抗肿瘤多肽及其用途的制作方法

1.本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种抗肿瘤多肽及其用途。


背景技术：

2.多肽是由一种或多种氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，通常由10～100个氨基酸分子脱水缩合而成，它们的分子量<10000da。多肽是蛋白质发挥作用的活性基团，是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质，参与调控各种生理功能，因而在临床应用上具有非常重要的开发价值。
3.活性多肽的来源分为天然活性多肽、基于天然产物的人工修饰多肽以及人工合成的活性多肽。天然多肽的来源十分广泛，可分为动物生物活性多肽和植物多肽。随着科技的发展，天然多肽已经不是唯一的多肽来源，取而代之的是基因重组多肽和化学合成的多肽。
4.生物活性肽的合成方法包括液相合成、固相合成、酶促合成和组合生物合成。液相合成有逐步合成和片段合成2种策略，对于合成较少氨基酸的多肽方便快速，纯度高，且能大量合成。固相合成是将氨基酸的c末端固定在不溶性树脂上，然后依次缩合氨基酸的方法。该方法简化了每一步反应的后处理操作，具有较高产率，缺点是每步中间产物不能纯化，且终产物必须通过可靠的分离手段进行纯化。液相合成和固相合成都属于化学合成，目前开发上市的多肽药物中，90％为化学合成，应用广泛。酶促合成是利用某些特定的酶来催化反应的生物合成方法，反应条件温和、立体专一性强，缺点是存在许多不良反应、酶容易变性失活。组合生物合成是通过对微生物代谢途径中一些酶编码基因进行操作，从而获得新的产物。由于该方法成本昂贵，并且有真核基因表达易形成不恰当折叠及翻译后修饰等问题，从而阻碍了其广泛应用。
5.目前局部癌症虽然可以成功地运用外科手术和放射疗法治疗，但化学疗法仍是常规治疗晚期或转移性肿瘤的首选。由于化疗药物存在选择性低、不良反应大、多药耐药等缺陷，很大程度上限制了其使用。单抗类肿瘤靶向疗法虽然解决了靶向性的问题，但其蛋白分子量大，免疫原性高，易产生过敏及免疫交叉反应，且由于研发成本高，研发难度大，产能有限等原因导致其售价高昂，普通癌症患者很难普及使用，同时单抗类药物存在剂型比较单一，给药方式多为静脉注射或滴注，无法口服等问题，使得药物应用十分不便。
6.抗肿瘤多肽具有其独特的优势:与小分子化学药物相比，对目标肿瘤具有更高的亲和力和更强的特异性，并且不良反应低，还可以增加肿瘤对其他治疗方法的敏感度；与抗体相比，由于它们体积微小，因此更容易渗透到组织中；可以化学合成，并且可以运用多种手段进行化学修饰，有助于设计和研究新型活性多肽。
7.新型抗肿瘤活性多肽具有高亲和力、强特异性、低不良反应的特点，此外大多数还具选择性靶向肿瘤细胞的性质，因而在临床应用上具有非常重要的开发价值，作为抗肿瘤化合物具有较好的前景。但目前已知的抗肿瘤多肽种类有限，还需要进一步的丰富。


技术实现要素：

8.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。本发明提供一种抗肿瘤多肽，该多肽显著抑制人肺癌、肝癌、胶质瘤、乳腺癌、结肠癌细胞增殖，并且显著抑制了肿瘤细胞克隆形成能力，显著抑制人肺癌、肝癌和胶质瘤细胞迁移能力，同时显著抑制小鼠成瘤模型生长，尤其是多肽抑制肺癌作用更加明显。表明该多肽能够作为有效成分用于治疗癌症的药物中。
9.鉴于此，本发明第一方面提出了一种抗肿瘤多肽。根据本发明的实施例，所述抗肿瘤多肽的氨基酸序列包括mdx1vdqsavgfeyqgx2tex3hasqx4gx5tx6x7vqx8epapgapmgx9vtat或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
10.其中，x1、x6、x9分别独立地选自r或q；
11.x2、x3、x4、x5、x7、x8分别独立地选自k或q。
12.基于肿瘤发生特点和治疗难点，发明人创造性地发现一种氨基酸序列如上所示的抗肿瘤多肽，通过进行体内和体外实验，发现该多肽显著抑制人肺癌、肝癌、胶质瘤、乳腺癌、结肠癌细胞增殖，并且显著抑制了肿瘤细胞克隆形成能力，显著抑制人肺癌、肝癌和胶质瘤细胞迁移能力，同时显著抑制小鼠成瘤模型生长，尤其是多肽抑制肺癌作用更加明显。
