一种酿酒酵母培养物及其应用的制作方法

1.本发明涉及动物饲料添加剂生产技术领域，具体涉及一种酿酒酵母培养物及其应用。


背景技术：

2.在高度集约化的现代养殖模式下，动物每天承受外部环境、病原菌、社群等压力，使动物长期呈现出一种高度应激的状态，而由此带来的动物健康隐患、动物产品品质及环境污染问题日益突出。因此，结合我国畜牧业发展的形式，开发纯天然、无药物残留、安全的饲料添加剂，以提升动物自身免疫功能、保障养殖动物的健康与防控畜禽常见疾病显得尤为迫切。
3.大肠杆菌是一种常见的革兰氏阴性菌，广泛存在于土壤、空气和动物消化道中。致病性大肠杆菌可以感染所有类型、所有年龄段的动物，它主要是通过细胞膜破碎释放脂多糖刺激粘膜，伤害机体。大肠杆菌或脂多糖是常用的建立机体免疫或氧化应激模型的试验材料，高剂量的致病性大肠杆菌攻毒会导致严重的大肠杆菌病，引发动物机体免疫应答，严重危害脏器，低剂量的致病性大肠杆菌攻毒会造成动物的免疫应激，降低生产性能，威胁机体健康。兽医一般会使用青霉素类、头孢菌素类药物以及β
‑
内酰胺酶抑制剂来治疗禽畜体内的大肠杆菌。但随着人们对食品安全的要求越来越高，很多国家要求不能在禽畜肉制品中检出抗生素一类的药物，或者抗生素含量必须控制在一定水平下。使用抗生素类药物虽然效果显著但却越来越受到食品安全的限制而无法使用。不适用抗生素类药物，就要进行提前干预，预防禽畜感染。需要一种针对大肠杆菌疾病的饲料添加剂，能够有效预防禽畜患病，并且能够改善禽畜的肠道功能，提高禽畜免疫力。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种酿酒酵母培养物及其应用。本发明采用酒酿酵母通过长时间发酵，使得大分子物质被降解成小分子蛋白、小肽及游离氨基酸，有利于机体对营养物质的吸收，制备的酿酒酵母培养物能够调节胃肠消化功能、维持肠道内菌群平衡、抑制病原微生物等作用。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.本发明的第一方面，提供一种酿酒酵母培养物的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)将麸皮、米曲麸皮、薏仁、糖蜜和乳清粉混合，并调整混合物的水分含量至38
‑
40％，灭菌后得到固态发酵底物；
8.(2)将乳酸菌菌液与酿酒酵母菌液分别接种至步骤(1)得到的固态发酵底物中，进行发酵，得到发酵物；
9.(3)将步骤(2)得到的发酵物烘干至含水量12％
‑
14％，得到酿酒酵母培养物。
10.优选的，步骤(1)中，所述麸皮、米曲麸皮、薏仁、糖蜜和乳清粉按照(80～90)：(5～15)：(1～7)：(0.6～1.1)：(0.1～0.2)的质量比混合；优选的，所述灭菌的温度为105
‑
121
℃，时间为20
‑
30min。
11.优选的，步骤(1)中，所述米曲麸皮由以下方法制备：将米曲霉菌种接种至纯麸皮中，28
‑
32℃培养至米曲霉中性蛋白酶活力达到6000u/g。米曲霉菌的接种量占纯麸皮质量的0.2wt％。
12.优选的，所述米曲霉菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号：cicc2013。
13.优选的，步骤(2)中，所述乳酸菌菌液由以下方法制备：将乳酸菌菌种接种至mrs液体培养基中，37
‑
39℃培养至乳酸菌菌数为1
×
10
10
cfu/ml。乳酸菌菌种的接种量占mrs液体培养基质量的3wt％。
14.优选的，所述乳酸菌为干酪乳杆菌，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为cicc 6117。
15.优选的，步骤(2)中，所述酿酒酵母菌液由以下方法制备：将酿酒酵母菌种接种至pda液体培养基中，30
‑
32℃培养至酿酒酵母菌菌数为2
×
