青光眼的新疗法的制作方法

青光眼的新疗法
1.本发明是在国立卫生研究院授予的资助号为ey028995的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
2.引言
3.青光眼是影响超过300万美国人和全世界6000万人的主要健康问题。据估计，到2040年，全世界将有1.118亿人受到该疾病的影响。该疾病的一个主要危险因素是眼内压(iop)升高，在不进行治疗的情况下，它会损害视神经并导致永久性失明。目前，尚无法治愈青光眼。现有的滴眼剂或口服药物具有有限的疗效，副作用很多，并且手术通常会失败，伴随瘢痕形成和纤维化。
4.房水是充满眼睛的前房和后房的透明无色液体。它由睫状体在后房产生，并经由小梁网和施莱姆氏管通过常规途径离开前房角，以及经由葡萄膜巩膜流出通过非常规途径离开前房角。在正常的眼睛中，房水的产生和排出之间存在动态平衡，使iop维持在正常范围内。
5.施莱姆氏管(sc)是位于眼前房中的虹膜角膜角的环形通道。它是常规房水流出系统的一部分，占人眼排出的总房水的70
‑
90％。施莱姆氏管的内皮细胞内衬是阻碍房水排出的主要部位之一，并且是iop的主要决定因素。当管阻力随着年龄或在病理情况下增加时，iop升高，导致青光眼，并伴有不可逆的视神经损害和视力丧失。因此，它是青光眼治疗的重要靶标。最近，我们提供了施莱姆氏管表达淋巴形成的主要控制基因prox
‑
1的首个证据(truong tn,li h,hong yk,chen l.novel characterization and live imaging of schlemm's canal expressing prox
‑
1.plos one.2014；9(5):e98245)。
6.我们之前报道了wnt5a在施莱姆氏管上表达，其表达响应于剪切应力变化而被调节，并且通过抑制wnt5a，我们可以有效地在体内降低iop。wnt5a根据细胞类型、微环境、刺激等，通过多种和供选择的信号传导途径起作用。为了确定青光眼的其他可被药物靶向的靶点，我们试图确定青光眼相关模型中的下游效应物，并确定它们用于治疗青光眼的可被药物靶向性。
7.我们在这里特别报道的是，fzd2(卷曲蛋白
‑
2(frizzled
‑
2))、fzd5和ror1(受体酪氨酸激酶样孤儿受体1)在sc上表达，它们的表达响应于剪切应力变化、wnt5a刺激或干预而受到调节。例如，fzd2、fzd5和ror1调节可调节sc功能，如管形成。在压力(或增加的剪切应力)下培养的sc细胞中，我们观察到wnt5a、fzd2、fzd5和ror1增加，当wnt5a下调时，fzd2、fzd5和ror1也下调，当我们用wnt5a刺激人sc细胞时，fzd5和ror1相应增加。
8.另外，我们公开了钙信号传导参与sc功能，并且几种相关分子，例如plcb1(磷脂酶c，β1)、ppp3r1(蛋白磷酸酶3调节亚基b，α)、nfatc3(活化t细胞核因子3)、camk2d(钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶iiδ)响应于剪切应力变化、wnt5a刺激或干预而受到调节。我们公开了这些wnt受体(即fzd2、fzd5、ror1)和钙信号传导途径的相关分子(即plcb1、ppp3r1、nfatc3、camk2d)提供了调节sc功能和治疗青光眼的靶标。
9.已知wnt5a根据细胞类型、微环境、刺激等，通过多种和供选择的信号传导途径起作用，并且之前不知道在青光眼相关模型中，如果有的话，这些下游效应物中的哪一个起作
用，以及如果有的话，什么效应物可能为控制iop提供可被药物靶向的靶标。
10.发明概述
11.本发明提供了用于局部治疗青光眼或致病性眼内压的方法和组合物。
12.一方面，本发明提供了一种治疗青光眼或致病性眼内压的方法，包括向有其需要的人给予选自以下的眼部wnt5a效应物的抑制剂：fzd2(卷曲蛋白
‑
2)、fzd5(卷曲蛋白
‑
