一种提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种提高人源溶菌酶产量及酶活的 毕赤酵母缺陷型菌株。


背景技术：

2.溶菌酶由于其抗菌性、抗病毒、提高免疫力等特性而作为一种新型抗菌肽 受到了广泛关注。与传统的抗生素不同，溶菌酶可以水解细菌细胞壁的β
‑
1，4 糖苷键，破坏细胞壁的结构使细菌溶解死亡，因此不必担心细菌的耐受性问题。 并且溶菌酶能够有效杀死微生物而保护自身不受损伤，因此在畜牧业、食品产 业、临床医学等方面广泛应用。也引起世界卫生组织、粮食农业组织的关注。
3.溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或n
‑
乙酰胞壁质聚糖水 解酶(n
‑
acetylmuramide glycanohydrlase)，是一种能水解细菌中黏多糖的碱性酶。 溶菌酶可分为c型、g型和p型。人源溶菌酶属于c型溶菌酶，由130个 氨基酸组成，其相对分子量为14700。相比其他类型溶菌酶。人源溶菌酶具有 酶活力高、热稳定性高等优点，并且是人体内源蛋白质。而由于原料来源和纯 化成本等原因，人源溶菌酶的制备量无法满足各领域的需求。目前存在多种利 用真核或原核宿主生产人源溶菌酶的方式，但是在酶活和产量上属于不能让人 满意的状态。


技术实现要素：

4.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较 佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或 省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略 不能用于限制本发明的范围。
5.鉴于上述和/或现有溶菌酶生产方法中存在的问题，提出了本发明。
6.因此，本发明其中一个目的是，克服现有溶菌酶生产方法的不足，提供一种提 高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株。
7.为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方 案：一种提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株，其特征在于：包 括如下步骤：
8.构建质粒：选择目标基因插入到毕赤酵母分泌型质粒中，构建出带有目标 基因的目标质粒。
9.出发菌株构建：将目标质粒电转化到毕赤酵母中，筛选高拷贝菌株作为出 发菌株；
10.敲除质粒构建：设计敲除基因对应的grna和对应的引物，并将grna插 入到质粒中构成缺陷质粒；
11.单敲除菌株构建：提取毕赤酵母基因组，将敲除基因上下游的引物融合在 一起制得donner dna，然后将缺陷质粒和donner dna通过电转化的方式转入 感受态细胞中。
12.阳性克隆子筛选：pcr验证纯化阳性转化子。
13.作为本发明所述提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株的一 种优选方案，其中：还包括如下步骤：选择阳性克隆子筛选中制得的纯化阳性 转化子再经过单敲除菌株构建和阳性克隆子筛选制得双敲除菌株阳性转化子， 其中第一次单敲除菌株构建和第二次单敲除菌株构建中，敲除的基因并不相 同。
14.作为本发明所述提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株的一 种优选方案，其中：第一次单敲除单敲除菌株构建和第二次单敲除菌株构建中， 第一次敲除的基因为vps10
‑
1δ、第二次敲除的基因为vps10
‑
2δ或第一次敲除 的基因vps10
‑
2δ、第二次敲除的基因为vps10
‑
1δ。
15.作为本发明所述提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株的一 种优选方案，其中：质粒为毕赤酵母甲醇诱导分泌型质粒ppic9k。
16.作为本发明所述提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株的一 种优选方案，其中：毕赤酵母为毕赤酵母gs115。
17.作为本发明所述提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株的一 种优选方案，其中：单敲除菌株构建中敲除的基因为vps10
‑
1δ或vps10
‑
2δ。
18.作为本发明所述提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株的一 种优选方案，其中：单敲除菌株构建中敲除的基因为vps10
‑
2δ。
19.作为本发明所述提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株的一 种优选方案，其中：vps10
‑
1δ对应的sgrna
‑
vps10
‑
1序列为 gcaggaggttattacacctg。
20.作为本发明所述提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株的一 种优选方案，其中：vps10
‑
2δ对应的sgrna
‑
vps10
‑
2序列为 gccatcatggtagacaacgc。
21.作为本发明所述提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株的一 种优选方案，其中：电转化为质粒、donner dna与感受态细胞置于电转杯中 静置5min，再通过电转化的方式转入感受态中。
22.本发明提供的技术方案相较目前本技术领域其他技术方案而言，具有如下 优势：
