Pgk1蛋白、表达Pgk1蛋白的重组质粒、表达Pgk1蛋白的重组益生菌及应用的制作方法

pgk1蛋白、表达pgk1蛋白的重组质粒、表达pgk1蛋白的重组益生菌及应用
技术领域
1.本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种pgk1蛋白、表达pgk1蛋白的重组质粒、表达pgk1蛋白的重组益生菌pgk1蛋白的新用途及表达pgk1的重组益生菌及用于制备治疗和/或预防心脑血管疾病和代谢性疾病的药物的用途。
技术背景
2.脑血管疾病(cerebrovascular disease)指脑部血管的各种疾病，包括动脉粥样硬化、血栓形成、狭窄、闭塞、脑动脉炎、脑动脉损伤、脑动脉瘤、颅内血管畸形、脑动静脉瘘等，其共同特点是引起脑组织的缺血或出血性意外。典型的脑血管疾病主要有脑水肿、脑血栓、脑缺血、脑梗塞、脑卒中等。脑血栓是在脑动脉粥样硬化和斑块基础上，在血流缓慢和血压偏低的条件下，血液的有效成分附着在动脉的内膜形成血栓，成为脑血栓，临床上以偏瘫为主要临床表现。脑卒中是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性卒中和出血性卒中。血栓可引起脑梗的形成，脑梗又称为缺血性脑卒中；脑血栓、脑梗塞最终均可归结于卒中。而卒中是严重危害中国国民健康的重大慢性非传染性疾病，具有高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率和高经济负担五大特点。随着人口老龄化的加剧，脑血管病危险因素流行趋势更加明显，导致脑血管病的发病人数持续增加。目前，临床上尚无有效的治疗方法。因此，如何开发出一种能够显著治疗缺血性脑卒中的新药物是目前亟待解决的问题。
3.糖尿病是一种多因素引起的慢性代谢性疾病，是21世纪威胁人类健康的主要疾病之一，其特点是由于胰岛素分泌作用缺陷和/或外周胰岛素抵抗而导致的慢性高血糖。其中，ⅰ型糖尿病主要是胰岛素分泌不足引起的，需要依赖于注射胰岛素来维持血糖；ⅱ型糖尿病则是以胰岛素生物效应降低而导致的高血糖，约占所有糖尿病病例的90％。
4.磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1，pgk1)是糖酵解途径中的关键代谢酶，能够催化1，3
‑
二磷酸甘油酸(1，3
‑
bpg)转化为3
‑
磷酸甘油酸(3
‑
pg)，并产生糖酵解途径中的第一个atp，因而在细胞能量代谢中发挥着重要功能。pgk1在多种癌细胞中有高水平的表达。最近的研究表明，pgk1与肿瘤的发生和发展密切相关。pgk1在多个位点上发生磷酸化和乙酰化，在特定条件下会发生线粒体和细胞核的易位，进而抑制三羧酸(tca)循环代谢，直接或间接地增强糖酵解活性，同时增强癌细胞的warburg效应，促进癌细胞的增殖和生长。但是，目前并没有任何文献公开能够将pgk1应用于治疗心脑血管疾病和代谢性疾病。
5.本发明首先发现，pgk1蛋白能够治疗心脑血管疾病和代谢性疾病；其次，本发明构建了表达pgk1蛋白的重组质粒及重组益生菌，不仅解决了pgk1蛋白口服给药容易降解的问题，具有更好的顺应性，而且对心脑血管疾病和代谢性疾病具有更显著的治疗效果。


技术实现要素：

6.针对上述技术问题，本发明的首要目的是提供一种pgk1蛋白用于制备治疗和/或
1917、益生芽孢杆菌、乳球菌、丁酸杆菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌、巴斯德毕赤酵母。
28.优选地，所述益生菌为大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917。
29.第五方面，本发明提供了一种上述第四方面所述的表达pgk1蛋白的重组益生菌在制备预防和/或治疗心脑血管疾病，和/或代谢性疾病药物中的应用。
30.优选地，所述心脑血管疾病包括心力衰竭、心肌缺血、心肌梗塞、心肌炎、高原型缺氧、脑水肿、脑缺血、脑血栓、脑梗死、脑卒中；所述代谢性疾病包括糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、高血糖高渗综合征、低血糖症、肥胖、痛风、蛋白质
‑
