一种抗AFP的纳米抗体1B9及其应用的制作方法

一种抗afp的纳米抗体1b9及其应用
技术领域
1.本发明公开了一种纳米抗体，属于免疫学领域。


背景技术：

2.肝细胞性癌(hepatocellular carcinoma，hcc)，是世界第五大癌症，我国发病人数约占全球55％，在我国所有肿瘤的死亡率中排行第2，仅次于肺癌。甲胎蛋白(甲种胎儿蛋白，α
‑
fetoprotein，afp)最早是由bergstrandh和czar在人胎儿血淸中发现，是目前应用最广泛的hcc肿瘤标志物，被普遍应用于相关疾病的检查。afp是一种糖蛋白，属于白蛋白家族，分子量为69kda，一般情况下afp主要由胚胎肝脏细胞分泌而来。因为其糖链结构的差异，afp分子存在差异性，目前认为至少有三种异质体(afp2l1，afp2l2，afp2l3)。afp存在于人血清中，来源于早期胎儿的肝脏和卵黄囊，孕期4周即可在胎儿血清中检测到，最高可达l～3g/l，出生时仍高达60～120mg/l，出生后合成很快受到抑制，含量降至50μg/l，一周岁婴儿的血清afp浓度水平接近成人。健康成人血清中afp主要由肝脏产生，生理功能尚不清楚，可能与维持正常妊娠、调节脂肪酸进入胎儿体内及免疫抑制有关。正常成年人血清afp水平非常低，一般低于10μg/l。肝细胞癌变时，afp水平随着疾病进展会显著升高。目前，我国建议的临界值上限为20μg/l。afp是我国目前在临床唯一推荐常规使用的肝细胞癌肿瘤标志物，同时结合超声检查，对无症状的高危人群进行筛查，是临床早期发现肝癌患者的最常用方法。随着医疗水平的不断提高，肝细胞癌的诊断和治疗水平不断进步，但肝细胞癌的临床死亡率仍居高不下。究其原因，与肝细胞癌发病隐匿，自觉症状不明显，造成就医确诊晚有关。提高肝细胞癌患者早期诊断率，同时在治疗过程中通过有效的方法手段进行监测是提高肝细胞癌治疗质量和生存率的关键所在。基于以上原因，目前首要任务是建立简单、快速、有效的检验方法。
3.不仅如此，自上世纪90年代以来，研究者利用afp作为载药载体，运输抗癌药物，如阿霉素、柔红霉素、顺铂、甲氨蝶呤等成为热门研究内容，通过胞吞作用将上述药物选择性转运至肿瘤细胞中，起到治疗作用。此外，meng和sauzay等研究发现，afp可以与肝癌细胞膜上的受体结合，进而激活ca
2
和pi3/akt等信号通路，通过上调c
‑
fos、srs、c
‑
jun、ras等癌基因的表达，促进肝癌细胞的增殖(meng wenbo等，the immunosuppression role of alpha
‑
fetoprotein in human hepatocellular carcinoma，discovery medicine，2016年21卷118期；chlo
éꢀ
sauzay等，alpha
‑
foetoprotein(afp):a multi
‑
purpose marker in hepatocellular carcinoma，clinica chimica acta，2016年463卷)。因此，afp无论是在疾病的诊断、靶向治疗还是后期的预后监测方面都发挥着巨大的作用。
4.鉴于癌症生物标志物在癌症的早期诊断和治疗预后中起着重要的作用，其敏感检测在过去几十年里引起了巨大的研究浪潮。免疫分析就是其中一种检测方法。由于其特异性和稳定性的优势，已被广泛应用于癌症生物标志物的敏感检测，并用于基础研究和临床检测。目前，已开发出了多种类型的免疫分析方法：包括电泳免疫分析法、酶联免疫吸附分析法、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法、比色法免疫分析法、质谱免疫分析法、表面拉
