一种鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶的发酵制备方法与流程

1.本发明属于生物学技术领域，尤其涉及一种鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶的发酵制备方法。


背景技术：

2.目前，鸡白痢作为我国农业部要求重点监测的14种动物疫病之一，其病原菌对禽类的危害严重制约着养禽业的发展。鸡场鸡白痢的净化是根除本病的最佳方法。抗生素是防治鸡白痢的传统药物，但由于抗生素的长期广泛使用甚至是滥用导致耐药性日益严重，使得鸡白痢的防治和清除愈加困难。噬菌体及其裂解酶作为新型抗微生物制剂在改善食品、医疗安全等方面被广泛研究和应用，因此筛选鉴定高效鸡白痢沙门菌的噬菌体及其裂解酶，用于鸡白痢的防治和净化具有重要意义。
3.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有制备的鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶裂解效果不佳，抑菌效果不佳，稳定性不好。
4.解决以上问题及缺陷的难度为：鸡白痢沙门菌噬菌体的临床应用有诸多不便，尤其是规模化制备较为困难，使用鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶，不仅可保持活性，还具备可规模化发酵生产的潜力。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶的发酵制备方法。
6.本发明是这样实现的，一种鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶的发酵制备方法，所述鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶的发酵制备方法包括：
7.步骤一，进行鸡白痢沙门菌、沙门菌噬菌体ysp2的培养，并提取沙门菌噬菌体ysp2基因组；
8.步骤二，以噬菌体ysp2的全基因组为模板，利用引物lysp2
‑
zf/lysp2
‑
zr对裂解酶目的基因lysp2进行pcr扩增；
9.步骤三，进行表达载体p picz
‑
lysp2的构建与鉴定，进行重组毕赤酵母菌株x33
‑
p picz
‑
lysp2的筛选和鉴定；同时进行重组毕赤酵母菌x33
‑
ppicz
‑
lysp2的诱导发酵及条件优化。
10.进一步，步骤一中，所述进行鸡白痢沙门菌、沙门菌噬菌体ysp2的培养包括：
11.所述进行鸡白痢沙门菌的培养包括：
12.接种环挑取鸡白痢沙门菌于lb平板上划线，37℃过夜培养；选取单菌落接种至lb液体培养基中，37℃、160r/min震荡培养至菌浓度为108cfu/ml；
13.所述进行沙门菌噬菌体ysp2的培养包括：
14.挑取宿主菌接种于5ml的lb液体培养基中，37℃，160r/min震荡培养至od600为0.6；加入100μl噬菌体液，37℃，160r/min震荡培养至培养液清亮透明；用0.22μm微孔滤膜
过滤培养液，收集滤液，加入30％甘油分装至1.5ml离心管中，
‑
4℃、
‑
80℃分别保存。
15.进一步，步骤一中，所述进行沙门菌噬菌体ysp2基因组的提取包括：
16.在1.5ml离心管中分别加入20μl proteinase k和200μl样品混匀；加入200μlbb，涡旋震荡15s后，56℃孵育15min；加入250μl无水乙醇，涡旋震荡15s，室温静置5min；10000r/min离心1min，弃废液；加入500μl wb，10000r/min离心1min弃废液，重复一次；10000r/min离心1min待晾干，转移至新的1.5ml rnase
‑
free离心管中；加入20μl无菌水，室温10000r/min离心1min洗脱收集dna，
‑
20℃保存备用。
17.进一步，步骤二中，所述引物lysp2
‑
zf/lysp2
‑
zr根据鸡白痢沙门菌噬菌体ysp2裂解酶ly sp2基因的序列设计，通过于5’端和3’端插入限制性内切酶xho i和xba i的酶切位点得到，用于进行裂解酶lysp2基因的克隆及真核表达载体的构建；