能量营养不良症、维生素a缺乏病、坏血病、维生素d缺乏症和骨质疏松症。
31.优选地，所述脑卒中包括出血性脑卒中和缺血性脑卒中。
32.优选地，所述疾病为缺血性脑卒中、糖尿病。
33.优选地，所述药物为口服药物。
34.优选地，所述表达pgk1蛋白的重组益生菌加入药学上可接受的载体制成口服制剂，所述口服制剂包括口服液、片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、混悬剂、乳剂、丸剂、散剂中的任一种。
35.优选地，所述口服制剂为表达pgk1蛋白的重组益生菌的活菌悬液、乳制品、活菌菌粉、菌片或胶囊。
36.第六方面，本发明提供了一种上述第四方面所述的表达pgk1的重组益生菌的制备方法，所述方法为：用上述第二方面所述的重组质粒转化益生菌，培养，筛选获得重组益生菌。
37.优选地，所述方法为：用上述第二方面所述的重组质粒pet
‑
28a
‑
pgk1转化大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917，挑取单克隆，在含有卡那霉素的培养基中培养，筛选获得表达pgk1的重组益生菌。
38.本发明的有益效果是：
39.(1)首先，本发明通过构建pgk1基因重组质粒并在益生菌中高效表达制备的重组益生菌能够显著减少脑缺血大鼠的脑梗死体积、改善神经行为，相较于益生菌原菌具有更显著的治疗效果。表明本发明所述的高效表达pgk1蛋白的重组益生菌能够作为治疗或者缓解缺血性脑卒中的药物，为临床治疗脑卒中提供新的选择；其次，本发明通过试验直接证明了表达pgk1的重组益生菌在缺血性脑卒中方面的有效性，但不局限于缺血性脑卒中，表达pgk1的重组益生菌对其他缺血缺氧相关的心脑血管疾病具有治疗作用；
40.(2)首先，本发明通过构建pgk1基因重组质粒并在益生菌中高效表达制备的重组益生菌能够显著降低糖尿病小鼠的血糖，相较于益生菌原菌具有更显著的治疗效果。表明本发明所述的高效表达pgk1蛋白的重组益生菌能够作为治疗或者缓解糖尿病的药物，为临床治疗糖尿病提供新的选择；其次，本发明通过试验直接证明了表达pgk1的重组益生菌在糖尿病方面的有效性，但不局限于糖尿病，表达pgk1的重组益生菌对其他血糖升高的相关代谢性疾病也具有治疗作用；
41.(3)本发明首先将表达pgk1的基因导入载体pet
‑
28a构建了表达pgk1的重组质粒pet
‑
28a
‑
pgk1，然后将其转化益生菌大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917获得了表达pgk1的重组益生菌，所述重组益生菌能够显著降低缺血性脑卒中和糖尿病的发病程度，未观察到不良反应和副作用；但本发明并不局限于载体pet
‑
28a，也不局限于大肠埃希
菌(escherichia coli)nissle 1917，只要根据本领域常规技术手段，构建表达pgk1的重组益生菌均能实现相同的效果；
42.(4)本发明改变了蛋白药物常规的用药方式(肌注或静注)，以口服给药的方式将蛋白药物应用于心脑血管疾病和代谢性疾病的治疗，解决了本领域长期未解决的技术问题，取得了显著的效果。
附图说明
43.图1重组质粒转化dh5α菌株pcr反应结果显示图；
44.图2重组质粒转化大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917pcr反应结果显示图；
45.图3表达pgk1蛋白的重组益生菌对mcao大鼠ttc染色结果；
46.图4表达pgk1蛋白的重组益生菌对mcao大鼠神经功能缺损评分和脑梗死体积结果图；
47.图5表达pgk1蛋白的重组益生菌对糖尿病小鼠血糖的影响。
具体实施方式
48.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下述实施例中的实验方法若无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买。
49.以下列实施例中所述的大肠杆菌菌种(escherichia coli)dh5α购自北京全式金生物技术有限公司；大肠杆菌菌种大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917购自德国(商标名为mutaflor)；重组质粒pet