曼增强光谱免疫分析。化学发光免疫分析法的灵敏度和精确度比酶联免疫吸附法、荧光法高几个数量级，且具有方法稳定快速、检测范围宽、操作简单、自动化程度高等优点，可用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等相关物质的检测分析。目前afp检测方法大多使用的为传统抗体(鼠源单克隆抗体、兔源多克隆抗体以及山羊抗体)，这些抗体具有分子量大，稳定性差等不足的特点，使得afp检测灵敏度受到了一定的限制。
5.基于afp在临床诊断、治疗和预后方面所表现出的突出特性，研发出针对afp的特异性结合抗体显得尤为重要。
6.纳米抗体是一类仅有重链的抗体(heavy chain only like antibody，hcabs)，而它们的抗原结合部位由一个结构域组成，称为vhh区，因此该类抗体也被称为单结构域抗体或者单域抗体(sdab)。由于该类抗体为去除恒定区后的可变区序列，分子量只有15kda，大约10纳米的直径，因此被称为纳米抗体(nbs)。这种仅有重链的抗体原来只是作为一种人类b细胞增生性疾病(重链病)的病理形式被人们所认识，在骆驼科动物(骆驼，单峰骆驼和美洲驼)的体内也发现了一类仅有重链二聚体(h2)的抗体，这种仅有重链的抗体可能是由于基因组水平的突变和缺失而导致重链ch1结构域不能表达，使得表达出的重链缺乏ch1，从而缺乏与轻链的结合能力，因此形成一种重链二聚体。
7.相对于常规的四链抗体的scfv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scfv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及dna操作、文库构建和3
‑
d结构测定的容易性方面超越scfv。
8.纳米抗体有来源于成年骆驼体内hcabs的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点相互作用，使之作用类似于抑制剂。因此，纳米抗体可以为从肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链，纳米抗体的制造较单克隆抗体容易。纳米抗体的独特性质，如处于极端温度和ph环境中的稳定性，可以低成本制造大产量。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。
9.本发明的目的就是提供一种能够充分发挥纳米抗体的优越性能，既具有优异的特异性抗原结合能力，又能克服传统抗体实体肿瘤渗透性差，靶向效应低等固有缺陷的抗afp的纳米抗体，并进一步提供其在afp抗原的免疫检测特别是双抗体夹心法中的应用。


技术实现要素：

10.基于上述发明目的，本发明首先提供了一种抗afp的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区cdr1、cdr2、cdr3，其中，cdr1的氨基酸序列如seq id no.1所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no.2所示，cdr3的氨基酸序列如seq id no.3所示。
11.在一个优选的技术方案中，所述纳米抗体的可变区的氨基酸序列如seq id no.4所示。在本发明中具有该可变区序列的纳米抗体的一个优选实施例为纳米抗体1b9。
12.其次，本发明还提供了一种编码所述纳米抗体的多核苷酸，所述多核苷酸的序列由seq id no.5所示。
13.第三，本发明提供了一种含有上述多核苷酸的表达载体，所述表达载体为pmes4。
14.第四，本发明提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。
15.最后，本发明还提供了上述纳米抗体在制备免疫法检测afp试剂盒中的应用。
16.在一个优选的实施方案中，所述免疫法为双抗体夹心法，其中第一抗体为上述的纳米抗体；第二抗体为可变区序列由seq id no.6所示的纳米抗体。
17.更为优选地，所述第一抗体为二价纳米抗体。