5)和ror1(受体酪氨酸激酶样孤儿受体1)；或plcb1(磷脂酶c，β1)、ppp3r1(蛋白磷酸酶3调节亚基b，α)、nfatc3(活化t细胞核因子3)和camk2d(钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶iiδ)。
13.在实施方案中：
14.‑
抑制剂通过基因操作，例如crispr基因编辑或sirna抑制效应物表达；
15.‑
所述抑制剂直接抑制所述效应物并且选自抗体、小干扰肽和小分子抑制剂；
16.‑
所述给予步骤包括向有其需要的眼睛局部给予所述抑制剂；
17.‑
所述给予步骤包括通过滴眼剂或通过前房内给予或注射、结膜下给予或注射或玻璃体内给予或注射递送；
18.‑
所述给予是局部的，并且所述抑制剂以局部眼用凝胶、软膏、混悬剂或溶液或接触镜的形式给予；
19.‑
所述抑制剂是ror1抑制剂，例如选自西妥珠单抗(cirmtuzumab)和kan0439834，或fzd5抑制剂，例如选自抗fzd5抗体igg
‑
2919和igg
‑
2921(steinhardt等人,nat.med.2017；23:60
–
68)，或和fzd2抑制剂，例如选自dfz7
‑
21，选择性肽(nile等人,nat.chem.biol.2018；14:582
–
590)，或fzd2抗体，或sirna，例如本文公开的；和/或
20.‑
所述方法还包括在眼部局部给予或共同给予第二种不同的抑制剂，所述第二种不同的抑制剂是眼部wnt5a效应物的抑制剂。
21.另一方面，本发明提供了一种用于治疗青光眼或致病性眼内压的眼部wnt5a效应物的抑制剂的眼用制剂，其为单位剂量形式，所述效应物选自：fzd2(卷曲蛋白
‑
2)、fzd5(卷曲蛋白
‑
5)和ror1(受体酪氨酸激酶样孤儿受体1)；或plcb1(磷脂酶c，β1)、ppp3r1(蛋白磷酸酶3调节亚基b，α)、nfatc3(活化t细胞核因子3)和camk2d(钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶iiδ)。
22.在实施方案中：
23.‑
所述抑制剂通过基因操作，例如crispr基因编辑或sirna抑制效应物表达；
24.‑
所述抑制剂直接抑制所述效应物并且选自抗体、小干扰肽和小分子抑制剂；
25.‑
所述制剂为局部眼用凝胶、软膏、混悬剂或溶液的形式；
26.‑
所述剂型是负载抑制剂的接触镜、滴眼剂、长效制剂或单次推注剂型；
27.‑
所述制剂包装在滴眼剂分配器中；
28.‑
所述制剂装载在配置用于前房内给予或注射、结膜下给予或注射或玻璃体内给予或注射的注射器中；
29.‑
所述制剂还包含适合直接、局部递送到眼睛的赋形剂和特征，其选自眼科适合的澄清度、ph缓冲剂、张力、粘度、稳定性和无菌性；和/或
30.‑
所述抑制剂是ror1抑制剂，例如选自西妥珠单抗和kan0439834，或fzd5抑制剂，例如选自抗fzd5抗体igg
‑
2919和igg
‑
2921，或和fzd2抑制剂，例如选自dfz7
‑
21，选择性肽，或fzd2抗体，或sirna，例如本文公开的。
31.本发明包括本文叙述的具体实施方案的所有组合。所述方法可以用包括特定实施方案的所有公开的组合物实施。
32.附图简述
33.图1a
‑
g.(a
‑
c)实时定量pcr数据，其显示人施莱姆氏管细胞中fzd5、ror1和fzd2的表达水平受剪切应力(a)、经由小干扰rna(sirna)的wnt5a干预(b)或wnt5a刺激(c)的调节。(d和e)总结的数据，其显示人施莱姆氏管细胞的管形成分别被fzd5 sirna(d)或ror1 sirna(e)抑制。乱序sirna用作阴性对照。*p<0.05。(f和g)代表性图像，其显示人施莱姆氏管细胞的管形成受fzd5(f)或ror1(g)经由sirna的干预的调节。*p<0.05。
34.图2a
‑
c.(a
‑
c，上图)实时定量pcr数据，其显示人施莱姆氏管细胞中plcb1、ppp3r1和nfatc3的表达水平受剪切应力(a)、经由sirna的wnt5a干预(b)或wnt5a刺激(c)的调节。(a
‑
c，下图)fluo
‑
