从FFPE样本中快速提取核酸的试剂、试剂盒及其应用的制作方法

技术特征：
1.一种从ffpe样本中快速提取核酸的试剂，其特征在于：所述试剂包括结合缓冲液，所述结合缓冲液包括以下组分：胍盐1
‑
5m，吐温系列表面活性剂0.1
‑
2％(v/v)，聚乙二醇辛基苯基醚1
‑
5％(v/v)，乙二胺四乙酸10
‑
40mm，tris
‑
hcl 20
‑
60mm，ph值为8.0
‑
9.5。2.根据权利要求1所述的从ffpe样本中快速提取核酸的试剂，其特征在于：所述胍盐为盐酸胍、硝酸胍、异硫氰酸胍中的一种或多种；进一步优选地，所述胍盐为盐酸胍或异硫氰酸胍；和/或，所述吐温系列表面活性剂选自吐温20、吐温40、吐温60、吐温80中的一种或多种；进一步优选地，所述吐温系列表面活性剂为吐温20或吐温40；和/或，所述结合缓冲液中还包括聚乙二醇，分子量为2000
‑
10000，浓度为0.1
‑
2％(w/v)；进一步优选地，所述聚乙二醇的分子量为6000
‑
8000；和/或，所述结合缓冲液中还包括十二烷基硫酸根离子沉淀剂，选自可溶性钾盐、铷盐、铯盐、钙盐、锶盐、钡盐中的一种或多种；进一步优选为钾盐或锶盐；所述钾盐为氯化钾、硫酸钾、乙酸钾中的一种或多种，优选为氯化钾或乙酸钾；所述锶盐为氯化锶、乙酸锶中的一种或多种，优选为氯化锶。3.根据权利要求2所述的从ffpe样本中快速提取核酸的试剂，其特征在于：所述结合缓冲液包括以下组分：盐酸胍或异硫氰酸胍1
‑
4m，氯化钾或氯化锶0.1
‑
0.5m，吐温20或吐温40 0.1
‑
1％(v/v)，聚乙二醇辛基苯基醚1
‑
4％(v/v)，乙二胺四乙酸10
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40mm，聚乙二醇6000
‑
8000 0.1
‑
2％，氯化钾或氯化锶0.1
‑
2m，tris
‑
hcl 20
‑
60mm，ph值为8.5
‑
9.5；进一步优选地，所述结合缓冲液包括以下组分：盐酸胍或异硫氰酸胍1
‑
4m，氯化锶0.1
‑
0.5m，吐温20 0.1
‑
1％(v/v)，聚乙二醇辛基苯基醚1
‑
4％(v/v)，乙二胺四乙酸10
‑
40mm，聚乙二醇6000或聚乙二醇8000 0.1
‑
2％，氯化锶0.1
‑
2m，tris
‑
hcl 20
‑
60mm，ph值为8.5
‑
9.5。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的从ffpe样本中快速提取核酸的试剂，其特征在于：所述试剂还包括磁珠和/或核酸助沉剂，所述磁珠选自硅羟基磁珠、羧基修饰磁珠中的任意一种，表面无孔或多孔；所述核酸助沉剂选自c1
‑
c5的一元醇、c1
‑
c9的多元醇中的一种或多种；所述c1
‑
c5的一元醇选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、戊醇中的一种或多种，优选为乙醇或异丙醇；所述c1
‑
c9的多元醇选自2
‑
甲基
‑
1,3
‑
丙二醇、2,3
‑
丁二醇、1,2
‑
丙二醇、三丙二醇中的一种或多种，优选为2
‑
甲基
‑
1,3
‑
丙二醇。5.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的从ffpe样本中快速提取核酸的试剂，其特征在于：所述试剂还包括脱蜡剂、裂解缓冲液、蛋白酶、甲醛清除剂、解交联试剂、漂洗缓冲液、洗脱缓冲液中的一种或多种；所述脱蜡剂选自萜烯油、矿物油、c7
‑
c10的直链/支链烷烃或其混合物、柠檬精油、6
‑
溴己基乙酸酯、c10
‑
