一种坡耕地垄沟布局对微生物影响机理的识别方法与流程

1.本发明属于土壤微生物学技术领域，尤其涉及一种坡耕地垄沟布局对微生物影响机理的识别方法。


背景技术：

2.坡耕地作为一种常见的农业土壤资源，因其独特的地貌类型，严重制约了旱地的农业生产，而垄沟耕作作为一种常见的保护性耕作措施，在一定条件下可以有效解决坡耕地造成的跑水跑肥等问题。土壤中微生物参与土壤生态系统间物质循环和能量流动，对农作物根系生长发育提供促进作用，目前针对坡耕地垄沟耕作对土壤微生物影响的研究主要集中在垄沟耕作结合覆膜和秸秆覆盖对微生物产生影响，受覆膜和秸秆多种因素的制约，无法单纯了解垄沟耕作这一模式是否对土壤微生物产生影响。


技术实现要素：

3.针对现有技术中的上述不足，本发明提供的一种坡耕地垄沟布局对微生物影响机理的识别方法，解决了无法单纯了解垄沟耕作这一模式是否对土壤微生物产生影响的问题。
4.为了达到以上目的，本发明采用的技术方案为：
5.本方案提供一种坡耕地垄沟布局对微生物影响机理的识别方法，包括以下步骤：
6.s1、选取研究区，并确定种植作类型和坡耕地垄沟布局参数，所述坡耕地垄沟布局参数包括：垄坡度、垄高、垄沟宽比以及垄沟走向；
7.s2、以垄坡度、垄高、垄沟宽比以及垄沟走向按四因素三水平正交表布设实验小区和对照小区，并种植所选作物；
8.s3、分别于作物种植前、生育中期、收获期采集各实验小区及对照小区土壤样品进行土壤微生物高通量测序，得到不同实验小区及对照小区土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据；
9.s4、利用方差分析法检验垄坡度、垄高、垄沟宽比以及垄沟走向对所述土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的影响，并确定对所述土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据产生影响的垄坡度、垄高、垄沟宽比以及垄沟走向四因素的主次顺序；
10.s5、将所述主次顺序分别与土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据构建线性回归方程；
11.s6、对所述线性回归方程进行显著性检验，并根据检验结果将其垄坡度、垄高、垄沟宽比以及垄沟走向的标准系数作为评价坡垄沟布局对土壤微生物的影响，完成对坡耕地垄沟布局对微生物影响机理的识别。
12.本发明的有益效果是：本发明通过选择正交实验对不同垄沟布局参数进行实验设计，大大减少了实验次数；利用方差分析法检验并筛选出对土壤微生物影响最大的垄沟布
局参数，能够精确地估计各垄沟布局参数对实验结果影响的重要程度，经方差分析法估计的各垄沟布局参数与土壤微生物群落结构与功能多样性间构建线性回归方程，通过将标准系数作为评价坡垄沟布局对土壤微生物产生的影响，可为坡耕地垄沟布局布设提供理论参考，进而达到农业高产目的。
13.进一步地，所述步骤s3包括以下步骤：
14.s301、在作物种植前、生育期中期以及收获期三个阶段，以及在实验小区和对照小区内上、中、下三段选择田垄和田沟两个取样区域，除去表层浮土，采集土壤样品，除去同一小区土样混合物的杂质，并装入灭菌封装袋下保存；
15.s302、对土壤样品进行土壤微生物高通量测序，得到各实验小区和对照小区的土壤样品微生物dna或rna序列数、otu丰度信息以及物种分类信息；
16.s303、根据所述土壤样品微生物dna或rna序列数、otu丰度信息以及物种分类信息，计算得到不同实验小区及对照小区土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据。
17.上述进一步方案的有益效果是：通过对实验小区土壤样品进行三个时期的取样，避免了时间尺度上对实验误差产生的影响；对土壤样品进行高通量测序，能更加快速准确地判断土壤样品中微生物群落结构的丰度和多样性，将土壤微生物群落结构多样性和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据作为对土壤微生物影响的评价指标，有利于从结构和功能方面全面分析垄沟布局对土壤微生物群落产生的影响。
18.再进一步地，所述步骤s4包括以下步骤：
19.s401、计算各实验小区和对照小区土壤样品中微生物群落结构多样性相关指数及土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的平均值；
20.s402、根据所述平均值，计算得到各实验小区和对照小区土壤样品中微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的离差平方和及自由度；
21.s403、根据所述离差平方和及自由度，利用方差分析法检验不同垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d对土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的影响；
22.s404、对步骤s403得到的影响结果进行显著性检验；
23.s405、根据显著性检验结果，按从大到小对步骤s403得到的影响结果进行排序，得到对所述土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据产生影响的垄坡度、垄高、垄沟宽比以及垄沟走向四因素的主次顺序。
24.上述进一步方案的有益效果是：通过计算各实验小区和对照小区土壤样品中微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的平均值、离差平方和和自由度，检验不同垄沟布局参数对土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度的影响，能够精确地估计各因素的实验结果影响的重要程度。
25.再进一步地，所述步骤s401中平均值的表达式如下：
26.27.j＝1,2,
…
,p；k＝1,2,
…
,r；i＝1,2,
…
,n
28.其中，表示各实验小区和对照小区土壤样品的微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的平均值，p表示实验小区的个数，r表示测量次数，j表示第j个实验小区，k表示对实验小区的第k次测量，x
jk
表示第j个实验小区第k次测量的微生物群落结构多样性相关指数，n表示土壤碳氮循环过程相关功能基因数目，i表示第i个土壤碳氮循环过程相关功能基因数目，fcn
ijk
表示第j个实验小区第k次测量的第i个土壤碳氮循环过程功能基因丰度值。
29.上述进一步方案的有益效果是：分别计算土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的平均值，用于后续方差分析做准备。
