤酵母菌株x33
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p picz
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lysp2的筛选和鉴定包括：挑单菌落至含zeocin 的ypd培养基中，29℃培养12h；取菌液1ml加入1.5ml离心管中，8000r/min离心5min收集菌体；50μl的ph值8.0的ddh2o溶解dna，
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20℃保存备用；pcr鉴定正确的阳性重组酵母菌株命名为x33
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ppicz
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lysp2和空载酵母菌株x33
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p picz。8.如权利要求1所述鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶的发酵制备方法，其特征在于，所述进行重组毕赤酵母菌x33
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p picz
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lysp2的诱导发酵及条件优化包括：1)在转化的含zeocin 的ypd平板上挑取经酵母菌落pcr鉴定为阳性的转化子接种到25mlbmgy液体培养基中；2)于29℃，350r/min，震荡培养至od600为2.0；收集部分培养液在室温6000r/min离心5min，弃上清液并用无菌的pbs洗涤菌体2次；3)转移菌体至50mlbmmy培养基中，控制起始od600＝1.0，29℃，350r/min震荡培养72
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96h，并每隔12h补加1％甲醇至培养基，每隔24h取样分析菌体生长情况筛选高表达菌株。

技术总结
本发明属于生物学技术领域，公开了一种鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶的发酵制备方法，包括：进行鸡白痢沙门菌、沙门菌噬菌体YSP2的培养，并提取沙门菌噬菌体YSP2基因组；以噬菌体YSP2的全基因组为模板，利用引物LySP2


技术研发人员：冯新 宋战昀
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2021.07.26
技术公布日：2021/11/4