18.尤为优选地，所述二价纳米抗体由单价纳米抗体的可变区羧基端与抗体铰链区的氨基端相连接，氨基酸序列如seq id no.7所示。
19.在本发明的一个具体实施方案中，所述检测试剂盒为磁珠化学发光法免疫检测试剂盒，所述二价纳米抗体是生物素化的二价纳米抗体，所述试剂盒还包括链霉亲和素化磁珠。
20.本发明提供的用于双抗体夹心法检测afp的纳米抗体组合在afp抗原检测中显示出高效的性能，其中作为捕获抗体的抗afp二价纳米抗体1b9
‑
lhc由于添加了抗体铰链区，可在周质空间自发形成二硫键形成二价抗体，具有单价纳米抗体双倍的抗原结合位点，相比单价纳米抗体对afp抗原具有更高识别和结合能力。经过检测反应体系的优化调试后，其反应性、最低检测限和准确度均有大幅度提升。本发明提供的抗afp二价纳米抗体1b9
‑
lhc与抗afp单价纳米抗体1c5
‑
hap的抗体组合具有优异的匹配度，在对afp抗原的检测中显示出优异的p/n值、最低检测限和准确度，可满足临床样本中的afp的检测。
附图说明
21.图1.纳米抗体1b9和1b9
‑
lhc纯化sds
‑
page图；
22.图2.纳米抗体1b9和1b9
‑
lhc亲和力测试曲线图；
23.图3.生物素化1b9和1b9
‑
lhc亲和力测试曲线图。
具体实施方式
24.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
25.实施例1.抗afp单价纳米抗体的制备
26.制备方法参照中国发明专利申请cn113173994a中的实施例1
‑
2。所得单价纳米抗体1b9的重链核苷酸序列为seq id no.5所示，可变区氨基酸序列为seq id no.4所示，其中第1
‑
25位氨基酸序列为fr1，第26
‑
33位氨基酸序列为cdr1，第34
‑
50位氨基酸序列为fr2，第51
‑
57位氨基酸序列为cdr2，第58
‑
95位氨基酸序列为fr3，第96
‑
111位氨基酸序列为cdr3，第112
‑
122位氨基酸序列为fr4。将表达纯化后的纳米抗体1b9进行sds
‑
page检测(图1：m为彩虹光谱蛋白marker；1为大肠杆菌诱导表达纯化后的纳米抗体1b9；2为大肠杆菌诱导表达纯化后的纳米抗体即1b9
‑
lhc)。
27.实施例2.抗afp二价纳米抗体的制备
28.2.1 1b9
‑
lhc
‑
pmes4载体构建
29.在纳米抗体1b9的可变区羧基端添加抗体铰链区。铰链区氨基酸序列为seq id no.8所示，核酸序列为seq id no.9所示。由于铰链区较长，设计两个下游引物，进行两轮pcr，操作如下：以单价纳米抗体dna作为模版进行第一轮pcr，引物序列如下：
30.f1:aactgcaggagtctggaggagg
31.r1:cggctgcggttgcggttgaggctgcggctgcggtttcggggttttcggttctgaggagacggtgacctg
32.pcr反应条件及程序为：95℃5分钟；95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃7分钟。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收300bp左右的条带。以第一轮pcr回收产物为模板进行第二轮pcr，引物序列如下：
33.f1:aactgcaggagtctggaggagg
34.r2:ggactagtgatggtgatggtggtgcggacatttgctttcggtggtcggattcggctgcggttgcggttg
35.pcr反应条件及程序为：95℃5分钟；95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，15个循环；72℃7分钟。使用pcr产物回收试剂盒纯化pcr产物。