4染色的代表性图像和总结的数据，其显示细胞内钙信号受剪切应力(a)、经由sirna的wnt5a干预(b)或wnt5a刺激(c)的调节。绿色：fluo
‑
4，蓝色：dapi核染色。*p<0.05。
35.图3a
‑
b.实时定量pcr数据，其显示人施莱姆氏管细胞中camk2d的表达分别受剪切应力(a)或wnt5a刺激(b)的调节。*p<0.05。
36.图4a
‑
i.总结的数据，其显示人施莱姆氏管细胞的管形成分别在体外被抗ror1抗体(a)，ror1小分子抑制剂、db03208的0.07％乙醇溶液(b)，fzd2 sirna(c)，抗fzd2抗体(d)，抗fzd5抗体(e)，camk2d sirna(f)，plcb1 sirna(g)，ppp3r1 sirna(h)或nfatc3 sirna(i)的干预抑制。同种型对照、乙醇的溶媒对照(0.07％)或乱序sirna分别用作抗体、db03208小分子抑制剂和sirna处理分析的阴性对照。*p<0.05。
37.图5a
‑
b.(a)ror1小分子抑制剂。(b)ror1抗体抑制剂。
38.图6a
‑
b.(a)fzd5抗体抑制剂。(b)fzd2抗体抑制剂。
39.发明的具体实施方式的描述
40.本文描述的实例和实施方案是出于说明性目的的，并且基于其的各种修改或改变对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并将被包括在本发明中。本领域技术人员将认识到可以改变或修改各种非关键参数以产生基本相似的结果。本发明可以排除本文未公开或要求的任何化合物、组分、要素或步骤，或在本文未公开或要求的任何化合物、组分、要素或步骤不存在的情况下实施。除非有相反指示或另外说明，否则在这些描述和整个说明书中，术语“一(a)”和“一(an)”表示一或多。出于所有目的将本文引用的所有出版物、专利和专利申请，包括其中的引文通过引用整体特此并入。
41.公开的wnt5a受体/效应物抑制方法可以是基因操纵和/或给予小干扰rna(sirna)、抗体、小分子等，其中许多可从诸如applied biological materials inc.(abm,richmond bc)、life technologies(thermofisher scientific)、sigma
‑
aldrich等来源商购获得。该方法可单独使用以降低眼内压和预防或治疗青光眼，和/或与其他治疗方法，如滴眼剂、药物、激光、植入装置和手术等组合使用，以预防或治疗青光眼。
42.典型实施例
43.wnt5a确定和靶向
44.我们在wo2019/040311中公开了wnt5a的确定和靶向。
45.wnt5a在培养物中的人原代sc细胞上表达和在小鼠sc上体内表达。如通过定量实
时pcr分析所分析的，wnt5a表达随剪切应力变化而受到调节。我们还证明了wnt5a特异性sirna可以下调人sc细胞中的wnt5a表达，这也影响sc细胞功能。与对照同窝小鼠相比，在青光眼模型中诱导的sc特异性wnt5a基因条件性敲除小鼠iop升高显著降低。在敲除小鼠和对照同窝小鼠之间未发现基线iop的显著差异。与在研究的所有时间点均具有iop升高的对照同窝小鼠相比，wnt5a敲除小鼠仅在早期(24小时内)显示出iop升高，而在后来的时间点没有显示iop升高，表明wnt5a干预下iop升高是不可持续的。我们还证明了wnt5a干预有效保护视网膜神经纤维层并增加sc渗透性，这是增强通过常规流出系统的房水运动来管理眼内高压的靶标(例如tam等人,scientific reports 7:40717,doi:10.1038/srep40717)。这些实验表明，wnt5a是用于青光眼管理的有效治疗靶标。使用huang等人的方法(nature communications,2017；8(1)doi:10.1038/s41467
‑
017
‑
00140
‑
3)，通过crispr基因编辑对wnt5a的选择性抑制进一步证明了这些结果。