13.根据本发明的实施例，上述抗肿瘤多肽还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
14.根据本发明的实施例，所述抗肿瘤多肽包括选自seq id no:1
‑
7所示的氨基酸序列中的至少之一。
15.seq id no:1所示的氨基酸序列为：
16.mdqvdqsavgfeyqgktekhasqkgktrkvqkepapgapmgrvtat
17.seq id no:2所示的氨基酸序列为：
18.mdrvdqsavgfeyqgktekhasqkgktrkvqkepapgapmgqvtat
19.seq id no:3所示的氨基酸序列为：
20.mdrvdqsavgfeyqgktekhasqkgktqkvqkepapgapmgrvtat
21.seq id no:4所示的氨基酸序列为：
22.mdqvdqsavgfeyqgktekhasqkgktqqvqkepapgapmgqvtat
23.seq id no:5所示的氨基酸序列为：
24.mdrvdqsavgfeyqgktekhasqqgqtrkvqkepapgapmgrvtat
25.seq id no:6所示的氨基酸序列为：
26.mdrvdqsavgfeyqgqteqhasqkgktrkvqkepapgapmgrvtat
27.seq id no:7所示的氨基酸序列为：
28.mdqvdqsavgfeyqgktekhasqkgktrqvqqepapgapmgrvtat
29.基于肿瘤发生特点和治疗难点，发明人发现seq id no:1
‑
7所示的氨基酸序列，接着对多肽及多肽组合物的抗肿瘤功能进行了研究，在体内和体外水平显示，本发明所涉及的多肽、多肽组合物有抑制肿瘤细胞活性和抑制小鼠成瘤模型生长的重要抗癌功能。本发明为肿瘤治疗开发新的靶点提供实验依据，对于应用于肺癌、肝癌、结直肠癌和胶质瘤等肿瘤的临床治疗具有十分重要的开发应用前景。
30.本发明第二方面提供一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码第
一方面所述的抗肿瘤多肽。
31.本发明第三方面提供一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物含有第一方面所述的抗肿瘤多肽和/或第二方面所述的核酸分子。
32.在本发明提供的药物组合物中，可以含有seq id no:1
‑
7所示的氨基酸序列中的任意一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种。
33.根据本发明的实施例，上述药物组合物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
34.根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的载体。
35.根据本发明的实施例，所述药物组合物的剂型为片剂、注射剂、喷雾剂、胶囊或包衣药丸。
36.本发明第四方面提供第一方面所述的抗肿瘤多肽、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的药物组合物在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗癌症。
37.根据本发明的实施例，所述癌症选自肺癌、肝癌、结肠癌、胶质瘤、乳腺癌中的至少之一。
38.本发明的有益效果：
39.与现有技术相比,本发明基于肿瘤发生特点和治疗难点，通过抗肿瘤基因治疗途径创造性地发现了抗肿瘤多肽，接着对多肽或多肽组合物的抗肿瘤功能进行了研究，通过所述多肽或多肽组合物的治疗，在体内和体外水平显示，本发明所涉及的多肽具有抑制肿瘤细胞活性和抑制裸鼠成瘤模型生长的重要抗癌功能，尤其是多肽抑制结肠癌、肺癌作用更加明显，具备很好的药物用途前景。本发明为肿瘤治疗开发新的靶点提供实验依据，对于应用于肺癌、肝癌、结直肠癌和胶质瘤等肿瘤的临床治疗具有十分重要的开发应用前景。
40.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
