一种维拉帕米在制备保护软骨细胞缓解骨关节炎的产品中的应用的制作方法

1.本发明涉及医药领域，具体地涉及维拉帕米的保护软骨细胞缓解骨关节炎用途。


背景技术：

2.骨关节炎(osteoarthritis,oa)是一种不可逆的退变性疾病，且伴随着关节软骨的渐进性破坏。目前，全球约7％的人口受oa影响，而女性受到的影响更为严重。最新的研究数据显示，在过去的30年里，全世界范围内受oa影响的人数增加了48％，而在2019年的统计数据里oa是全球第15大致残因素，其致残人数占全球总致残人数的2％。随着人口老龄化的发展以及日益增加的肥胖人群可能会加剧这一问题。因此，重视与加强对oa的研究与探索已刻不容缓。目前，临床上针对退变性oa早期轻症的病人建议健康宣教，康复锻炼，体重控制和一些非甾体类抗炎药以及关节内药物注射等对症治疗；针对退变晚期，疼痛较重，功能障碍明显的病人则建议手术治疗。oa的发生发展是一个复杂的过程，其中涉及多种因素，包括遗传特质，衰老，慢性炎症以及氧化应激等。由于对oa内在机制的研究尚不明确，现阶段仍缺乏能从中阻断oa进展的特效药物。
3.在临床以及基础研究中均能发现oa病理生理过程中软骨组织的改变尤为明显，因此软骨细胞的代谢、分化成熟以及软骨基质的分泌则是研究oa内在机制的关键点。因此，研究临床可以应用药物对软骨细胞的保护具有非常重要的临床诊疗和基础科研价值。