30.再进一步地，所述步骤s402中离差平方和及自由度的表达式如下：
[0031][0032][0033][0034]
f
t
＝p
‑1[0035]
f
a
＝q
‑1[0036][0037]
a＝{α，β，h，d}
[0038]
其中，s
t
表示各实验小区和对照小区土壤样品中微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的总离差平方和，s
a
表示垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d四因素引起的离差平方和，s
e
表示误差离差平方和，f
t
、f
a
、f
e
均表示s
t
、s
a
以及s
e
相应的自由度，y
j
表示第j个实验小区土壤样品中微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据，表示各实验小区和对照小区土壤样品中微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的平均值，q表示垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d的水平数，m表示正交表的列数，u表示正交表的第u列，k
o
表示任意列上四因素取水平o时所得到的实验结果的算数平均值。
[0039]
上述进一步方案的有益效果是：分别计算垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d四因素引起的实验和对照小区土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的离差平方和和自由度，有利于从不同垄沟布局参数对土壤微生物群落结构和功能影响进行全面分析，并为方差分析计算作准备。
[0040]
再进一步地，所述步骤s403中检验不同垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d对土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的影响的表达式如下：
[0041]
[0042]
其中，f
a
表示垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d引起的土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的均方与各垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d四因素共同引起的土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据误差的均方的比值。
[0043]
上述进一步方案的有益效果是：分别从垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d影响了土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据进行方差分析，检验不同垄沟布局参数对土壤微生物产生影响的结果的差异显著性，能精确的估计各垄沟布局参数对实验结果影响的重要程度，进而筛选出对土壤微生物影响最大的垄沟布局参数。
[0044]
再进一步地，所述步骤s404中进行显著性检验的表达式如下：
[0045][0046]
其中，φ表示各垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β和垄沟走向d的f
α
、f
h
、f
β
、f
d
分别与f值在γ＝0.05显著性水平下的比值，f
a
表示各实验小区和对照小区由垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d四因素引起的自由度为(f
a
，f
e
)的土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的均方与各垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d四因素共同引起的实验误差均方的比值，f
0.05
表示表示各实验小区和对照小区由垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d四因素引起的自由度为(f
a
，f
e
)在γ＝0.05显著性水平下的土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的均方与各垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d四因素共同引起的实验误差均方的比值。
[0047]
上述进一步方案的有益效果是：从垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d四个影响因素上检验垄沟布局是否对土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据产生显著影响，对方程分析结果进一步完善。
[0048]
再进一步地，所述步骤s5中线性回归方程的表达式如下：
[0049][0050]
或
[0051][0052]
其中，b0、b1、b2、b3、b4分别表示线性回归方程的系数，α
j
、h
j
、β
j
、d
j
分别表示第j个实验小区的垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β和垄沟走向d数据，y
j
表示第j个实验小区土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据，p表示实验小区个数，x
jk
表示第j个实验小区第k次测量的微生物群落结构多样性相关指数，fcn
ijk
表示第j个实验小区第k次测量的第i个土壤碳氮循环过程功能基因丰度值。
[0053]
上述进一步方案的有益效果是：通过构建线性回归方程，更加明确地表示垄沟布局参数对土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据间的线性关系，寻找隐藏在随机性后面的统计规律。
[0054]
再进一步地，所述步骤s6中对线性回归方程进行显著性检验的表达式如下：
[0055][0056]
其中，r
j
、r
g
表示各线性回归方程的复相关系数，s
rj
表示各实验小区和对照小区的垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d与土壤微生物群落结构多样性相关指数的线性回归方程的回归平方和，s
tj