46.接下来，我们开发了实验方案来证明wnt5a sirna抑制剂治疗降低iop的功效。对于这些方案，可商业获得wnt5a特异性sirna(人wnt5a sirna,life technologies；anastas等人，j.clin.investig.2014,124,2877
‑
2890)。在一个方案中，如yuen等人(2014,invest ophthalmol vis sci.2014；55:3320
‑
3327)所述进行sirna的结膜下注射。随机选择小鼠接受5ul(0.2lg/ul)sirna或对照的结膜下注射，每周两次，持续2周。在第二个方案中，如tam等人(2017,scientific reports 7,40717)所述进行sirna的前房内注射。通过腹膜内注射麻醉小鼠，并扩大瞳孔。首先使用牵引的钝头微玻璃针刺穿角膜，以抽出房水。穿刺后，立即将连接到10μl注射器的牵引的钝头微玻璃针通过穿孔插入，并将1.5μl含有1μg sirna的pbs给予到前房中。对侧眼睛接受1.5μl包含相同浓度的乱序sirna的相同注射。这些实验证明，通过结膜下注射或前房内注射局部递送的wnt5a特异性抑制剂sirna是用于致病性iop的有效疗法。
47.为了评估通过滴眼剂递送的sirna对iop的作用，我们基于martinez等人的方法(mol ther.2014jan；22(l):81
‑
91)开发了另外的方案，其中新西兰白兔在连续4天的期间内接受局部给予20nmol/天的sirna或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。与溶媒处理组相比，处理的眼睛显示显著的iop降低。第一次给予后2天可检测到sirna对iop的作用，直到最后一次给予后约2天，其值仍在基础水平以下。我们还调整了新西兰白兔的口服水过载模型，以评价wnt5a sirna在例如青光眼中观察到的病理状态下降低iop的作用。最初给予四个不同剂量的sirna(10nmol、20nmol、40nmol和60nmol/眼/天)，共三次：诱发高压前48、24和2小时。所有处理均在双眼中实施，并在诱发高压之前以及口服过载后每20分钟至最长120分钟测量iop。结果分析表明，在所有测试剂量下，wnt5a sirna均提供显著的对抗iop升高的保护。
48.为了证实wnt5a sirna对iop的功效和特异性，在连续4天的期间内，以40nmol/眼/天的剂量处理更大一组动物；在第四天，通过水负载诱导眼内高压。对照结果证明，在用pbs处理的动物中，在诱发高压后的第一小时期间，水负载导致iop升高。通过比较每个时间点的iop值进行的分析表明，与pbs处理的动物相比，用sirna处理在第一小时内显著降低了διορ值。由于使用乱序sirna的处理对iop没有作用，所以该作用具有特异性。
49.我们接下来开发了实验方案以证明wnt5a特异性抗体抑制剂治疗降低iop的功效。这些方案使用两种不同的抗体：在兔纯化的免疫球蛋白缓冲水溶液中产生的抗人wnt5a抗体(sigma
‑
aldrich sab 1411396)和在小鼠克隆6f2腹水中产生的抗人wnt5a单克隆抗体
(sigma
‑
aldrich sab5300183)，但也可以使用其他wnt5a抗体，例如hanaki等人,mol cancer ther 11(2)feb 2012；he等人，oncogene.2005,24(18):3054
‑
3058。这些实验使用小鼠和兔模型(同上)证明通过滴眼剂局部递送的wnt5a特异性抗体抑制剂是用于致病性iop的有效疗法。
50.在示例性模型系统中，在野生型正常小鼠的右眼(od)中诱导眼内高压，并给予wnt5a中和抗体以评估其对iop和青光眼的其他参数的治疗作用，所述青光眼的其他参数包括角膜水肿、视网膜神经节细胞(rgc)死亡和rnfl变薄。与在小鼠右眼中iop显著升高的对照组相比，在wnt5a抗体处理的眼睛中，iop显著更低并保持在基线水平。如通过oct在体内由中央角膜厚度所测量的，wnt5a干预减少了角膜水肿。在iop升高之后，在对照组中观察到角膜厚度增加，但在wnt5a抗体处理的眼睛中未观察到。wnt5a干预减少了处理的眼睛中的rgc死亡以及rnfl变薄。这些分别通过免疫染色和oct检测。这些结果证实，在青光眼小鼠模型中，局部wnt5a抗体干预显著降低iop并保护角膜和视网膜。