‑
28a
‑
egfp购自淼灵质粒平台；无水乙醇购自天津大茂化学试剂公司；β
‑
乳糖(β
‑
lactose，含70％的β
‑
乳糖和30％的α
‑
乳糖)购自麦克林生物科技有限公司；2，3，5
‑
氯化三苯基四氮唑(ttc)购自solarbio公司；所用pcr引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司；所述细菌质粒dna提取试剂盒购自axygen公司；所述primestar hs(premix，2x)、t4 dna ligase购自takara公司；所述dna内切酶bamhi、ecorii购自北京neb公司；
50.所述lb(luria
‑
bertani)液体培养基配方为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％nacl；所述lb固体培养基配方为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％nacl、2％琼脂。
51.所述柠檬酸缓冲溶液的配置：将2.1g柠檬酸加入100ml蒸馏水中配制成a液，将2.94g柠檬酸钠加入100ml蒸馏水中配制成b液。将a液和b液按照1:1.32或1:1的比例混合，调节ph为4.2～4.5，混合的溶液用2.22μm的过滤器过滤。
52.以下实施例中所述的c57bl/6n小鼠是小鼠中使用最广泛的品系之一，也是基因工程中最常用作转基因或基因敲除小鼠的母本；实验动物c57bl/6n小鼠和sd大鼠均由中国农业科学院兰州兽医研究所提供，许可证号为scxk(甘)
‑
2020
‑
0002，适应性饲养一周，给予动物饮食并自由饮用蒸馏水，然后分组进行实验。
53.以下实施例中所述的丁苯酞软胶囊(恩必普，nbp)购自石药集团恩必普药业有限
公司；主要用于治疗轻、中度急性缺血性脑卒中。因此实施例2中将丁苯酞作为阳性药使用。
54.以下实施例中所述的mcao是指middle cerebral artery occlusion，大脑中动脉缺血。
55.以下实施例中所述的盐酸二甲双胍，其化学名称为：1.1
‑
二甲基双胍盐酸盐，用于单纯饮食控制不满意的2型糖尿病病人，尤其是肥胖和伴高胰岛素血症者，用本药不但有降血糖作用，还可能有减轻体重和高胰岛素血症的效果。对某些磺酰脲类疗效差的患者可奏效，如与磺酰脲类、小肠糖苷酶抑制剂或噻唑烷二酮类降糖药合用，较分别单用的效果更好。亦可用于胰岛素治疗的患者，以减少胰岛素用量。但盐酸二甲双胍并不能治愈2型糖尿病，且用药剂量大，用药周期长，副作用大，对糖尿病并发症没有治疗作用。因此实施例3中使用盐酸二甲双胍作为阳性药物，由0.9％生理盐水进行配制。
56.以下实施例中所述的链脲菌素，又叫链佐星(streptozocin，stz)化学名为2
‑
脱氧
‑2‑
[[(甲基亚硝基氨基)羰基]
‑
氨基]
‑
d
‑
吡喃葡萄糖，分子式为c8h
15
n3o7，分子量为265.22100，淡黄色结晶性粉末，易溶于水，但其水溶液在室温下极不稳定，可在半小时后分解为气体而挥发掉，故需现用现配。溶于较低度醇和酮，不溶于极性的有机溶剂。链脲菌素可损伤动物胰岛β细胞，使其胰岛素分泌减少，故可用来诱导糖尿病动物模型，一般大剂量(150mg/kg/day)单次注射可诱导1型糖尿病，小剂量(40～60mg/kg/day)多次注射(3～5天)联合高脂饲料喂养可诱导2型糖尿病。以下实施例中链脲菌素由0.9％生理盐水进行配制。
[0057]
以下实施例中所述的数据处理方式为：采用spss23.0软件进行统计学分析，数据以(x
±
s)表示，组间比较采用单因素方差分析(one
‑
way anova)和lsd
‑
t法进行两两比较。p<0.05认为具有统计学意义。
[0058]
实施例1表达pgk1的重组质粒和表达pgk1的重组益生菌的制备
[0059]
1.引物合成
[0060]
根据基因pgk1的核苷酸序列(seq id no.2所示)，与pet
‑
28a质粒图谱比较，设计特异引物，并在引物中插入限制性内切酶酶切位点bamhi和ecori，具体信息见表
‑
1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；用无菌去离子水将引物溶解，配成浓度为10μmol/l。