表示各实验小区和对照小区的垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d与土壤微生物群落结构多样性相关指数的线性回归方程的总平方和，s
rg
表示各实验小区和对照小区的垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d与土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的线性回归方程的回归平方和，s
tg
表示各实验小区和对照小区的垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d与土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的线性回归方程的总平方和。
[0057]
上述进一步方案的有益效果是：通过对所求线性回归方程进行显著性检验，检验方程的可信性。
附图说明
[0058]
图1为本发明的方法流程图。
[0059]
图2为本实施例中各实验小区垄沟参数布设图。
[0060]
图3为本实施例中各实验小区垄沟参数布设剖面图。
具体实施方式
[0061]
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
[0062]
实施例
[0063]
如图1所示，本发明提供了一种坡耕地垄沟布局对微生物影响机理的识别方法，其实现方法如下：
[0064]
s1、选取研究区，并确定种植作类型和坡耕地垄沟布局参数，所述坡耕地垄沟布局参数包括：垄坡度、垄高、垄沟宽比以及垄沟走向；
[0065]
本实施例中，选取研究区，通过实地调查走访，结合当地耕作习惯和典型种植作物，确定实验小区垄沟布设控制参数和参数变化范围及典型种植作物。
[0066]
s2、以垄坡度、垄高、垄沟宽比以及垄沟走向按四因素三水平正交表布设实验小区和对照小区，并种植所选作物，其中，布设实验小区和对照小区如图2和图3所示，图3中α表示垄坡度，h表示垄高，c表示沟宽，e表示垄宽，β表示垄沟宽比(β＝c/e)，d表示垄沟走向；
[0067]
本实施例中，正交表选择不考虑交互作用的四因素三水平l9(34)正交表，正交表设计如表1所示。
[0068]
表1
[0069][0070][0071]
该正交表中，α1、α2、α3表示垄坡度的三水平；h1、h2、h3表示垄高的三水平；β1、β2、β3表示垄沟宽比的三水平；d1、d2、d3表示垄沟走向的三水平，各水平间在研究区垄沟控制参数在变化范围内按照等差数列布设。
[0072]
s3、分别于作物种植前、生育中期、收获期采集各实验小区及对照小区土壤样品进行土壤微生物高通量测序，得到不同实验小区及对照小区土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据，其实现方法如下：
[0073]
s301、在作物种植前、生育期中期以及收获期三个阶段，以及在实验小区和对照小区内上、中、下三段选择田垄和田沟两个取样区域，除去表层浮土，采集土壤样品，除去同一小区土样混合物的杂质，并装入灭菌封装袋下保存；
[0074]
s302、对土壤样品进行土壤微生物高通量测序，得到各实验小区和对照小区的土壤样品微生物dna或rna序列数、otu丰度信息以及物种分类信息；
[0075]
s303、根据所述土壤样品微生物dna或rna序列数、otu丰度信息以及物种分类信息，计算得到不同实验小区及对照小区土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据。
[0076]
本实施例中，在作物种植前、生育中期、收获期3个阶段的实验小区和对照小区内上、中、下三段选择田垄和田沟两个取样区域(平作对照小区选取相同位置取样区域)，除去表层0
‑
5cm浮土，采集10g土壤样品，将同一小区的土样混合后除去动植物残体等杂质后装入灭菌自封袋于
‑
80℃下保存。
[0077]
本实施例中，对土壤样品进行土壤微生物高通量测序，所述高通量测序平台为illumina miseq平台。对高通量测序后数据以97％的相似水平对otus进行聚类和抽平后，
获得各实验小区和对照小区样品微生物dna或rna序列数、otu丰度信息、物种分类信息。
[0078]
本实施例中，计算各土壤样品中微生物群落结构多样性相关指数chao、shannon、pd和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据，分别记为ch
jk
，s
jk
，pd
jk
，fcn
ijk
，其中i＝1,2,
…
,n，n表示碳氮循环相关功能基因数目，基于实际试验过程确定；j＝1,2,
…
,10,j表示试验小区数目，k表示第k次测量，k＝1,2,3。
[0079]
s4、利用方差分析法检验垄坡度、垄高、垄沟宽比以及垄沟走向对所述土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的影响，并确定对所述土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据产生影响的垄坡度、垄高、垄沟宽比以及垄沟走向四因素的主次顺序，其实现方法如下：
[0080]
s401、计算各实验小区和对照小区土壤样品中微生物群落结构多样性相关指数及土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的平均值：
[0081][0082]
j＝1,2,
…
,p；k＝1,2,
…
,r；i＝1,2,
…
,n
[0083]
其中，表示各实验小区和对照小区土壤样品的微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的平均值，p表示实验小区的个数，r表示测量次数，j表示第j个实验小区，k表示对实验小区的第k次测量，x
jk
表示第j个实验小区第k次测量的微生物群落结构多样性相关指数，n表示土壤碳氮循环相关功能基因数目，i表示第i个土壤碳氮循环相关功能基因数目，fcn
ijk
表示第j个实验小区第k次测量的第i个土壤碳氮循环过程功能基因丰度值；
[0084]
s402、根据所述平均值，计算得到各实验小区和对照小区土壤样品中微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的离差平方和及自由度：
[0085][0086][0087][0088]
f
t
＝p
‑1[0089]
f
a
＝q
‑1[0090][0091]
a＝{α，β，h，d}
[0092]
其中，s
t
表示各实验小区和对照小区土壤样品中微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的总离差平方和，s
a