108cfu/ml。酿酒酵母菌种的接种量占pda液体培养基质量的5wt％。
16.优选的，所述酿酒酵母菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为cicc 1355。
17.优选的，步骤(2)中，所述乳酸菌菌液的接种量占固态发酵底物总质量的1
‑
2％；所述酿酒酵母菌液的接种量占固态发酵底物总质量的0.1％
‑
0.5％。
18.优选的，步骤(2)中，所述发酵条件为：28
‑
32℃培养20
‑
24h，然后升温至35
‑
37℃培养20
‑
24h，最后升温至40
‑
42℃培养44
‑
48h；
19.优选的，步骤(3)中，所述烘干温度为45
‑
55℃。
20.本发明的第二方面，提供上述制备方法制备得到的酿酒酵母培养物。
21.本发明的第三方面，提供酿酒酵母培养物在制备改善禽畜肠道功能的产品中的应用。
22.本发明的有益效果：
23.(1)本发明在发酵过程中，经过超长发酵周期处理，使得大分子营养素等被充分降解，大分子蛋白被降解为小分子蛋白、小肽及游离氨基酸，使得制备得到的酿酒酵母培养物有利于机体对营养物质的吸收。
24.(2)本发明制备的酿酒酵母培养物富含l
‑
乳酸等有益物质，能够起到改善饲料利用率、调节胃肠消化功能、维持肠道内菌群平衡、抑制病原微生物等效果。
具体实施方式
25.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
26.正如背景技术部分介绍的，禽畜一旦感染大肠杆菌，需要抗生素治疗。由于食品安全问题，禽畜肉质中抗生素的检出量要求越来越严格。
27.基于此，本发明的目的是提供一种酿酒酵母培养物的制备方法。酿酒酵母培养物是根据微生物代谢理论以及生物发酵工程技术，采用乳酸菌菌液与酿酒酵母菌液进行长时
间发酵加工而成的含有多种代谢产物的发酵技术产品。本发明通过构建肉鸡大肠杆菌免疫应激模型，研究酿酒酵母培养物对应激状态下动物的免疫调节作用；发现酿酒酵母培养物能够改善动物胃肠道环境，维持机体内胃肠道的微生态平衡，抑制有害菌增殖，增强机体免疫力以及促进消化吸收。酿酒酵母培养物富含有机酸、小肽、氨基酸、寡糖、消化酶、b族维生素等，能提高动物对饲料的消化吸收能力，预防或改善腹泻症状，进一步增强机体免疫力。通过发明人试验发现，固态发酵底物中加入薏仁能够进一步改善腹泻症状，抑制病原微生物。
28.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
29.本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
30.说明：干酪乳杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为cicc 6117；酿酒酵母菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为cicc 1355；
31.米曲霉菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号：cicc 2013。
32.实施例1
33.米曲麸皮的制备：将0.2wt％的米曲霉菌种接种至纯麸皮中，30℃培养至米曲霉中性蛋白酶活力达到6000u/g，得到米曲麸皮。
34.实施例2
35.乳酸菌菌液的制备：将3wt％的乳酸菌菌种接种至mrs液体培养基中，38℃培养至乳酸菌菌数为1
×
10
10
cfu/ml。
36.实施例3
37.酿酒酵母菌液的制备：将5wt％的酿酒酵母菌种接种至pda液体培养基中，31℃培养至酿酒酵母菌菌数为2
×
108cfu/ml。
38.实施例4
39.(1)将麸皮、实施例1制备的米曲麸皮、薏仁、糖蜜和乳清粉按照85：10：4：0.85：0.15的质量比混合，并调整混合物中的水分含量为39％，113℃灭菌25min，得到固态发酵底物。