c16的直链/支链/环状烷烃或其混合物、聚有机硅氧烷脱蜡剂中的一种或多种；所述裂解缓冲液包括以下组分：十二烷基硫酸根离子源的阴离子型表面活性剂、缓冲物质和硫酸，所述硫酸用于调节裂解缓冲液的ph值为7.5
‑
10.0；所述十二烷基硫酸根离子源的阴离子型表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸铵、十二烷基硫酸锂中的一种或多种，优选为十二烷基硫酸钠；所述缓冲物质为tris、hepes、hpps、mops、mes中的任意一种，优选为tris；所述甲醛清除剂选自己二酸二酰肼、琥珀酸二酰肼中的一种或多种；
所述解交联试剂选自乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、2
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氨基
‑
1,3
‑
丙二醇、氨基胍中的一种或多种；所述洗涤缓冲液中包括胍盐和有机溶剂，所述胍盐选自盐酸胍、硝酸胍、异硫氰酸胍中的一种或多种，优选为盐酸胍或异硫氰酸胍；所述有机溶剂选自c1
‑
c5的一元醇、c1
‑
c9的多元醇中的一种或多种；所述c1
‑
c5的一元醇选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、戊醇中的一种或多种，优选为乙醇或异丙醇；所述c1
‑
c9的多元醇选自2
‑
甲基
‑
1,3
‑
丙二醇、2,3
‑
丁二醇、1,2
‑
丙二醇、三丙二醇中的一种或多种，优选为2
‑
甲基
‑
1,3
‑
丙二醇；所述洗脱缓冲液包括缓冲物质和/或络合剂，所述缓冲物质为tris、hepes、hpps、mops、mes中的任意一种，优选为tris；所述络合剂选自乙二胺四乙酸、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、乙二胺二琥珀酸、氨基三乙酸、葡萄糖酸、异抗坏血酸、酒石酸、柠檬酸、亚氨基二琥珀酸、三乙醇胺中的一种或多种；优选为乙二胺四乙酸。6.根据权利要求5所述的从ffpe样本中快速提取核酸的试剂，其特征在于：所述裂解缓冲液包括以下组分：十二烷基硫酸钠10
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50mm，吐温20或吐温40 0.1
‑
1％(v/v)，tris
‑
h2so
4 10
‑
50mm，ph值为7.5
‑
10.0；和/或，所述洗涤缓冲液包括洗涤缓冲液i和洗涤缓冲液ii，所述洗涤缓冲液i包括以下组分：胍盐1mm
‑
5m，tris
‑
hcl 10
‑
60mm，乙醇或异丙醇40
‑
80％(v/v)，ph值为4.0
‑
8.0；所述洗涤缓冲液ii包括以下组分：tris
‑
hcl 10
‑
60mm，乙醇或异丙醇60
‑
90％(v/v)，ph值为7.0
‑
10.0，余量为水；和/或，所述洗脱缓冲液为te缓冲液，组成为：tris
‑
hcl 10mm，乙二胺四乙酸1mm，ph值为8.0
‑
9.5。7.一种从ffpe样本中快速提取核酸的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括至少一个容器，所述容器中包含如权利要求1
‑
3中任一项所述的结合缓冲液。8.根据权利要求7所述的从ffpe样本中快速提取核酸的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括以下一个或多个容器：(a)包含磁珠的容器；(b)包含核酸助沉剂的容器；(c)包含脱蜡剂的容器；(d)包含裂解缓冲液的容器；(e)包含蛋白酶的容器；(f)包含甲醛清除剂的容器；(g)包含解交联试剂的容器；(h)包含洗涤缓冲液的容器；(i)包含洗脱缓冲液的容器。9.一种如权利要求1