[0061]
表1引物信息及合成
[0062][0063]
2.重组质粒的构建
[0064]
pet
‑
28a
‑
pgk1质粒由金唯智生物科技有限公司合成。
[0065]
3.用重组质粒转化escherichia coli dh5α菌
[0066]
‑
80℃冰箱中取出dh5α感受态细胞，在冰盒上放置10
‑
20分钟，使其融化；取出50μl感受态细胞加入5μl质粒，用手指轻轻拨打几次混匀，将混合物在冰上放置25min；42℃热激45s后，迅速放回冰上静置2min，加0.5ml室温的lb液体培养基(不含抗生素)，37℃、200rpm振摇培养1h，取200μl上述菌液涂布于含有15μg/ml卡那霉素的平板上，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，在37℃条件下培养12h。
[0067]
4.热激转化成功菌落验证
[0068]
挑取单克隆，在含有15μg/ml的卡那霉素的液体培养基中扩增培养，进行pcr验证、酶切验证。验证结果如图1所示，目标条带分子量大小为1254bp，验证结果正确(图中箭头所指位置为目标条带)。
[0069]
5.提取重组质粒dna
[0070]
将成功转入重组质粒的菌株转接至lb培养基中放大培养，培养条件为：转速200rpm，温度为37℃。用axygen公司的质粒小提试剂盒提取质粒。
[0071]
6.制作大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917化学感受态细胞
[0072]
从
‑
80℃冰箱中取出保种的大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917(mutaflor)菌株，用灭菌的枪头挑取少量保菌液，在lb固体培养基上划线处理，并于37℃培养箱中过夜培养：从lb固体培养基上挑取湿润，圆滑的单菌落，放入lb培养液中，37℃培养12h；当菌液od600值为0.3
‑
0.5时，将菌液转移到冰上预冷的已灭菌离心管中，冰浴30min，在4℃条件下，1520g离心10min；弃去上清，用500μl预冷的cacl2溶液(已过滤除菌)轻轻悬浮细胞，4℃条件下，1520g离心10min；重复上一步骤一次；弃去上清，加入500μl预冷的cacl2溶液(已过滤除菌)，小心悬浮细胞，即制成了感受态细胞悬液；制备好的感受态细胞悬液直接用于转化实验。未用完的感受态细胞加入等体积的已灭菌的20％甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中(每管100μl)，置于
‑
80℃冰箱保存。
[0073]
7.将重组质粒转入大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917菌株
[0074]
从
‑
80℃冰箱中取出escherichia coli nissle 1917化学感受态细胞中，在冰盒上放置10
‑
20分钟，使其融化。从中取出50μl感受态细胞加入5μl质粒，用手指轻轻拨打几次混匀，将混合物在冰上放置25min；在42℃热激45s后，迅速放回冰上静置2min，加0.5ml室温的lb液体培养基(不含抗生素)，37℃，200rpm振摇培养1h，取200μl上述菌液涂布于含有15μg/ml卡那霉素的平板上，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，在37℃条件下培养12h。
[0075]
8.热激转化成功菌落验证
[0076]
挑取单克隆，在含有15μg/ml的卡那霉素的液体培养基中扩增培养，之后进行pcr验证、酶切验证。实验结果如图2所示，验证正确得到表达pgk1蛋白的重组大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917益生菌。
[0077]
需要说明的是，本发明所述方法并不是对表达pgk1重组益生菌构建的唯一限定方法，通过常规的技术手段，构建任一表达pgk1的重组质粒，并通过常规的转化操作，将所述的表达pgk1的重组质粒转化大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917菌株或其他益生菌，均能够筛选获得表达pgk1的重组益生菌。