40.(2)将实施例2制备的乳酸菌菌液与实施例3制备的酿酒酵母菌液分别培养至浓度1
×
10
10
cfu/ml和2
×
108cfu/ml，并分别按照1.5wt％和0.3wt％的比例接种至固态发酵底物中，混合均匀。
41.(3)将步骤(2)得到的混合物按照以下条件进行发酵：30℃培养22h，然后升温至36℃培养22h，最后41℃培养46h。
42.(4)发酵完毕后在温度为50℃的条件下烘干至含水量13％，得到酿酒酵母培养物。
43.实施例5
44.(1)将麸皮、实施例1制备的米曲麸皮、薏仁、糖蜜和乳清粉按照80：15：1：1.1：0.1的比例混合，并调整混合物中的水分含量为40％，105℃灭菌30min，得到固态发酵底物。
45.(2)将实施例2制备的乳酸菌菌液与实施例3制备的酿酒酵母菌液分别培养至浓1
×
10
10
cfu/ml和2
×
108cfu/ml，并分别按照1wt％和0.5wt％的比例接种至固态发酵底物中，混合均匀。
46.(3)将步骤(2)得到的混合物按照以下条件进行发酵：32℃培养20h，然后升温至35℃培养24h，最后42℃培养48h。
47.(4)发酵完毕后在温度为45℃的条件下烘干至含水量14％，得到酿酒酵母培养物。
48.实施例6
49.(1)将麸皮、实施例1制备的米曲麸皮、薏仁、糖蜜和乳清粉按照90：5：7：0.6：0.2的比例混合，并调整混合物水分含量为38％，121℃灭菌20min，得到固态发酵底物。
50.(2)将实施例2制备的乳酸菌菌液与实施例3制备的酿酒酵母菌液分别培养至浓度1
×
10
10
cfu/ml和2
×
108cfu/ml，并分别按照2wt％和0.1wt％的比例接种至固态发酵底物中，混合均匀。
51.(3)将步骤(2)得到的混合物按照以下条件进行发酵：28℃培养24h，然后升温至37℃培养20h，最后40℃培养48h。
52.(4)发酵完毕后在温度为55℃的条件下烘干至含水量12％％，得到酿酒酵母培养物。
53.对比例1
54.(1)将麸皮、薏仁、糖蜜和乳清粉按照95：4：0.85：0.15的质量比混合，并调整混合物中的水分含量为39％，113℃灭菌25min，得到固态发酵底物。
55.(2)将实施例2制备的乳酸菌菌液与实施例3制备的酿酒酵母菌液分别培养至浓度1
×
10
10
cfu/ml和2
×
108cfu/ml，并分别按照1.5wt％和0.3wt％的比例接种至固态发酵底物中，混合均匀。
56.(3)将步骤(2)得到的混合物按照以下条件进行发酵：30℃培养22h，然后升温至36℃培养22h，最后41℃培养46h。
57.(4)发酵完毕后在温度为50℃的条件下烘干至含水量13％，得到酿酒酵母培养物。
58.对比例2
59.(1)将麸皮、实施例1制备的米曲麸皮、糖蜜和乳清粉按照89：10：0.85：0.15的质量比混合，并调整混合物中的水分含量为39％，113℃灭菌25min，得到固态发酵底物。
60.(2)将实施例2制备的乳酸菌菌液与实施例3制备的酿酒酵母菌液分别培养至浓度1
×
10
10
cfu/ml和2
×
108cfu/ml，并分别按照1.5wt％和0.3wt％的比例接种至固态发酵底物中，混合均匀。
61.(3)将步骤(2)得到的混合物按照以下条件进行发酵：30℃培养22h，然后升温至36℃培养22h，最后41℃培养46h。
62.(4)发酵完毕后在温度为50℃的条件下烘干至含水量13％，得到酿酒酵母培养物。
63.对比例3
64.(1)将麸皮、实施例1制备的米曲麸皮、薏仁、糖蜜和乳清粉按照85：10：4：0.85：0.15的质量比混合，并调整混合物中的水分含量为39％，113℃灭菌25min，得到固态发酵底物。
65.(2)将实施例2制备的乳酸菌菌液培养至浓度1
×
10
10
cfu/ml，并按照1.5wt％的比例接种至固态发酵底物中，混合均匀。