表示垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d四因素引起的离差平方和，s
e
表示误差离差平方和，f
t
、f
a
、f
e
均表示s
t
、s
a
以及
s
e
相应的自由度，y
j
表示第j个实验小区土壤样品中微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据，表示各实验小区和对照小区土壤样品中微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的平均值，q表示垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d的水平数，m表示正交表的列数，u表示正交表的第u列，k
o
表示任意列上四因素取水平o时所得到的实验结果的算数平均值；
[0093]
s403、根据所述离差平方和及自由度，利用方差分析法检验不同垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d对土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的影响：
[0094][0095]
其中，f
a
表示垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d引起的土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的均方与各垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d四因素共同引起的土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据误差的均方的比值；
[0096]
s404、对步骤s403得到的影响结果进行显著性检验：
[0097][0098]
其中，φ表示各垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β和垄沟走向d的f
α
、f
h
、f
β
、f
d
分别与f值在γ＝0.05显著性水平下的比值，f
a
表示各实验小区和对照小区由垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d四因素引起的自由度为(f
a
，f
e
)的土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的均方与各垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d四因素共同引起的实验误差均方的比值，f
0.05
表示表示各实验小区和对照小区由垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d四因素引起的自由度为(f
a
，f
e
)在γ＝0.05显著性水平下的土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的均方与各垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d四因素共同引起的实验误差均方的比值；
[0099]
s405、根据显著性检验结果，按从大到小对步骤s403得到的影响结果进行排序，得到对所述土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据产生影响的垄坡度、垄高、垄沟宽比以及垄沟走向四因素的主次顺序；
[0100]
s5、将所述主次顺序分别与土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据构建线性回归方程；
[0101]
本实施例中，假设垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d四因素按影响主次的排列顺序为f
α
>f
h
>f
β
>f
d
，设方程y＝b0 αb1 hb2 βb3 db4，线性回归方程方程组为：
[0102][0103]
或
[0104][0105]
其中，b0、b1、b2、b3、b4分别表示线性回归方程的系数，α
j
、h
j
、β
j
、d
j
分别表示第j个实验小区的垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β和垄沟走向d数据，y
j
表示第j个实验小区土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据，p表示实验小区个数，x
jk
表示第j个实验小区第k次测量的微生物群落结构多样性相关指数，fcn
ijk
表示第j个实验小区第k次测量的第i个土壤碳氮循环过程功能基因丰度值。
[0106]
s6、对所述线性回归方程进行显著性检验，并根据检验结果将其垄坡度、垄高、垄沟宽比以及垄沟走向的标准系数作为评价坡垄沟布局对土壤微生物的影响，完成对坡耕地垄沟布局对微生物影响机理的识别。
[0107]
本实施例中，对线性回归方程进行显著性检验，分别将各小区的α
j
、h
j
、β
j
、d
j
值代入所求得的线性回归方程中，计算其回代值随后分别计算该线性回归方程的回归平方和和总平方和及自由度并检验回归方程的显著性，所述检验方法为相关系数检验法，计算公式为：
[0108][0109]
其中，r
j
、r
g
表示各线性回归方程的复相关系数，s
rj
表示各实验小区和对照小区的垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d与土壤微生物群落结构多样性相关指数的线性回归方程的回归平方和，s
tj
表示各实验小区和对照小区的垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d与土壤微生物群落结构多样性相关指数的线性回归方程的总平方和，s
rg
表示各实验小区和对照小区的垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d与土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的线性回归方程的回归平方和，s
tg
表示各实验小区和对照小区的垄坡度α、垄高h、垄沟宽比β、垄沟走向d与土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据的线性回归方程的总平方和。
[0110]
本实施例中，对于各线性回归方程的复相关系数r
j
、r
g
，若计算结果在0
‑
1之间或等于1时，该线性回归方程通过显著性检验，若计算结果等于0时，该线性回归方程无显著性。