18.所述引物lysp2
‑
zf/lysp2
‑
zr理论扩增片段大小为495bp；引物lysp2
‑
zf序列如seq id no：1所示；引物lysp2
‑
zr序列如seq id no：2所示。
19.进一步，步骤三中，所述进行表达载体p picz
‑
lysp2的构建与鉴定包括：
20.(1)双酶切酵母表达载体p picz
‑
αa，利用t4 dna连接酶将载体与lysp2基因片段连接；连接产物转化到感受态dh5α中，筛选阳性转化子并提取质粒，进行pcr和测序鉴定。
21.(2)挑转化的单菌落到5ml含zeocin 低盐lb培养基中，37℃培养6
‑
8小时，以菌液为模板进行pcr鉴定，鉴定所用引物为p picz
‑
αa载体上通用引物5’aox和目的基因下游引物lysp2
‑
zr，利用pcr mix体系进行扩增；
22.(3)提取质粒，双酶切鉴定，1％凝胶电泳鉴定，阳性质粒，进行测序，对测序结果进行比对分析，检测是否存在碱基的突变和移码。
23.进一步，步骤(2)中，所述pcr扩增程序如下：94℃预变性10min 1个循环；94℃预变性30s，63℃退火35s，72℃延伸40s，反应29个循环；72℃延伸10min，4℃ 10min。
24.进一步，步骤三中，所述进行重组毕赤酵母菌株x33
‑
p picz
‑
lysp2的筛选和鉴定包括：
25.挑单菌落至含zeocin 的ypd培养基中，29℃培养12h；取菌液1ml加入1.5ml离心管中，8000r/min离心5min收集菌体；50μl的ph值8.0的ddh2o溶解dna，
‑
20℃保存备用；pcr鉴定正确的阳性重组酵母菌株命名为x33
‑
p picz
‑
lysp2和空载酵母菌株x33
‑
p picz。
26.进一步，步骤三中，所述进行重组毕赤酵母菌x33
‑
p picz
‑
lysp2的诱导发酵及条件优化包括：
27.1)在转化的含zeocin 的ypd平板上挑取经酵母菌落pcr鉴定为阳性的转化子接种到25ml bmgy液体培养基中；
28.2)于29℃，350r/min，震荡培养至od600为2.0；收集部分培养液在室温6000r/min离心5min，弃上清液并用无菌的pbs洗涤菌体2次；
29.3)转移菌体至50mlbmmy培养基中，控制起始od600＝1.0，29℃，350r/min震荡培养72
‑
96h，并每隔12h补加1％甲醇至培养基，每隔24h取样分析菌体生长情况筛选高表达菌株。
30.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明构建了重组裂解酶lysp2基因的毕赤酵母表达菌株x33
‑
p picz
‑
lysp2，利用甲醇诱导可分泌表达有抑菌活性的重组裂解酶lysp2，对其抑菌圈直径可达30.15mm，表达量可达238.76μg/ml。
31.本发明的重组裂解酶lysp2的热稳定性良好，对酸碱耐受范围广。在ph值3
‑
9条件下作用30min，酶活均保持在85％以上，在4℃
‑
40℃温度条件下作用30min，酶活力基本无损失，具有较好的应用前景。
32.本发明的重组裂解酶lysp2不仅对沙门菌具有裂解作用而且对大肠埃希菌也具有裂解活性，比噬菌体ysp2的裂解谱宽。通过体内实验证明，本发明重组裂解酶lysp2对雏鸡鸡白痢沙门菌感染模型的保护率为70％，肝脏沙门菌清除率可达100％，肠道沙门菌清除率可达50％。
附图说明
33.为了更清楚地说明本技术实施例的技术方案，下面将对本技术实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
34.图1是本发明实施例提供的鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶的发酵制备方法流程图。
35.图2是本发明实施例提供的噬菌体全基因组示意图。
36.图3是本发明实施例提供的重组质粒p picz
‑
lysp2的pcr和酶切鉴定结果示意图。
37.图4是本发明实施例提供的发酵产物的活性检测结果示意图。
38.图5是本发明实施例提供的lysp2对雏鸡白痢感染模型的治疗效果示意图。
具体实施方式
39.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