41.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
42.图1显示了分别在肺癌细胞h1299、肝癌细胞hepg2、胶质瘤细胞u87、乳腺癌细胞mcf7、结肠癌细胞hct116中，seq id no:1
‑
7和对照组的cck
‑
8实验结果，图中“con”为对照组；
43.图2显示了不同处理组中细胞克隆形成实验结果图，图中“con”为对照组；
44.图3显示了不同处理组中细胞划痕
‑
愈合实验结果图；
45.图4显示了不同处理组中裸鼠皮下成瘤的瘤体大小；
46.图5显示了不同处理组中瘤体体积统计结果，图中“con”为对照组，
47.本发明附图中seq id.1与seq id no:1是指同样的氨基酸序列。
具体实施方式
48.下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解
为对本发明的限制。
49.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
50.术语“任选地”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。由此，限定有“任选地”的特征可以明示或者隐含地包括或不包括该特征。
51.根据本发明的具体实施方案，本发明提供一种抗肿瘤多肽，其氨基酸序列包括mdx1vdqsavgfeyqgx2tex3hasqx4gx5tx6x7vqx8epapgapmgx9vtat或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
52.其中，x1、x6、x9分别独立地选自r或q；
53.x2、x3、x4、x5、x7、x8分别独立地选自k或q。
[0054]“具有至少90％序列同一性”是指其氨基酸序列与前述氨基酸序列具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％相似性。
[0055]“分别独立地选”是指x1‑
x9可选自的氨基酸相互之间互不干扰。
[0056]
根据本发明的实施例，抗肿瘤多肽选自seq id no:1
‑
7所示的氨基酸序列中的至少之一。
[0057]
seq id no:1所示的氨基酸序列为：
[0058]
mdqvdqsavgfeyqgktekhasqkgktrkvqkepapgapmgrvtat
[0059]
seq id no:2所示的氨基酸序列为：
[0060]
mdrvdqsavgfeyqgktekhasqkgktrkvqkepapgapmgqvtat
[0061]
seq id no:3所示的氨基酸序列为：
[0062]
mdrvdqsavgfeyqgktekhasqkgktqkvqkepapgapmgrvtat
[0063]
seq id no:4所示的氨基酸序列为：
[0064]
mdqvdqsavgfeyqgktekhasqkgktqqvqkepapgapmgqvtat
[0065]
seq id no:5所示的氨基酸序列为：
[0066]
mdrvdqsavgfeyqgktekhasqqgqtrkvqkepapgapmgrvtat
[0067]
seq id no:6所示的氨基酸序列为：
[0068]
mdrvdqsavgfeyqgqteqhasqkgktrkvqkepapgapmgrvtat
[0069]
seq id no:7所示的氨基酸序列为：
[0070]
mdqvdqsavgfeyqgktekhasqkgktrqvqqepapgapmgrvtat
[0071]
本发明的抗肿瘤多肽不限于某一种单一的多肽，还包括这些多肽的任意组合。例如抗肿瘤多肽的氨基酸序列为seq id no:1和seq id no:3所示的氨基酸序列，或者抗肿瘤多肽的氨基酸序列为seq id no:1和seq id no:5所示的氨基酸序列，或者抗肿瘤多肽的氨基酸序列为seq id no:3、seq id no:5、seq id no:7所示的氨基酸序列等。
[0072]
本发明提供的抗肿瘤多肽或多肽组合物可以通过固相合成的方式，或者通过分子克隆技术，获得表达该多肽的表达载体，从而获取抗肿瘤多肽或多肽组合物。