51.我们接下来设计实验方案以证明wnt5a特异性拮抗剂肽和小分子抑制剂处理降低iop的功效。这些方案采用了叔丁氧羰基修饰的wnt5a衍生的六肽(box5)，其充当wnt5a的强效拮抗剂(jenei等人,pnas usa,106(46),19473
‑
8)，和6,7
‑
二氢
‑
10α
‑
羟基根赤壳菌素，其为一种强效wnt
‑
5a表达抑制剂，具有相对低的毒性和优异的稳定性(shinonaga等人，bioorg med chem.2009jul l；17(13):4622
‑
35)。这些实验再次使用小鼠和兔模型两者(同上)证明，由滴眼剂局部递送的wnt5a特异性修饰的肽抑制剂和wnt5a表达的小分子抑制剂是用于致病性iop的有效疗法。
52.下游效应物确定和靶向
53.我们接下来证明了fzd5(卷曲蛋白
‑
5)、fzd2和ror1(受体酪氨酸激酶样孤儿受体1)在sc上表达，其表达响应于剪切应力变化、wnt5a刺激或干预而受到调节。此外，其调节可以调节sc功能，例如管形成。特别地，在压力(或增加的剪切应力)下培养的sc细胞中，我们观察到wnt5a和fzd5、fzd2、ror1的增加，当wnt5a下调时，fzd5、fzd2和ror1也下调，并且当我们用wnt5a刺激人sc细胞时，fzd5、fzd2和ror1相应增加。参见图1。
54.此外，我们证明了钙信号传导参与sc功能，并且几种相关分子，例如plcb1(磷脂酶c，β1)、ppp3r1(蛋白磷酸酶3调节亚基b，α)、nfatc3(活化t细胞核因子3)、camk2d(钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶iiδ)响应剪切应力变化、wnt5a刺激或干预而受到调节。参见图2和图3。
55.我们公开了这些wnt受体(即fzd5、fzd2、ror1)和钙信号传导途径的相关分子(即plcb1、ppp3r1、nfatc3、camk2d)提供了调节sc功能和治疗青光眼的靶标。
56.接下来，我们开发了实验方案以证明wnt5a受体sirna抑制剂治疗降低iop的功效。对于这些方案，可商业获得fzd5、fzd2和ror1特异性sirna(例如thermofisher scientific)。在一个方案中，如yuen等人(2014,invest ophthalmol vis sci.2014；55:3320
–
3327)所述进行sirna的结膜下注射。随机选择小鼠接受5ul(0.2lg/ul)fzd5 sirna、fzd2 sirna或ror1 sirna或对照的结膜下注射，每周两次，持续2周。在第二个方案中，如tam等人(2017,scientific reports 7,40717)所述进行fzd5 sirna、fzd2 sirna或ror1 sirna的前房内注射。通过腹腔内注射麻醉小鼠，并扩大瞳孔。首先使用牵引的钝头微玻璃针刺穿角膜，以抽出房水。穿刺后，立即将连接到10μl注射器的牵引的钝头微玻璃针通过穿
孔插入，并将1.5μl含有1μg sirna的pbs给予到前房中。对侧眼睛接受1.5μl包含相同浓度的乱序sirna的相同注射。这些实验证明，通过结膜下注射或前房内注射局部递送的fzd5、fzd2和ror1特异性抑制剂sirna是用于致病性iop的有效疗法。
57.为了评估由滴眼剂递送的sirna对iop的作用，我们基于martinez等人的方法(mol ther.2014jan；22(1):81
‑