66.(3)将步骤(2)得到的混合物按照以下条件进行发酵：35℃培养4d。
67.(4)发酵完毕后在温度为50℃的条件下烘干至含水量13％，得到乳酸菌培养物。
68.对比例4
69.(1)将麸皮、实施例1制备的米曲麸皮、薏仁、糖蜜和乳清粉按照85：10：4：0.85：0.15的质量比混合，并调整混合物中的水分含量为39％，113℃灭菌25min，得到固态发酵底物。
70.(2)将实施例3制备的酿酒酵母菌液培养至浓度2
×
108cfu/ml，并按照0.3wt％的比例接种至固态发酵底物中，混合均匀。
71.(3)将步骤(2)得到的混合物按照以下条件进行发酵：37℃培养4d。
72.(4)发酵完毕后在温度为50℃的条件下烘干至含水量13％，得到酿酒酵母培养物。
73.对实施例4～6和对比例1～4制备的酵母培养物进行营养成分的检测，所得结果见表1。
74.表1营养成分含量％
75.检测项目实施例4实施例5实施例6对比例1对比例2对比例3对比例4粗蛋白17.8217.7117.7417.5517.6017.5317.62粗灰分6.276.506.657.177.146.937.06总有机酸6.786.346.206.116.135.965.62小肽比例41.2541.4241.1341.0040.9240.3740.93氨基酸总和15.6415.5215.6415.0615.1715.3415.28钙0.240.210.230.190.170.180.18磷0.930.990.960.890.860.880.91有效磷0.710.690.700.640.650.600.66l
‑
乳酸4.554.494.624.334.374.284.24
76.由表1可知，本发明制备的酿酒酵母培养物中营养成分的含量高于对比例1～4，说明本发明制备的酿酒酵母培养物营养价值高，富含有机酸、小肽、氨基酸、l
‑
乳酸等物质。
77.试验例
78.选取健康体重一致的14日龄白羽肉鸡324只，随机分为9个处理，每个处理6个重复，每个重复6只鸡。空白对照组与模型组饲喂基础饲粮，实施例4～6组和对比例1～4组在对照组饲粮的基础上添加5％的酿酒酵母培养物。预饲期3天，试验期28天。试验期期间模型组、实施例4～6组和对比例1～4组的鸡只隔天口服灌胃0.5ml大肠杆菌菌液(1.0
×
104cfu/ml)，空白对照组鸡只隔天口服灌胃等量生理盐水。试验期结束后每个处理每个重复选取3只体重接近平均体重的健康肉鸡，空腹12h后称重，翅静脉采血，折颈处死，采集盲肠内容物，用于后续分析，所得结果见表2～4。
79.表2生产性能
[0080][0081]
通过观察鸡只的日常表现，模型组鸡只出现精神萎靡、采食量下降、腹泻等症状，但未出现因灌胃大肠杆菌造成的死亡现象，说明建模成功。
[0082]
由表2数据可知，模型组、实施例4～6组和对比例1～4组的鸡只的平均日采食量和结束体重均略低于空白对照组，但实施例4～6组和对比例1～4组鸡只的平均日采食量和结束体重优于模型组，说明肉鸡饲粮中添加本发明制备的酿酒酵母培养物能改善肉鸡的生产性能。
[0083]
表3盲肠微生物log cfu/g
[0084][0085]
由表3数据可知，与空白对照组、模型组和对比例1～4组相比，实施例4～6组的肉鸡盲肠大肠杆菌数量显著降低(p<0.05)，双歧杆菌数量显著提高(p>0.05)，说明肉鸡饲粮中添加酿酒酵母培养物能提高肉鸡肠道健康。
[0086]
表4免疫指标
[0087][0088]
由表4数据可知，与空白对照组、模型组和对比例1～4组相比，实施例4～6组的鸡只的血清免疫球蛋白含量(iga、igm和igg)和tnf
‑
α含量显著提高(p<0.05)，说明肉鸡饲粮中添加酿酒酵母培养物能改善肉鸡的免疫性能。
[0089]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。