[0078]
实施例2表达pgk1的重组益生菌对缺血性脑卒中大鼠的治疗效果
[0079]
1.mcao模型的制备和给药时间：
[0080]
spf级健康雄性sd大鼠，体重180
‑
220g，适应性饲养一周后，随机分为7组，分组和给药剂量如下：
[0081]
假手术组(sham，口服给予等体积11.1mg/ml的β
‑
乳糖溶液)；
[0082]
mcao缺血再灌注模型组(ir，口服给予等体积0.9％生理盐水)；
[0083]
mcao模型 乳糖组(ir lactose，口服给予等体积11.1mg/ml的β
‑
乳糖溶液)；
[0084]
mcao模型 阳性药组(nbp，口服给予丁苯酞20mg/kg/day)；
[0085]
mcao模型 e.coli nissle 1917组：灌胃2.5ml的大肠埃希菌(escherichia coli)
nissle 1917原菌；
[0086]
mcao模型 pet
‑
28a
‑
egfp组：灌胃2.5ml含重组质粒pet
‑
28a
‑
egfp的重组大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917益生菌；
[0087]
mcao模型 pet
‑
28a
‑
pgk1组：灌胃2.5ml含有重组质粒pet
‑
28a
‑
pgk1表达pgk1的重组大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917益生菌。
[0088]
上述给药组均由11.1mg/ml的β
‑
乳糖溶液进行配制；
[0089]
预给药10天，参照文献(reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.)所述的线栓法制作大鼠右侧中动脉闭塞动物模型。
[0090]
模型组：将麻醉后的大鼠固定，备皮，碘伏消毒，并消毒手术器械，预备好结扎用的4号线，沿颈部正中偏右行纵向切口约1.5cm。小心分离右侧颈动脉和迷走神经后，用手术缝合线将颈总动脉与颈内动脉结扎，颈总动脉结扎位置在分岔口10mm处，之后在离颈总动脉分叉处5mm处切口，将直径为0.32mm的线栓经切口插入颈内动脉，线栓深度约为18
‑
20mm时，停止插线，系紧结扎线。清洗后，进行分层缝合。在动物缺血2h后去除线栓，动物会自然苏醒，再灌注24h，进行相关指标检测。与永久性脑缺血不同的是，在阻断2h后拔出尼龙线栓，扎紧动脉残端，消毒后逐层缝合皮下组织和皮肤。
[0091]
假手术组：除不插入线栓外其余操作同模型组。待实验动物清醒后，再进行药物干预，给药24h后处死取材。
[0092]
2.检测指标
[0093]
2.1神经功能缺损评分
[0094]
依据zea longa 5级评分：0分：无神经功能缺损；1分：病灶对侧前爪不能完全伸展；2分：向病灶对侧自发性旋转；3分：向病灶对侧倾倒；4分：无自发性行走且出现意识丧失。
[0095]
2.2ttc染色
[0096]
取每组大鼠，断头，冰上分离脑组织，去除嗅球和脑干，生理盐水冲洗后立即放入
‑
20℃冷冻15min，取出，将大脑沿视交叉平面至垂体平面冠状切均匀切成4片冠状切片，浸入1.5％ttc溶液，37℃恒温水浴中孵育染色(避光)45min，每15min翻一次，使染色均匀，与正常组织中的脱氧酶反应呈红色，缺血区呈白色，即未染色的区域为梗死区域，根据脑组织各冠状切片梗死体积总和占全脑体积百分比测定动物脑组织梗死体积。
[0097]
脑梗死体积＝(缺血侧面积均值总和
‑
对侧面积均值总和)
×
梗死脑组织厚度
[0098]
3.实验结果
[0099]
神经功能缺损评价、ttc染色和脑梗死体积结果如图3和图4所示。与假手术组相比，模型组的神经功能评分显著升高(
###
p﹤0.001)，脑组织ttc染色呈均匀的红色，未见缺血白色梗死灶，而mcao模型组可见大区域的白色梗死灶，表明大鼠mcao模型构建成功；与mcao模型组相比，mcao模型 乳糖组大鼠无明显的改善作用，表明乳糖溶液对脑卒中没有神经保护作用；与imcao模型组相比，mcao模型 e.coli nissle 1917组和mcao模型 pet