40.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶的发酵制备方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
41.酵母菌x33
‑
p picz
‑
lysp2为学位论文，《》鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶lysp2在毕赤酵母中的表达及其初步应用》张楸杨，2018，吉林大学中的。
42.如图1所示，本发明实施例提供的鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶的发酵制备方法包括以下步骤：
43.s101，进行鸡白痢沙门菌、沙门菌噬菌体ysp2的培养，并提取沙门菌噬菌体ysp2基因组；
44.s102，以噬菌体ysp2的全基因组为模板，利用引物lysp2
‑
zf/lysp2
‑
zr对裂解酶目的基因lysp2进行pcr扩增；
45.s103，进行表达载体p picz
‑
lysp2的构建与鉴定，进行重组毕赤酵母菌株x33
‑
p picz
‑
lysp2的筛选和鉴定；同时进行重组毕赤酵母菌x33
‑
p picz
‑
lysp2的诱导发酵及条件优化。
46.本发明提供的鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶的发酵制备方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶的发酵制备方法仅仅是一个具体实施例而已。
47.步骤s101中，本发明实施例提供的进行鸡白痢沙门菌、沙门菌噬菌体ysp2的培养包括：
48.进行鸡白痢沙门菌的培养包括：
49.接种环挑取鸡白痢沙门菌于lb平板上划线，37℃过夜培养；选取单菌落接种至lb液体培养基中，37℃、160r/min震荡培养至菌浓度为108cfu/ml；
50.进行沙门菌噬菌体ysp2的培养包括：
51.挑取宿主菌接种于5ml的lb液体培养基中，37℃，160r/min震荡培养至od600为0.6；加入100μl噬菌体液，37℃，160r/min震荡培养至培养液清亮透明；用0.22μm微孔滤膜过滤培养液，收集滤液，加入30％甘油分装至1.5ml离心管中，
‑
4℃、
‑
80℃分别保存。
52.步骤s101中，本发明实施例提供的进行沙门菌噬菌体ysp2基因组的提取包括：
53.在1.5ml离心管中分别加入20μl proteinase k和200μl样品混匀；加入200μl bb，涡旋震荡15s后，56℃孵育15min；加入250μl无水乙醇，涡旋震荡15s，室温静置5min；10000r/min离心1min，弃废液；加入500μl wb，10000r/min离心1min弃废液，重复一次；10000r/min离心1min待晾干，转移至新的1.5ml rnase
‑
free离心管中；加入20μl无菌水，室温10000r/min离心1min洗脱收集dna，
‑
20℃保存备用。
54.步骤s102中，本发明实施例提供的引物lysp2
‑
zf/lysp2
‑
zr根据鸡白痢沙门菌噬菌体ysp2裂解酶ly sp2基因的序列设计，通过于5’端和3’端插入限制性内切酶xho i和xba i的酶切位点得到，用于进行裂解酶lysp2基因的克隆及真核表达载体的构建；
55.引物lysp2
‑
zf/lysp2
‑
zr理论扩增片段大小为495bp；
56.引物lysp2
‑
zf序列为seq id no：1：ccgc|tcgagaaaagaatggctattaaaaagacaatagccg
‑3’
所示；
57.引物lysp2
‑
zr序列为seq id no：2：tgct|ctagatcatttattcagatccattacacaa
‑3’
。
58.步骤s103中，本发明实施例提供的进行表达载体p picz
‑
lysp2的构建与鉴定包括：
59.(1)双酶切酵母表达载体p picz
‑
αa，利用t4 dna连接酶将载体与lysp2基因片段连接；连接产物转化到感受态dh5α中，筛选阳性转化子并提取质粒，进行pcr和测序鉴定。