技术实现要素：

4.本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种安全且有效的维拉帕米在制备保护软骨细胞缓解骨关节炎的产品中的应用。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
6.在本发明的第一方面，提供了一种维拉帕米、或其光学异构体、或其药学上可接受的盐的用途，其被用于制备一种组合物或制剂，所述组合物或制剂用于保护软骨细胞缓解骨关节炎。
7.在另一优选例中，所述组合物或制剂用于选自下组的一种或多种应用：
8.(i)促进关节软骨细胞基质表达；
9.(ii)减少细胞内txnip表达水平；
10.(iii)降低氧化应激对软骨细胞的损伤，或改善软骨细胞的生理状态；
11.(iv)降低炎症刺激对软骨细胞的损伤，或改善软骨细胞的生理状态；
12.(v)增加关节软骨厚度，减缓骨关节炎的发展；
13.(vi)提高关节软骨的应激与修复能力。
14.在另一优选例中，所述组合物为药物组合物、保健品组合物、膳食补充剂或食品组合物。
15.在另一优选例中，所述的制剂包括膳食补充剂、食品添加剂、或试验用试剂。
16.在另一优选例中，所述的药物组合物含有(a)维拉帕米或其药学上可接受的盐作为活性成分；和(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
17.在另一优选例中，所述的药物组合物还包括额外的保护软骨细胞缓解骨关节炎活成分。
18.在另一优选例中，所述的药物组合物中，维拉帕米的含量为0.001
‑
99wt％，较佳地为0.01
‑
90wt％，按组合物的总重量计。
19.在另一优选例中，所述药物组合物为注射用药或口服药物。
20.在另一优选例中，所述药物组合物的形式选自下组：片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、丸剂、溶液剂、糖浆剂、或注射剂。
21.在另一优选例中，所述的组合物或制剂被施用于哺乳动物。
22.在另一优选例中，所述的哺乳动物包括：灵长动物；更佳地所述的哺乳动物为人。
23.在另一优选例中，所述的细胞为体细胞。
24.在另一优选例中，所述的细胞选自：骨髓间充质干细胞、骨祖细胞、成骨前体细胞、成骨细胞、软骨祖细胞、软骨细胞或其组合。
25.在另一优选例中，所述的保护软骨细胞缓解骨关节炎包括皮肤保护软骨细胞缓解骨关节炎。
26.在本发明的第二方面，提供了一种保健品组合物，所述保健品组合物含有维拉帕米作为保护软骨细胞缓解骨关节炎的有效成分。
27.在另一优选例中，所述的保健品组合物中，维拉帕米的含量为0.001
‑
99wt％，较佳地为0.01
‑
90wt％。
28.在本发明的第三方面，提供了一种化妆品组合物，化妆品组合物含有维拉帕米作为保护软骨细胞缓解骨关节炎的有效成分。
29.在另一优选例中，所述的化妆品组合物中，维拉帕米的含量为0.001
‑
99wt％，较佳地为0.01
‑
90wt％。
30.在本发明的第四方面，提供了一种维拉帕米在体外非治疗性的减少txnip蛋白表达量中的应用，应用方法包括步骤：
31.向细胞培养体系中加入维拉帕米或其盐，从而减少所述细胞中txnip蛋白的表达量；
32.或者在维拉帕米或其盐存在下，培养细胞，从而减少所述细胞中txnip蛋白的表达量。
33.在另一优选例中，在所述培养体系中，维拉帕米的浓度为0.01
‑
100μm，较佳地0.05
‑
50μm，更佳地0.1
‑
20μm，最佳地0.5
‑
10μm。
34.在另一优选例中，所述的细胞为真核细胞。
35.在另一优选例中，所述的细胞来源于哺乳动物，较佳地为人细胞。
36.在另一优选例中，所述的细胞为体细胞。
37.在另一优选例中，所述的细胞选自下组：骨髓间充质干细胞、骨祖细胞、成骨前体细胞、成骨细胞、软骨祖细胞、软骨细胞或其组合。
38.在本发明的第五方面，提供了一种维拉帕米在保护软骨细胞缓解骨关节炎中的应用，具体包括步骤：给需要的对象施用维拉帕米、或其光学异构体、或其药学上可接受的盐
作为保护软骨细胞缓解骨关节炎活性成分。
39.在另一优选例中，需要的对象为哺乳动物，所述的哺乳动物包括：灵长动物；更佳地所述的哺乳动物为人。
40.在本发明的第六方面，提供了一种用于保护软骨细胞缓解骨关节炎的药物组合物，所述的药物组合物含有：
41.(a1)维拉帕米或其药学上可接受的盐作为活性成分；
42.(a2)额外的保护软骨细胞缓解骨关节炎活成分，所述的额外保护软骨细胞缓解骨关节炎活成分选自下组：褪黑素(可降低txnip水平)；
43.(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
44.在另一优选例中，所述的药物组合物中，维拉帕米的含量为0.001
‑
99wt％，较佳地为0.01
‑
90wt％，按组合物的总重量计。
45.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