91)开发了另外的方案，其中新西兰白兔在连续4天的期间内接受局部给予20nmol/天的fzd5 sirna或fzd2 sirna或ror1 sirna或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。与溶媒处理组相比，处理的眼睛显示显著的iop降低。第一次给予后2天可检测到fzd5 sirna、fzd2 sirna和ror1 sirna对iop的作用，直到最后一次给予后约2天，其值仍在基础水平以下。我们还调整了新西兰白兔的口服水过载模型，以评价fzd5 sirna、fzd2 sirna和ror1 sirna在例如青光眼中观察到的病理状态下降低iop的作用。最初给予四个不同剂量的每种sirna(10nmol、20nmol、40nmol和60nmol/眼/天)，共三次：诱发高压前48、24和2小时。所有处理均在双眼中实施，并在诱发高压之前以及口服过载后每20分钟至最长120分钟测量iop。结果分析表明，在所有测试剂量下，fzd5 sirna、fzd2 sirna和ror1 sirna均提供显著的对抗iop升高的保护。
58.为了证实fzd5 sirna、fzd2 sirna和ror1 sirna对iop的功效和特异性，在连续4天的期间内，以40nmol/眼/天的剂量处理更大一组动物；在第四天，通过水负荷诱导眼内高压。对照结果表明，在用pbs处理的动物中，在诱发高压后的第一小时期间，水负荷导致iop升高。通过比较每个时间点的iop值进行的分析表明，与pbs处理的动物相比，用fzd5 sirna、fzd2 sirna或ror1 sirna处理在第一小时内显著降低了δiop值。该作用是特异性的，因为用乱序sirna处理对iop没有作用。
59.我们接下来开发了实验方案以证明fzd5、fzd2和ror1特异性抗体抑制剂治疗降低iop的功效。这些方案使用omp18r5(一种结合fzd5的人源化单克隆抗体)、abcam ab52565(一种结合fzd2的单克隆抗体)和西妥珠单抗(一种人源化igg1抗ror1单克隆抗体)，但是抗人fzd5、fzd2 sirna和ror1多克隆抗体和单克隆抗体可以从多个来源商购获得，例如thermofisher scientific、abcam、sigmaaldrich等)；关于针对人fzd5的抗体，还参见us9573998。这些实验使用小鼠和兔模型(同上)证明通过滴眼剂局部递送的fzd5、fzd2 sirna和ror1特异性抗体抑制剂是用于致病性iop的有效疗法。
60.在示例性模型系统中，在野生型正常小鼠的右眼(od)中诱导眼内高压，并给予fzd5、fzd2或ror1中和抗体以评估它们对iop和青光眼的其他参数的治疗作用，所述青光眼的其他参数包括角膜水肿、视网膜神经节细胞(rgc)死亡和rnfl变薄。与小鼠右眼中iop显著升高的对照组相比，fzd5、fzd2和ror1抗体处理的眼睛中的iop显著更低。如通过oct在体内由中央角膜厚度所测量的，fzd5、fzd2和ror1干预减少角膜水肿。在iop增加之后，在对照组中观察到角膜厚度增加，但在fzd5、fzd2和ror1抗体处理的眼睛中未观察到。fzd5、fzd2和ror1干预减少了处理的眼睛中的rgc死亡以及rnfl变薄。这些可分别通过免疫染色和/或oct检测。这些结果证实，在青光眼小鼠模型中，局部fzd5、fzd2和ror1抗体干预显著降低iop并保护角膜和视网膜。
61.我们接下来设计实验方案以证明fzd5、fzd2和ror1特异性拮抗剂肽和小分子抑制剂处理降低iop的功效。这些方案采用了突变的fzd5片段，其充当强效的拮抗剂(例如liu等人,hum mol genet.2016apr 1；25(7):1382
–
1391)，和ror1的口服小分子抑制剂
(kan0439834；hojjat
‑
farsangi等人,leukemia 32,p2291
–
2295,2018)。这些实验再次使用小鼠和兔模型两者(同上)证明，由滴眼剂局部递送的fzd5、fzd2和ror1特异性修饰的肽抑制剂和小分子抑制剂是用于致病性iop的有效疗法。
62.在示例性模型中，使用建立已久的具有激光诱导的巩膜上静脉闭塞的青光眼小鼠模型获得了体内数据(zhang l,等人establishment and characterization of an acute model of ocular hypertension by laser
‑