‑
28a
‑
egfp组对脑卒中大鼠的神经功能和脑梗死体积无改善作用，表明大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917原菌和含pet
‑
28a
‑
egfp的益生菌对脑卒中无神经保护作用；同时，与mcao模型组相比，mcao模型 阳性药组和mcao模型 pet
‑
28a
‑
pgk1组均能显著的降低神经功能缺损评分(
**
p<0.01)，改善梗死灶(
***
p<0.001)，表明表达pgk1的重组大肠埃希菌
(escherichia coli)nissle 1917原菌益生菌和丁苯酞一样具有脑卒中的神经保护作用，且表达pgk1的重组大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917原菌益生菌的神经保护作用(66.03％)显著强于临床用药丁苯酞的神经保护作用(45.08％)。上述结果表明，本发明所述表达pgk1的重组大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917原菌益生菌具备更佳的治疗缺血性脑卒中神经损伤的作用，即pgk1蛋白及表达pgk1蛋白的重组益生菌均具有预防或治疗脑卒中的作用，为脑卒中的治疗提供新策略。
[0100]
脑中风与心脑血管疾病有千丝万缕的关系，密不可分；脑中风又分为脑出血和脑梗死，脑梗就是我们常说的缺血性脑卒中，是由于各种原因导致患者的血液循环障碍，出现急性神经功能缺损的症状，患者往往会出现眼前发黑、头晕、头痛、心慌、手足软弱无力等症状。造成脑梗的原因主要包括心脑动脉血管的动脉粥样硬化。心脏疾病是脑梗的主要原因，比如发作性房颤或持续性房颤、风湿性的心脏瓣膜疾病，心律失常，左心肥厚，心肌梗死等，容易形成附壁血栓。当患者有心力衰竭或房颤的时候，腹壁的血栓脱落，容易造成患者脑栓塞。无论是出血性脑卒中还是缺血性脑卒中，高血压是最主要的独立诱发因素，在长期高血压情况下，会导致患者的大脑动脉粥样硬化，形成血管的弹性降低，从而诱发患者脑梗。同时血液流变学紊乱，特别是全血黏度增加时脑血流量下降，其中红细胞比积增高和纤维蛋白原水平增高是缺血性中风的主要诱发因素。从机理上来讲，缺血性脑卒中和心脏疾病均是由于血管堵塞引起缺血缺氧，使得细胞无法及时获得能量，最终导致细胞死亡而引发相关疾病。因此，可以推论出，本发明所述的表达pgk1的重组益生菌对其他心血管疾病，尤其是各类脑卒中均具有良好的治疗效果。因此，我们认为对缺血性脑卒中有效的治疗药物，对心脑血管疾病同样有效。
[0101]
实施例3表达pgk1的重组益生菌对糖尿病小鼠的治疗效果
[0102]
1.c57bl/6n糖尿病小鼠模型建立
[0103]
spf级健康雄性c57bl/6n小鼠，体重18
‑
22g。
[0104]
将60只c57bl/6n小鼠随机分成三组：
[0105]
普通饲料组：sd组，8只c57bl/6n小鼠。用普通饲料喂养三周后，腹腔注射柠檬酸缓冲溶液(注射剂量同下述stz溶液)，注射柠檬酸缓冲溶液之前禁食不禁水12h，按照同一时间段9:00am
‑
10:00am进行注射，每天一次，连续注射五天，注射完柠檬酸缓冲溶液2h后再喂食。然后用普通饲料再喂养三周后禁食不禁水10h，在7:30pm
‑
9:00pm之间检测小鼠空腹血糖。
[0106]
2型糖尿病模型组：高脂饲料 链脲菌素组，hfd stz，52只。用高脂饲料喂养三周后，按60mg/kg的剂量腹腔注射stz溶液(stz溶解在柠檬酸缓冲溶液中，将其配制成浓度为5％的溶液)。注射stz溶液之前禁食不禁水12h，按照同一时间段9:00am
‑
10:00am进行注射，每天一次，连续注射五天，注射完stz溶液2h后再喂食，保证新配制的stz溶液30min内注射完毕。然后用高脂饲料再喂养三周后禁食不禁水10h，在7:30pm
‑
9:00pm之间检测小鼠的空腹血糖，当hfd stz组小鼠的空腹血糖>7.0mmol/l时，可认为2型糖尿病模型成功。将hfd stz组中空腹血糖>7.0mmol/l的小鼠挑出来，共挑出32只鼠作为2型糖尿病模型小鼠，实验正式开始后，所有小鼠均用普通饲料喂养。
[0107]