60.(2)挑转化的单菌落到5ml含zeocin 低盐lb培养基中，37℃培养6
‑
8小时，以菌液为模板进行pcr鉴定，鉴定所用引物为p picz
‑
αa载体上通用引物5’aox和目的基因下游引物lysp2
‑
zr，利用pcr mix体系进行扩增；
61.(3)提取质粒，双酶切鉴定，1％凝胶电泳鉴定，阳性质粒，进行测序，对测序结果进行比对分析，检测是否存在碱基的突变和移码。
62.步骤(2)中，本发明实施例提供的pcr扩增程序如下：94℃预变性10min 1个循环；94℃预变性30s，63℃退火35s，72℃延伸40s，反应29个循环；72℃延伸10min，4℃ 10min。
63.步骤s103中，本发明实施例提供的进行重组毕赤酵母菌株x33
‑
p picz
‑
lysp2的筛选和鉴定包括：
64.挑单菌落至含zeocin 的ypd培养基中，29℃培养12h；取菌液1ml加入1.5ml离心管中，8000r/min离心5min收集菌体；50μl的ph值8.0的ddh2o溶解dna，
‑
20℃保存备用；pcr鉴定正确的阳性重组酵母菌株命名为x33
‑
p picz
‑
lysp2和空载酵母菌株x33
‑
p picz。
65.步骤s103中，本发明实施例提供的进行重组毕赤酵母菌x33
‑
p picz
‑
lysp2的诱导
发酵及条件优化包括：
66.1)在转化的含zeocin 的ypd平板上挑取经酵母菌落pcr鉴定为阳性的转化子接种到25ml bmgy液体培养基中；
67.2)于29℃，350r/min，震荡培养至od600为2.0；收集部分培养液在室温6000r/min离心5min，弃上清液并用无菌的pbs洗涤菌体2次；
68.3)转移菌体至50ml bmmy培养基中，控制起始od600＝1.0，29℃，350r/min震荡培养72
‑
96h，并每隔12h补加1％甲醇至培养基，每隔24h取样分析菌体生长情况筛选高表达菌株。
69.下面结合具体实施例对本发明的技术效果作进一步描述。
70.实施例1：
71.一、材料
72.限制性内切酶xho i、xba i、sca i、dna marker 15,000、dna marker 5000、dna marker 2000、10
×
loading buffer、r taq酶均购自日本takara公司；tris、sds、β
‑
mercaptoethanol、过硫酸铵、temed均购自美国amresco公司；zeocin抗生素购自美国；蛋白marker(180、130、95、72、55、43、34、26、17、10)购自thermo；琼脂糖凝胶dna回收试剂盒、质粒小提试剂盒、pcr产物纯化回收试剂盒、酵母菌基因组dna提取试剂盒、病毒dna/rna提取试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。
73.根据鸡白痢沙门菌噬菌体ysp2裂解酶ly sp2基因的序列，设计一对引物命名为ly sp2
‑
zf和lysp2
‑
zr，分别在5’端和3’端插入限制性内切酶xho i和xba i的酶切位点，用于裂解酶lysp2基因的克隆及真核表达载体的构建，理论扩增片段大小为495bp，引物序列如下：
74.ly sp2
‑
zf:5
’–
ccgc|tcgagaaaagaatggctattaaaaagacaatagccg
‑3’
75.xho i
76.lysp2
‑
zr:5
’‑
tgct|ctagatcatttattcagatccattacacaa
‑3’
77.xba i
78.二、方法
79.1、鸡白痢沙门菌的培养
80.接种环挑取鸡白痢沙门菌于lb平板上划线，37℃过夜培养。选取单菌落接种至lb液体培养基中，37℃、160r/min震荡培养至菌浓度为108cfu/ml。
81.2、沙门菌噬菌体ysp2的培养
82.挑取宿主菌接种于5ml lb液体培养基中，37℃，160r/min震荡培养至od600为0.6。加入100μl噬菌体液，37℃，160r/min震荡培养至培养液清亮透明。用0.22μm微孔滤膜过滤培养液，收集滤液，加入30％甘油分装至1.5ml离心管中，
‑
4℃、
‑
80℃分别保存。
83.3、沙门菌噬菌体ysp2基因组的提取