36.将pmes4(购自biovector)与第二次pcr产物分别进行pst i和spe i双酶切，取1.5μg酶切后载体和450ng酶切后的第二次pcr产物，加1.5μl t4 dna连接酶，补充缓冲液和水至10μl总体积，16℃过夜连接。
37.2.2 1b9
‑
lhc的诱导表达
38.将连接产物10μl转化于100μl shuffle感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上放置30分钟，42℃水浴热激90秒，冰浴冷却3分钟。向离心管加入600μl lb培养基，37℃振荡培养60分钟。取上清100μl，用三角涂布器涂布在lb
‑
a平板上，37℃倒置培养过夜。挑取上述10个单克隆菌落于lb
‑
a培养基中，37℃振荡培养过夜，送测序，正确核酸序列参考seq id no.10。选择测序正确的菌株进行诱导表达。取该菌液按照1:100比例加入100ml新鲜lb
‑
a培养基，37℃振荡培养3小时至菌液od
600
＝0.8左右，加入终浓度为1mm iptg，30℃诱导过夜。第三日，8000rpm，离心10分钟收集菌体，加入1.5ml的预冷tes缓冲液重悬沉淀。冰浴2分钟后，轻柔振荡30秒，重复此循环6次。加3.0ml tes/4(将tes用水稀释4倍)，轻柔振荡30秒后，冰浴静置2分钟，同样重复振荡和静置步骤共6次。9000rpm，4℃离心10分钟，收集约4.5ml的上清(周质提取物)，将上清进行蛋白电泳分析。
39.2.3 1b9
‑
lhc的纯化和鉴定
40.将imac sepharose(ge公司)重悬后，取2ml加入到重力柱内，静置30分钟，使sepharose自然沉降于重力柱底部，流出保存缓冲液。加入2倍柱体积的硫酸镍溶液(0.1m)，按照约8秒/滴的流速流出硫酸镍溶液；加入10倍柱体积的平衡缓冲液平衡并洗涤sepharose，流速维持不变；将样品使用平衡缓冲液2倍稀释后，加入重力柱中，调节流速为6秒/滴，收集穿透液；加入10倍柱体积洗涤缓冲液洗涤sepharose，维持流速不变，收集洗涤液；加入3倍柱体积的洗脱缓冲液，流速维持在6秒/滴，收集含有目的蛋白的洗脱液；最后依次加入10倍柱体积的平衡缓冲液、10倍柱体积的纯水和10倍柱体积的20％乙醇洗涤sepharose，并最终保留4ml的20％乙醇来保存柱子。上述收集的样品分别进行sds
‑
page检测(图1：m为彩虹光谱蛋白marker；1为大肠杆菌诱导表达纯化后的纳米抗体1b9；2为大肠杆菌诱导表达纯化后的纳米抗体即1b9
‑
lhc)。所述二价纳米抗体的氨基酸序列如seq id no.7所示。
41.实施例3.纳米抗体与抗原的亲和活性测定
42.3.1芯片抗原偶联
43.将抗原用不同ph的醋酸钠缓冲液(ph 5.5，ph 5.0，ph 4.5，ph 4.0)配制成20μg/
ml的工作液，同时准备50mm的naoh再生溶液，利用biacore t100蛋白相互作用分析系统仪器中的模板方法对不同ph条件的抗原与芯片(ge公司)表面之间的静电结合进行分析，以信号增加的量达到5倍rl为标准，选择合适的最偏中性的ph体系并根据需要调整抗原浓度作为偶联时的条件。按照仪器中自带的模板方法对芯片进行偶联：其中1通道选择空白偶联模式，2通道选择target偶联模式，目标设置为设计好的理论偶联量。偶联过程大概耗时60分钟。
44.3.2分析物浓度设置条件探索及再生条件优化
45.采取手动进样模式，选择1，2通道2
‑
1模式进样，流速设置为30μl/分钟。进样条件均为120秒，30μl/分钟。再生条件均为30秒，30μl/分钟。首先持续空走运行缓冲液直至所有基线均稳定。准备浓度跨度较大的纳米抗体溶液，以运行缓冲液配置，建议设置200μg/ml，150μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，20μg/ml，10μg/ml，2μg/ml。准备再生溶液，选择谷氨酸盐酸体系四个ph梯度的再生溶液：1.5，2.0，2.5，3.0。手动进样200μg/ml分析物样品，观察2通道，从最偏中性ph的再生缓冲液进行再生，直至2通道再生后的响应线回到与基线同一高度。再手动进样一次200μg/ml分析物样品，观察2