induced occlusion of episcleral veins.invest ophthalmol vis sci.2017aug 1；58(10):3879
‑
3886)。在小鼠右眼(od)中诱导眼内高压，左眼(os)作为对照。在这些实施例中，从在小鼠右眼内诱导眼内高压后的第1天开始，每天通过结膜下注射的局部给予将抑制剂或其对照递送到右眼。左眼用作对照。分别在第3天或第7天通过体内oct测量中央角膜厚度和rnfl。所有体外数据均收集自培养物中的人施莱姆氏细胞。
63.ror1抑制剂
64.1)西妥珠单抗
65.2)kan0439834；hojjat
‑
farsang等人,leukemia.2018oct；32(10):2291
‑
2295.doi:10.1038/s41375
‑
018
‑
0113
‑
1；还参见相关的抑制剂类别：us2018/0002329，通过引用并入本文。
66.3)ror1 sirnas，thermofisher
67.4)ror1抗体，r&d systems，目录号af2000
68.5)ror1小分子，db03208，medkoo biosciences，inc.目录号：564580
[0069][0070]
6)ror1小分子，strictinin；参见：fultang n.等人strictinin,a novel ror1
‑
inhibitor,represses triple negative breast cancer survival and migration via modulation of pi3k/akt/gsk3βactivity.plos one.2019年5月31日；14(5):e0217789。
[0071]
7)ror1阻断肽；参见：https://www.mybiosource.com/blocking
‑
peptide/ror1/544396。
[0072]
8)ari
‑
1，定义为ror1抑制剂；参见：liu x.等人novel ror1 inhibitor ari
‑
1 suppresses the development of non
‑
small cell lung cancer.cancer lett.2019年8月28日；458:76
‑
85。
[0073]
9)ror1
‑
cfab(嵌合抗ror1 fab抗体)；参见：yin z.等人antitumor activity of newly developed monoclonal antibody against ror1 in ovarian cancer cells.oncotarget.2017年10月7日；8(55):94210
‑
94222)。
[0074]
fzd2抑制剂
[0075]
fzd2 sirna，thermofisher
[0076]
fzd2抗体，abcam ab52565
[0077]
fzd5抑制剂
[0078]
fzd5 sirna，thermofisher
[0079]
fzd5抗体，r&d systems af1617
[0080]
camk2d抑制剂
[0081]
camk2d sirna，thermofisher
[0082]
plcb1抑制剂
[0083]
plcb1 sirna，thermofisher
[0084]
ppp3r1抑制剂
[0085]
ppp3r1 sirna，thermofisher
[0086]
nfatc3抑制剂
[0087]
1)nfatc3 sirna，thermofisher
[0088]
重组抗人抗体和变体：
[0089]
2)creativebiolabs重组抗人nfatc3抗体10188
[0090]
3)creativebiolabs重组抗人nfatc3抗体fab片段10189
[0091]
4)creativebiolabs重组抗人nfatc3抗体scfv片段10190
[0092]
人sirna序列
[0093][0094][0095]
*thermofisher scientific sirna基因名称