[0073]
发明人对seq id no:1
‑
7所示的氨基酸序列的抗肿瘤功能进行了研究，在体内和体外水平显示，本发明所涉及的多肽、多肽组合物有抑制肿瘤细胞活性和抑制小鼠成瘤模
型生长的重要抗癌功能。本发明为肿瘤治疗开发新的靶点提供实验依据，对于应用于肺癌、肝癌、结直肠癌和胶质瘤等肿瘤的临床治疗具有十分重要的开发应用前景。
[0074]
根据本发明的具体实施方案，本发明提供一种核酸分子。该核酸分子编码mdx1vdqsavgfeyqgx2tex3hasqx4gx5tx6x7vqx8epapgapmgx9vtat或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中，x1、x6、x9分别独立地选自r或q；x2、x3、x4、x5、x7、x8分别独立地选自k或q。该核酸分子可以为dna或rna。
[0075]
根据本发明的具体实施方案，本发明提供一种药物组合物该药物组合物含有前面的抗肿瘤多肽和/或前面的核酸分子。
[0076]
药物组合物可以为多肽类药物，其含有前面的抗肿瘤多肽，或者也可以为核酸类药物，其含有前面的表达抗肿瘤多肽的核酸分子。药物组合物也可以是抗肿瘤多肽与表达抗肿瘤多肽的核酸分子的组合。
[0077]
在本发明提供的药物组合物中，可以含有seq id no:1
‑
7所示的氨基酸序列中的任意一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种。
[0078]
根据本发明的具体实施方案，药物组合物进一步包括药学上可接受的载体。
[0079]
根据本发明的具体实施方案，药物组合物的剂型可以为片剂、注射剂、喷雾剂、胶囊或包衣药丸。且本发明中药物组合物的剂型并不限于此，也可以根据需要，改变为药学领域的其他的剂型。
[0080]
根据本发明的具体实施方案，前面的抗肿瘤多肽、编码抗肿瘤多肽的核酸分子、药物组合物可以用于制备治疗癌症的药物。癌症选自肺癌、肝癌、结肠癌、胶质瘤、乳腺癌中的至少之一。
[0081]
为探究发明人发现的抗肿瘤多肽抑制肿瘤的效应，进行了以下相关探究：
[0082]
多肽抗肺癌、肝癌、结肠癌和胶质瘤功能体外验证研究；通过cck8和克隆形成实验研究肽段序列对细胞增殖能力的影响；通过划痕实验研究肽段序列对细胞迁移能力的影响。
[0083]
并且发现该多肽显著抑制人肺癌、肝癌、胶质瘤、乳腺癌、结肠癌细胞增殖，并且显著抑制了肿瘤细胞克隆形成能力，显著抑制人肺癌、肝癌和胶质瘤细胞迁移能力，同时显著抑制小鼠成瘤模型生长，尤其是多肽抑制肺癌作用更加明显。
[0084]
本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0085]
实施例1多肽工作液的配制
[0086]
通过金斯瑞生物科技公司合成多肽seq id no:1
‑
7，分别将不同序列的肽段加入0.01mpbs中，配制成10x肽段工作液(浓度为500ng/ml)。
[0087]
多肽seq id no:1
‑
7序列如下表1所示：
[0088]
表1
[0089]
编号序列seq id no:1mdqvdqsavgfeyqgktekhasqkgktrkvqkepapgapmgrvtat
seq id no:2mdrvdqsavgfeyqgktekhasqkgktrkvqkepapgapmgqvtatseq id no:3mdrvdqsavgfeyqgktekhasqkgktqkvqkepapgapmgrvtatseq id no:4mdqvdqsavgfeyqgktekhasqkgktqqvqkepapgapmgqvtatseq id no:5mdrvdqsavgfeyqgktekhasqqgqtrkvqkepapgapmgrvtatseq id no:6mdrvdqsavgfeyqgqteqhasqkgktrkvqkepapgapmgrvtatseq id no:7mdqvdqsavgfeyqgktekhasqkgktrqvqqepapgapmgrvtat
[0090]
实施例2 cck8实验验证
[0091]
使用cck
‑
8检测试剂盒(dojindo)研究seq id no:1
‑
7不同多肽对细胞增殖的影响。简而言之，将细胞以每孔2