‑
1通道的信号变化并记录结合量，用上一步中最后使响应线回到基线的再生溶液进行再生后，再次收手动进样200μg/ml分析物样品，观察2
‑
1通道的信号变化并记录结合量与刚才的结合量数值对比，若偏差小于5％，即认为此ph的再生溶液为最佳的再生溶液，若再次进样的结合量偏低，则继续以更低ph的再生缓冲液进行实验。以选择的最佳再生溶液，作为每次进样后的芯片表面再生试剂。分别进样上面设置的分析物浓度样品，并对每个浓度的结合量进行分析，最终确定亲和力测试所需的浓度梯度。
46.3.3亲和力测试
47.按优化好的样品浓度梯度，再生溶液，使用仪器自带的模板方法(其中设置进样条件为60秒，30μl/分钟；解离时间：600秒；再生条件：30秒，30μl/分钟)对纳米抗体及抗原之间的亲和力进行测试。随时观察2
‑
1通道的信号情况。亲和力测试过程大概耗时200分钟。在具体实验中，将芯片上的纳米体俘获到适当的信号值，然后用系统运行缓冲液hbs
‑
ep(10mm hepes，150mm nacl，3mm edta，0.05％p20)以30μl/分钟的流速注射到芯片上，获得纳米抗体与抗原相互作用的动态过程。分别使用该方法测试了纳米抗体1b9、1b9
‑
lhc与抗原结合解离的能力。
48.3.4结果分析
49.选择合适的几个浓度梯度的结合解离曲线采用1:1binding的模式对所有曲线进行拟合，最终得到亲和力数值及结合常数和解离常数等重要参数(见表1和图2)。筛选的单价/二价纳米抗体亲和力均达到10
‑
11
以上。
50.表1：单价/二价纳米抗体亲和力数据
51.样品编号结合常数解离常数亲和力1b97.132e 67.482e
‑
51.049e
‑
111b9
‑
lhc6.887e 61.246e
‑
51.809e
‑
12
52.实施例4.抗afp纳米抗体的elisa叠加数据分析
53.将纳米抗体1b9与中国发明专利申请cn113173994a中公开的纳米抗体1a7和中国发明专利申请cn113214399a中公开的纳米抗体2f5以及中国发明专利申请cn113234166a中
公开的纳米抗体1c5进行elisa抗原表位分析，分析方法参照中国发明专利申请cn113173994a中的实施例4，结果见表2。1b9与其他三株纳米抗体分别针对afp抗原不同的抗原表位，这预示着在afp的检测应用上，1b9与其他三株纳米抗体组成检测抗体对的几率大大增加，从而可以增大检测效率。
54.表2：抗原抗体表位叠加实验结果
[0055] 1st抗体2nd抗体1st抗体 2nd抗体叠加率1b9 1a70.3230.7280.90984.38％1b9 2f50.3230.6630.89589.83％1b9 1c50.3230.8251.354115.21％
[0056]
实施例5.利用biacore分析纳米抗体1b9结合位点
[0057]
将纳米抗体1b9与中国发明专利申请cn113173994a中公开的纳米抗体1a7和中国发明专利申请cn113214399a中公开的纳米抗体2f5以及中国发明专利申请cn113234166a中公开的纳米抗体1c5进行biacore抗原表位分析，分析方法参照中国发明专利申请cn113173994a中的实施例5，结果见表3。1b9纳米抗体与其他三株纳米抗体均识别不同抗原位点，该结果与elisa叠加实验推测的结果一致。更加验证了抗afp纳米抗体1b9在afp检测领域的应用前景。
[0058]
表3：biacore检测纳米抗体叠加实验ru值变化表
[0059][0060]
实施例6.生物素化抗afp纳米抗体的制备
[0061]
将纳米抗体1b9与1b9
‑