对挑选出来的32只和8只正常小鼠进行分组，共分为5组，每组8只，具体分组及给药情况如下：
[0108]
sd组：灌胃0.25ml生理盐水；
[0109]
model组：灌胃0.25ml生理盐水；
[0110]
model met组：灌胃0.25ml200mg/kg盐酸二甲双胍；
[0111]
model pet
‑
28a
‑
egfp组：灌胃0.25ml含pet
‑
28a
‑
egfp的重组大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917益生菌菌液；
[0112]
model pet
‑
28a
‑
pgk1组：灌胃0.25ml含pet
‑
28a
‑
pgk1的重组大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917益生菌菌液；
[0113]
所有小鼠给药每天进行一次，共给药3周，给药期间，观察小鼠的生长及生活情况，每周检测小鼠的体重和血糖变化。
[0114]
2.体重及空腹血糖检测
[0115]
给药前及给药后，每周禁食不禁水12h后，同一时间段(7:30pm
‑
9:00pm)监测体重和空腹血糖，用天平称重，记录体重值；剪尾适量取血，用血糖仪测定血糖含量(葡萄糖氧化酶法)，读取记录血糖值。
[0116]
3.数据处理
[0117]
实验数据采用spss23.0软件进行统计学分析，数据以(x
±
s)表示，组间比较采用单因素方差分析(one
‑
way anova)和lsd
‑
t法进行两两比较。p<0.05认为具有统计学意义。
[0118]
4.实验结果
[0119]
如图5所示，sd组小鼠的血糖一直维持在正常范围之内(<7mmol/l)；model组小鼠的血糖持续极显著高于sd组(
###
p<0.001)，从第1周治疗开始到第3周，model pet
‑
28a
‑
pgk1组小鼠血糖极显著低于model组(
***
p<0.001)；从血糖变化的实验结果可知，表达pgk1的重组益生菌可以显著降低糖尿病小鼠的血糖，表明表达pgk1蛋白的重组益生菌有降低血糖的作用，即pgk1蛋白具有预防或治疗糖尿病的作用，可用于预防或治疗糖尿病，为糖尿病的治疗提供一种新策略。
[0120]
代谢性疾病是物质代谢过程的紊乱，多为酶或蛋白异常所致，受改变的人体酶约百余种，几乎影响全身各组织、器官的功能。临床上可分为两类：第一类为先天性缺乏，部分有遗传性的染色体异常，范围很广，但发病率不高，例如糖元积存症、家族性高胆固醇血症、家族性高甘油三酯血症、痛风等。第二类是症状代谢紊乱，许多其他系统疾病，可能在某一阶段引起机体的代谢异常，使临床表现和诊断治疗更复杂化，例如肝硬化肝功不全时可能出现低血糖和高血糖、高胰岛血症，肾病晚期可能出现电解质紊乱和低蛋白血症；甲状腺功能减退时经常伴高脂血症，肾上腺糖皮质固醇过多可致负氮平衡等。糖尿病是以高血糖为主要特征的内分泌代谢疾病。其特点是由于胰岛素的绝对或相对不足和靶细胞对胰岛素的敏感性降低，引起碳水化合物、蛋白质、脂肪、电解质和水的代谢紊乱。患者发生严重高血糖时出现典型的“三多一少”症状，多见于1型糖尿病。发生酮症或酮症酸中毒时“三多一少”症状更为明显。疲乏无力、肥胖多见于2型糖尿病，且肥胖是导致糖尿病的一个重要因素。肥胖者一般饮食不规律、爱饮酒、暴饮暴食、爱吃大鱼大肉、缺乏运动。这样会导致胰岛素敏感性下降，出现胰岛素抵抗，引起血糖升高。因此，可以推论出，本发明所述的表达pgk1的重组益生菌对其他代谢性疾病，尤其是各类血糖升高相关疾病均具有良好的治疗效果。
[0121]
需要说明的是，本发明虽然以大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917为益生菌构建了表达pgk1蛋白的重组益生菌，并具有显著的预防和/或治疗脑卒中和糖尿病的
作用，但本发明并不局限于益生菌大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917，在本发明的基础上，构建能够表达pgk1蛋白的其他重组益生菌也能实现预防和/或治疗脑卒中和糖尿病的作用。
[0122]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。