23.本发明直接采用crispr/cas9技术成功敲除了毕赤酵母中的vps10基因， 提供了两株能够大幅度提高人源溶菌酶产量和酶活的毕赤酵母菌株。解决了人 源溶菌酶产量低、需求高的问题。并且该菌株的开发有利于毕赤酵母在工业生 产上的应用，为毕赤酵母作为宿主生产外源蛋白提供了新的思路。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需 要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的 一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下， 还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
25.图1为本发明实施例2和实施例3中基因敲除后菌株的核酸检测图；
26.图中，图a为实施例2制得菌株与原始菌株的对照，图a中vps10
‑
1δ为 实施例2制得vps10
‑
1δ单敲除菌株的琼脂糖凝胶电泳图像，gs115为未进行 敲除操作的原始菌株的琼脂糖凝胶电泳图像，图b为实施例3制得菌株与原始 菌株的对照，图b中vps10
‑
2δ为实施
例3制得vps10
‑
2δ单敲除菌株的琼脂糖 凝胶电泳图像，gs115为未进行敲除操作的原始菌株的琼脂糖凝胶电泳图像；
27.图2为实施例2和实施例3中使用的上下游引物以及dna donor的琼脂 糖凝胶电泳图像；
28.图中，图a为实施例2中使用的上下游引物以及dna donor的琼脂糖凝 胶电泳图像，其中，m为marker，1为上游引物，2为下游引物，3为dna donor， 图b为实施例3中使用的上下游引物以及dna donor的琼脂糖凝胶电泳图像， 其中，m为marker，1为上游引物，2为下游引物，3为dna donor；
29.图3为实施例2、3制得产物与原始菌株的核酸检测图，
30.图中，1为原始菌株，2为实施例2制得vps10
‑
1δ单敲除菌株，3为实施 例3制得vps10
‑
2δ单敲除菌株；
31.图4为实施例2vps10
‑
1δ单敲除菌株、实施例3制得vps10
‑
2δ单敲除菌 株、原始菌株、实施例4制得ps10
‑
1δvps10
‑
2δ双敲除菌株的产物和2wu/ml 的标品以及缓冲液进行抑菌圈实验的图像；
32.图5为实施例2vps10
‑
1δ单敲除菌株、实施例3制得vps10
‑
2δ单敲除菌 株、原始菌株、实施例4制得ps10
‑
1δvps10
‑
2δ双敲除菌株的产物和2wu/ml 的标品以及缓冲液进行抑菌圈实验的图像；
33.图中1为缓冲液样品，2为标品，3为原始菌株产物，4为实施例2vps10
‑
1δ 单敲除菌株、5为实施例3制得vps10
‑
2δ单敲除菌株，6为实施例4制得ps10
‑
1δ vps10
‑
2δ双敲除菌株的产物；图6为实施例中制得的gs115/hlyz、vps10
‑1△
、vps10
‑2△
、vps10
‑1△ꢀ
vps10
‑2△
菌株产生溶菌酶的酶活。
具体实施方式
34.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书 实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
35.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明 还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不 违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例 的限制。
36.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少 一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在 一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施 例互相排斥的实施例。
37.实施例1
38.设计引物f1、r1将密码子优化的人源溶菌酶(hlyz)基因插入到毕赤酵 母甲醇诱导分泌型质粒ppic9k的ecor1和not1酶切位点中，构建出质粒 ppic9k
‑
hlyz。
39.利用sal1酶切位点将上述质粒ppic9k
‑
hlyz线性化后，通过设置电压为 15000v、电阻为200欧姆的电转化将hlyz基因插入毕赤酵母gs115的基因组 中，迅速加入1ml的1m/l的d
‑
山梨醇后置于30℃摇床预培养2h后涂布于md平板上，利用3mg/ml高浓度g418的ypd平板筛选出高拷贝菌株作为出 发菌株gs115/hlyz。
40.目标基因为vps10，vps10基因共两个，分别位于染色体2和染色体3上， 其grna分别为sgrna
‑
vps10
‑
1:gcaggaggttattacacctg和sgrnavps10
‑
2：gccatcatggtagacaacgc，根据上述两个基因设计的四个通用 引物分别为a
‑
sgrna
‑
r、b
‑
sgrna
‑
r、c
‑
sgrna
‑
r、d
‑
sgrna_f和4个特异引 物sgrna
‑
vps10
‑1‑
f/r、sgrna
‑
vps10
‑2‑
f/r，将grna通过bpi1位点插入到 pcas9质粒中，得到pcas9
‑
sgrna
‑
vps10
‑
1、pcas9
‑
sgrna
‑
vps10
‑
2质粒。
41.实施例2
42.提取毕赤酵母gs115基因组，设计引物vps10
‑1‑
上f/r、vps10
‑1‑
下f/r、 将vps10基因上下游各1000bp融合在一起共2000bp作为基因敲除的donnerdna。以gs115/hlyz作为出发菌株，将1ng质粒和5ngdonner dna与80μl 感受态至于电转杯中静置5min，再通过通过设置参数为电压15000v、电阻200 欧姆的电转化的方式转入感受态中。迅速加入1ml的1m/l的d