‑
6中任一项所述的从ffpe样本中快速提取核酸的试剂，或者如权利要求7
‑
8中任一项所述的从ffpe样本中快速提取核酸的试剂盒在核酸提取中的应用；优选地，所述应用包括：在结合缓冲液、核酸助沉剂存在下，使包含核酸的生物材料与磁珠接触，将核酸结合在磁珠上，之后磁分离出结合有核酸的磁珠；进一步优选地，所述结合在10
‑
75℃下进行，优选为36
‑
75℃，更优选为50
‑
65℃，最优选为56℃；所述结合的时间为10s
‑
30min，优选为5
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15min，更优选为10min。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述包含核酸的生物材料在与磁珠结合之前，选择性进行脱蜡、裂解/消化、和/或解交联处理；所述脱蜡处理为：使ffpe样本与脱蜡剂接触，孵育后得到含有脱蜡剂的混合物；当脱蜡剂为c10
‑
c16的直链、支链或环状烷烃或其混合物时，所述孵育在25
‑
85℃下进行，孵育的时间为10s
‑
30min；所述裂解/消化处理为：在含有脱蜡剂的混合物中加入裂解缓冲液、蛋白酶进行孵育，得到多相混合物；所述裂解/消化时的孵育在45
‑
70℃下进行，优选为50
‑
68℃，更优选为56
‑
62℃；所述孵育的时间为10
‑
80min，优选为30
‑
80min，更优选为40
‑
60min；优选地，在孵育之前、孵育的同时或孵育后，加入甲醛清除剂进行处理；所述解交联处理为：将孵育得到的多相混合物加热到85
‑
95℃处理0.5
‑
2h；进一步优选地，加热到90
‑
95℃处理1h；或者，在解交联试剂存在下，将多相混合物加热到65
‑
85℃处理一段时间；和/或，所述包含核酸的生物材料在与磁珠结合之后，选择性进行洗涤、和/或洗脱处理；所述洗涤处理为：在结合有核酸的磁珠中加入洗涤缓冲液，重悬磁珠，之后磁分离出结合有核酸的磁珠；优选地，在洗涤之后、洗脱处理之前，将最后一次洗涤得到的结合有核酸的磁珠在开放环境中晾干；优选在常温下晾干1
‑
15min，优选5
‑
10min；所述洗脱处理为：在洗涤得到的结合有核酸的磁珠中加入洗脱缓冲液，重悬磁珠并孵育一段时间，使磁珠上结合的核酸释放到洗脱缓冲液中，再磁分离磁珠，得到包含核酸的溶液；所述洗脱时的孵育在20
‑
80℃下进行，优选为50
‑
80℃，更优选为55
‑
70℃；所述孵育的时间为1
‑
20min，优选为5
‑
15min。

技术总结
本发明属于分子生物学技术领域，具体公开了一种从FFPE样本中快速提取核酸的试剂、试剂盒及其应用。本发明的试剂中结合缓冲液的配方简单，成本低廉，可以显著提高核酸与磁珠的结合效果，增加核酸的结合量。本发明将特定组成的裂解缓冲液、结合缓冲液和洗涤缓冲液组合使用，先充分裂解组织细胞，消化与核酸结合的蛋白质，完全释放出核酸，再将释放出的核酸特异性地结合到磁珠上，增大核酸的结合量，实现核酸与其他裂解物的有效分离，之后多次洗涤结合有核酸的磁珠，彻底去除蛋白质、脂质等杂质，最后从磁珠上洗脱核酸，得到高纯度、高收率的核酸。本发明的试剂/试剂盒组成简单，成本低廉，便于核酸提取操作，可以大幅度缩短提取时间。可以大幅度缩短提取时间。可以大幅度缩短提取时间。


技术研发人员：崔国鹏 董超 张银 张晓亮 杨增利
受保护的技术使用者：郑州安图生物工程股份有限公司
技术研发日：2021.09.06
技术公布日：2021/11/2