lhc进行生物素化，具体操作参照中国发明专利申请cn111004328a中的实施例4。将生物素化后的抗体先用镍柱纯化，各得到30ml洗脱液，再通过分子筛进一步纯化。按照实施例3的方法对生物素化单价/二价纳米抗体进行亲和力测试，数值见表4和图3。
[0062]
表4.生物素化单价/二价纳米抗体亲和力数据
[0063]
名称亲和力数值bio
‑
1b95.977e
‑
11bio
‑
1b9
‑
lhc8.178e
‑
12
[0064]
实施例7.抗afp纳米抗体在检测试剂盒中的应用
[0065]
参照中国发明专利申请cn113234166a的说明书公开内容，所述纳米抗体1c5的可变区序列如seq id no.6所示。该专利申请中的实施例5通过柔性多肽与纳米抗体相融合成为带有化学发光区序列的纳米抗体1c5
‑
hap，其氨基酸序列如seq id no.11所示，经测试，1c5
‑
hap亲和力数值为1.864e
‑
10。选取生物素化纳米抗体1b9(二价/单价)为捕获抗体，
1c5
‑
hap为检测抗体，进行双抗体夹心免疫法检测血清标本中的afp抗原，本方法使用的是磁珠化学发光法，具体过程如下：
[0066]
取生物素化纳米抗体(1μg/ml)80μl/孔，afp质控品(罗氏化学发光afp诊断试剂盒质控品10ng/ml)或者阴性血清30μl/孔，1c5
‑
hap(3μg/ml)80μl/孔，三者混匀，置于96孔微孔板中，37℃温育15分钟；加入洗涤液，300μl/孔，混匀，置于磁力架上静止3分钟，吸弃上清，重复以上洗涤步骤4次；加入链霉亲和素化磁珠(购自jsr)(0.3mg/ml)80μl/孔，混匀，37℃温育15分钟；重复上述洗涤5次；加入ap化学发光显色液(bm chemiluminescence elisa substrate)100μl/孔，在摇床上摇动3～5秒，选择酶标仪程序luminescence，测定各孔读值。数据见表5。
[0067]
7.1 p/n的检测：阳性质控品(10ng/ml)的检测值与阴性血清测值的比值；
[0068]
7.2最低检测限的检测：用零浓度校准品或样本稀释液作为样本进行检测，重复测定20次，计算20次测量结果的数值，计算其平均值(m)和标准差(sd)，得出m 2sd，即为最低检测限。
[0069]
7.3准确度(回收率)的检测：将浓度约为50ng/ml(允许偏差
±
10％)的抗原(afp)液(a)加入到浓度范围在2ng/ml～5ng/ml的血清b中，所加入afp与血清b之间的体积比例为1:9，根据公式(1)计算结果。
[0070][0071]
式中：r
‑‑‑
回收率；
[0072]
v
‑‑‑
加入a液体积；
[0073]
v0
‑‑‑
血清样品b的体积；
[0074]
c
‑‑‑
血清样品加入a液后的检测浓度；
[0075]
c0—血清样品b的检测浓度；
[0076]
cs
‑‑‑
a液的浓度
[0077]
7.4参考中国发明专利cn113234166a，1a7或2f5作为捕获抗体，1c5
‑
hap作为检测抗体进行配对检测血清中的afp抗原，r2均大于0.99，取得了优异的检测效果，其结果见表5。其中1a7和1c5
‑
hap的抗体组合线性指数高于2f5和1c5
‑
hap的抗体组合，所以后续将以1a7和1c5
‑
hap的抗体组合作为参照，用于评价抗体配对的效果。
[0078]
表5.1a7 1c5
‑
hap和2f5 1c5
‑
hap配对数据对比
[0079]
捕获抗体检测抗体线性指数(r2)1a71c5
‑
hap0.99792f51c5
‑
hap0.9935
[0080]
7.5本专利针对1b9和1c5
‑
hap这对抗体组合进行二价纳米抗体构建并生物素化，进行配对检测，并与1a7和1c5
‑
hap这对抗体组合进行对比。结果见表6。
[0081]
表6.单价/二价纳米抗体配对检测结果
[0082][0083]
结果表明，二价纳米抗体bio
‑
1b9
‑
lhc与1c5
‑
hap反应的p/n值、最低检测限、准确度均优于单价纳米抗体以及其他类型的纳米抗体组合。