×
103个细胞的浓度接种到96孔板中，并分别与多肽孵育24、48、72h。在指定的时间点，添加10μl cck
‑
8分析试剂，并将平板再温育4h。使用spectramax m5酶标仪(molecular devices)来测量450nm处的吸光度。分别检测了肺癌细胞h1299、肝癌细胞hepg2、胶质瘤细胞u87、乳腺癌细胞mcf7、结肠癌细胞hct116，对照组为pbs。结果如附图1所示，图中显示了在上述5种肿瘤细胞，不含有本发明中多肽的对照组，肿瘤细胞增殖最快，而seq id no:1
‑
7这7种多肽均不同程度上抑制了肿瘤的增殖。表明seq id no:1
‑
7这7种多肽显著抑制人肺癌、肝癌、胶质瘤、乳腺癌、结肠癌细胞增殖的作用，这些肽段不同程度的抑制了肿瘤细胞增殖。
[0092]
cck
‑
8实验统计结果如下表2所示，其中表中显示的百分数为与对照组相比，不同多肽在不同肿瘤细胞中的抑制率：
[0093]
表2
[0094][0095]
实施例3软琼脂形成实验
[0096]
将实施例1中获得的seq id no:1
‑
7肽段工作液稀释后(浓度为50ng/ml)，处理细胞，收集对数生长期的肿瘤细胞(肺癌细胞h1299、肝癌细胞hepg2、胶质瘤细胞u87)，制成细胞悬液，pbs作为对照。取培养瓶每个瓶中加入调整好浓度的细胞悬液，然后各加入琼脂，混匀。取培养板，每孔加细胞琼脂悬液，将各组加好。在室温放置至细胞琼脂悬液凝固。然后移培养板于培养箱中37℃进行培养。培养14天，肉眼观察并计数细胞集落。结果如附图2所示，能够明显看出seq id no:1
‑
7肽段组中，肿瘤细胞克隆形成能力受到了抑制，说明seq id no:1
‑
7肽段具有显著抑制人肺癌、肝癌、胶质瘤细胞增殖能力，肽段不同程度的抑制了肿瘤细胞克隆形成能力。
[0097]
实施例4细胞划痕
‑
愈合实验(scratch
‑
healing)
[0098]
在6孔板背后以0.5～1cm一道划线，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。然后将seq id no:1
‑
7肽段工作液稀释后(浓度为50ng/ml)处理的细胞(肺癌细胞h1299、肝癌细胞hepg2、胶质瘤细胞u87)接种到6孔板中，接种数量为5
‑
10*105个细胞。第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。用pbs漂洗细胞3次，去除划下的细胞，加
入无血清培养基(gibco)，放入37度5％co2培养箱，培养。按0、6、12、24小时取样，拍照，并统计细胞迁移能力，pbs作为对照组。结果如附图3所示，结果显示本发明中seq id no:1
‑
7多肽具有显著抑制人肺癌、肝癌和胶质瘤细胞迁移能力，且不同的肽段具有不同程度的抑制肿瘤细胞迁移能力。
[0099]
实施例5裸鼠皮下成瘤实验
[0100]
通过裸鼠(5周龄)进行皮下成瘤实验，实验分为：对照组(pbs)与多肽处理组(seq id no:1
‑
7肽段)，每组5只，处理方法为：将不同组别的细胞用胰酶消化后，收集到一起。无血清的培养基gibco洗涤一次后进行细胞计数。将计数好的细胞用无血清的培养基重悬调整细胞密度为5
×
107/ml待用。将h1299和hepg2细胞接种于实验裸鼠皮下，接种后将不同组别的裸鼠分笼饲养，定期喂水和饲料，定期更换垫料。待成瘤后从第3天、7天和10天按照分别以20mg/kg的浓度对瘤体进行注射，30天处死小鼠，拍照，剥离肿瘤组织并计算瘤体大小。结果如图4和5所示，图4显示了不同处理组中裸鼠皮下成瘤的瘤体大小，图5显示了不同处理组中瘤体体积统计结果，结果表明，本发明中seq id no:1
‑
7多肽具有显著抑制小鼠成瘤模型生长的作用，尤其是多肽抑制肺癌作用更加明显。
[0101]
瘤体大小统计结果如下表3所示，其中表中显示的百分数为与对照组相比，瘤体体积减小的百分数。
[0102]
表3
[0103][0104]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0105]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。