‑
山梨醇后置 于30℃摇床预培养2h涂布于含有潮霉素的ypd平板上生长2
‑
3天。
43.于目的基因上下游1300bp处设计引物vps10
‑1‑
1300
‑
f/r、利用菌落pcr 的方法初步筛选出阳性克隆子，筛选的标准为利用目的基因上下游1300bp处 作为引物，如果pcr出来2600条带，就是阳性转化子，如果是2600加5400 的目的基因则是失败案例。再提出该单克隆子的基因组，再次用上述引物pcr， 之后将pcr产物送至测序公司测序。最终得到vps10
‑
1δ单敲除菌株。
44.实施例3
45.提取毕赤酵母gs115基因组，设计引物vps10
‑2‑
上f/r、vps10
‑2‑
下f/r 将vps10基因上下游各1000bp融合在一起共2000bp作为基因敲除的donnerdna。以gs115/hlyz作为出发菌株，将1ng质粒和5ng donner dna与80μl 感受态至于电转杯中静置5min，再通过通过设置参数为电压15000v、电阻200 欧姆的电转化的方式转入感受态中。迅速加入1ml的1m/l的d
‑
山梨醇后置 于30℃摇床预培养2h涂布于含有潮霉素的ypd平板上生长2
‑
3天。
46.于目的基因上下游1300bp处设计引物vps10
‑2‑
1300
‑
f/r利用菌落pcr的 方法初步筛选出阳性克隆子，筛选的标准为利用目的基因上下游1300bp处作 为引物，如果pcr出来2600条带，就是阳性转化子，如果是2600加5400的 目的基因则是失败案例。再提出该单克隆子的基因组，再次用上述引物pcr， 之后将pcr产物送至测序公司测序。最终得到vps10
‑
2δ单敲除菌株。
47.实施例4
48.将实施例2中制得的vps10
‑
1δ单敲除菌株于目的基因上下游1300bp处 设计引物vps10
‑2‑
1300
‑
f/r利用菌落pcr的方法初步筛选出阳性克隆子。再 提出该单克隆子的基因组，再次用上述引物pcr，之后将pcr产物送至测序 公司测序。最终得到vps10
‑
2δ单敲除菌株。
49.设计引物vps10
‑
2上f/r、vps10
‑2‑
下f/r将vps10基因上下游各1000bp 融合在一起共2000bp作为基因敲除的donner dna。以gs115/hlyz作为出发 菌株，将1ng质粒和5ngdonner dna与80μl感受态至于电转杯中静置5min， 再通过通过设置参数为电压15000v、电阻200欧姆的电转化的方式转入感受态 中。迅速加入1ml的1m/l的d
‑
山梨醇后置于30℃摇床预培养2h涂布于含 有潮霉素的ypd平板上生长2
‑
3天。
50.于目的基因上下游1300bp处设计引物vps10
‑2‑
1300
‑
f/r利用菌落pcr的 方法初步筛选出阳性克隆子，筛选的标准为利用目的基因上下游1300bp处作 为引物，如果pcr出
来2600条带，就是阳性转化子，如果是2600加5400的 目的基因则是失败案例。再提出该单克隆子的基因组，再次用上述引物pcr， 之后将pcr产物送至测序公司测序。最终得到ps10
‑
1δvps10
‑
2δ双敲除菌株。
51.实施例5
52.将实施例2～3中制得的敲除菌株在基因敲除后测定其核酸，得到的琼脂糖 凝胶电泳图像如图1所示。
53.由图1可得，我方发明中基因敲除后的核酸相较原始的gs115基因减少， 我方发明中采用的基因敲除手段为切实可靠的基因敲除手段，敲除前的基因为 10000bp，两次单敲除的结果均出现了基因大小减小的趋势。
54.将实施例2～3中设计的引物进行琼脂糖凝胶电泳，得到的图像如图2所示， 可以确定基因上下游的引物均为1000bp大小，上下游引物能够相连，相连后 的大小为2000bp
55.将原始菌株与实施例2～3中制得的单敲除菌株进行核酸检测，得到的图像 如图3所示，图3a中因为边缘效应，可以模糊的推断实施例2、实施例3与原 始菌株的核酸序列是相同的，在图3b中可以清楚地表明我方发明中实施例2、 3制得的单敲除菌株与原始菌株具有相同的核酸序列。
56.实施例6
57.将实施例2、3、4中制得的基因敲除菌株与原始菌株进行培养，在ypd 培养基中培养12h，转接至bmgy培养基中培养24h至od600为15，在重悬 至bmgy中，每12h加入0.5％的甲醇，在通过抑菌圈实验并在抑菌圈实验中 添加标品和原始菌株产物作为对照并判断各实施例制得菌株的对应产物的酶 活，抑菌圈实验的结果如图4和图5所示。
58.由图4和图5可得，图中实施例3制得单敲除菌株的抑菌圈最大，实施例 2制得单敲除菌株的抑菌圈第二大，标品第三，原始菌株第四，双敲除第五， 缓冲液作为的对照组无抑菌圈。
59.将实施例2、3、4中制得的基因敲除菌株与原始菌株测定其产物的酶活， 酶活的测定方法如下：将溶壁微球菌重悬于磷酸缓冲液中，并且od450等于 0.7，上述菌悬液2.9毫升，加入0.1毫升稀释过后的发酵液。每降低0.001为 1u酶活，得到的结果记录在图6中。
60.由图6中数据可得，gs115/hlyz为原始菌株酶活为16400u，实施例2制 得单敲除菌株的酶活为36400u，实施例3制得单敲除菌株的酶活为39300u， 实施例4制得双敲除菌株的酶活为4950，实施例2、3中的单敲除方法对于产 物的酶活有着明显的提升效果，其中实施例3产物的酶活最高。
61.应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参 照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可 以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精 神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。