84.在1.5ml离心管中分别加入20μl proteinase k和200μl样品混匀；加入200μl bb，涡旋震荡15s后，56℃孵育15min；加入250μl无水乙醇，涡旋震荡15s，室温静置5min；10000r/min离心1min，弃废液；加入500μl wb，10000r/min离心1min弃废液，重复一次；10000r/min离心1min待晾干，转移至新的1.5ml rnase
‑
free离心管中；加入20μl无菌水，室温10000r/min离心1min洗脱收集dna，
‑
20℃保存备用。
85.4、裂解酶ly sp2基因的pcr扩增
86.以噬菌体ysp2的全基因组为模板，利用引物lysp2
‑
zf/lysp2
‑
zr进行pcr扩增目的基因lysp2扩增。
87.5、表达载体p picz
‑
lysp2的构建与鉴定
88.双酶切酵母表达载体p picz
‑
αa，利用t4 dna连接酶将载体与lysp2基因片段连接。连接产物转化到感受态dh5α中，筛选阳性转化子并提取质粒，进行pcr和测序鉴定。
89.挑转化的单菌落到5ml含zeocin 低盐lb培养基中，37℃培养6
‑
8小时，以菌液为模板进行pcr鉴定以降低假阳性率，鉴定所用引物为p picz
‑
αa载体上通用引物5’aox和目的基因下游引物lysp2
‑
zr，利用pcr mix体系进行扩增。
90.pcr扩增程序如下：94℃预变性10min 1个循环；94℃预变性30s，63℃退火35s，72℃延伸40s，反应29个循环；72℃延伸10min，4℃ 10min。
91.提取质粒，双酶切鉴定，1％凝胶电泳鉴定。阳性质粒，送库美生物科技有限公司测序，对测序结果进行比对分析，检测是否存在碱基的突变和移码。
92.6、重组毕赤酵母菌株x33
‑
p picz
‑
lysp2的筛选和鉴定
93.挑单菌落至含zeocin 的ypd培养基中，29℃培养12h；取菌液1ml加入1.5ml离心管中，8 000r/min离心5min收集菌体；具体操作见酵母菌基因组提取试剂盒说明书，50μl ddh2o(ph值8.0)溶解dna，
‑
20℃保存备用；pcr鉴定正确的阳性重组酵母菌株命名为x33
‑
p picz
‑
lysp2和空载酵母菌株x33
‑
p picz。
94.7、重组毕赤酵母菌x33
‑
p picz
‑
lysp2的诱导发酵及条件优化
95.在转化的含zeocin 的ypd平板上挑取经酵母菌落pcr鉴定为阳性的转化子接种到25ml bmgy液体培养基中(250ml锥形瓶装液量为25ml)，29℃，350r/min，震荡培养至od600为2.0；收集部分培养液在室温6000r/min离心5min，弃上清液并用无菌的pbs洗涤菌体2次，以完全去除甘油；转移菌体至50ml bmmy培养基中(500ml锥形瓶装液量为50ml)，控制起始od600＝1.0，29℃，350r/min震荡培养72
‑
96h，并每隔12h补加1％甲醇至培养基以持续诱导菌体产酶，每隔24h取样分析菌体生长情况筛选高表达菌株。
96.三、结果
97.1、噬菌体ysp2全基因组提取结果
98.如图2为提取的鸡白痢沙门菌噬菌体ysp2全基因组的凝胶电泳结果。
99.2、重组质粒p piczαa
‑
lysp2的鉴定
100.重组质粒p piczαa
‑
lysp2经xho i、xba i双酶切，理论片段大小为3518bp和495bp，图3泳道3表明条带大小符合预期。对重组质粒进行pcr扩增，理论片段为495bp，图3泳道4表明条带大小符合预期。
101.3、发酵产物的活性鉴定
102.经摇瓶诱导x33
‑
p picz
‑
lysp2重组菌株和x33
‑
p picz对照菌株，取100μl发酵产物加入凝胶孔中。如图4所示，x33
‑
ppicz
‑
lysp2重组酵母发酵产物能有效裂解鸡白痢沙门菌分离株，而x33
‑
p picz对照菌株发酵产物无裂解作用。
103.4重组裂解酶在鸡白痢感染雏鸡模型中的疗效
104.经60μg/ml裂解酶及1010pfu/ml噬菌体治疗的雏鸡存活率可以达到70％，空白对照组和空载酵母菌表达组存活率低于30％。
105.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。