46.1.本发明首次证实了维拉帕米可以有效地降低软骨细胞内txnip水平，促进细胞外基质表达。维拉帕米通过促进软骨细胞外基质表达，维持软骨基质稳定，延缓关节的发展。
47.2.通过关节内局部给药的方式，维拉帕米展现出保护软骨细胞缓解骨关节炎作用，避免全身给药造成的系统性影响。
48.3.维拉帕米作为一种已上市的老药，具有较高的使用安全性，临床工作中维拉帕米一般是作为治疗心绞痛或抗心律失常等心血管疾病用药，本发明首次发现活性成分维拉帕米(或含维拉帕米的组合物和产品)可应用于保护软骨细胞，延缓骨关节炎疾病发病率等多方面。
49.4.本发明选用的维拉帕米、或其光学异构体、或其药学上可接受的盐可以制成各种药物组合物、保健品组合物、膳食补充剂、食品组合物、膳食补充剂、食品添加剂、试验用试剂或化妆品组合物中，通过各种方式向需要的对象施用，使用方便。临床工作中对于终末期骨关节炎一般选用关节置换手术，手术截骨保护关节，或者关节内多种药物混合注射治疗。
50.5.根据关节炎的严重程度，控制组合物或制剂中的维拉帕米的含量为0.001
‑
99wt％，对于预防性保护骨关节炎，促进软骨下骨中骨祖细胞有效向软骨细胞分化中，只要添加0.001％即可，对于有临床症状的骨关节炎，为改善关节软骨的增殖代谢以及细胞外基质表达需要添加99％，一般予以局部关节内单药注射，无需联合其它药物。
附图说明
51.图1为体外软骨细胞系实验结果图
52.其中：a.txnip激动剂抑制细胞外软骨基质表达，txnip抑制剂具有保护作用；b.il
‑
1β和tnf
‑
α两种炎症因子刺激atdc5细胞系，txnip表达升高，体外高密度培养软骨基质分泌减少；c.荧光双标提示txnip表达升高，软骨细胞collagen ii表达下降。显著性差异相对于对照组：*表示p<0.05。
53.图2为小鼠dmm关节模型研究图
54.其中：a.小鼠膝关节x线检查，verapamil对小鼠关节软骨具有保护作用；b.小鼠膝
关节组织切片h&e染色。c.番红固绿染色，verapamil抑制txnip水平，促进软骨细胞外基质表达，维持软骨组织厚度。*表示p<0.05。**表示p<0.01。
55.图3为小鼠dmm关节模型研究图
56.其中：a.小鼠膝关节x线检查，dznep作用加重关节退变，间隙塌陷明显；b.小鼠膝关节组织切片h&e染色。c.番红固绿染色，txnip激动剂加重关节退变，软骨组织厚度下降明显。*表示p<0.05。**表示p<0.01。
具体实施方式
57.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
58.发明人经过相关深入的研究,意外地的发现维拉帕米能够通过高效地降低软骨细胞内txnip蛋白的水平，促进软骨细胞外基质的表达，从而具有保护软骨细胞缓解骨关节炎功能。因此，维拉帕米具有安全而有效的保护软骨细胞缓解骨关节炎的活性成分。在此基础上，完成了本发明。
59.具体地，在本发明中，以小鼠为模型动物，通过构建小鼠经典的关节炎模型(dmm模型)实验证实了，本发明所述的维拉帕米能降低软骨细胞内txnip蛋白水平，促进软骨细胞基质表达，保护软骨细胞缓解骨关节炎功能。
60.术语
61.如本文所用，术语“活性成分”、“保护软骨细胞缓解骨关节炎的活性成分”、“组合物”、“保护软骨细胞缓解骨关节炎组合物或制剂”指维拉帕米、或其药学上可接受的盐、或其溶剂化物、或其光学异构体、或其外消旋体、或其晶体、或其水合物、或其氘代化合物、或其组合。
62.如本文所用，术语“txnip”指硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interactingprotein,txnip)。
63.骨关节炎和保护软骨细胞缓解骨关节炎
64.如本文所用，骨关节炎(osteoarthritis,oa)是一种不可逆的退变性疾病，且伴随着关节软骨的渐进性破坏。
65.如本文所用，“保护软骨细胞缓解骨关节炎”是指延缓、阻滞、减少、停止和/或逆转退变进程。
66.oa病理生理过程中软骨组织的改变尤为明显，因此软骨细胞的代谢、分化成熟以及软骨基质的分泌则是研究oa内在机制的关键点。生理环境下软骨细胞能正常的维持代谢平衡，并能很好的控制分化成熟过程中的氧化还原反应。
67.txnip是细胞内硫氧还蛋白(thioredoxin,txn)氧化还原系统的重要生理抑制剂，在多种器官和组织中表达，发挥着调节细胞内氧化还原反应的作用。txnip除了在氧化还原调控中发挥重要作用外还参与炎症反应、糖代谢等多种重要生理过程。小鼠软骨细胞系(atdc5)
68.atdc5细胞是来源于畸胎瘤细胞的小鼠软骨发生细胞系，在胰岛素刺激下，分化成软骨细胞，形成软骨小结，表达ⅱ型胶原和x型胶原最后发生矿化，反映软骨发生过程。
69.小鼠关节炎模型(dmm)
70.手术构建小鼠内侧半月板失稳(destabilization of the medial meniscus,
dmm)模型已被广泛用于骨关节炎的机理研究。
71.活性成分
72.本发明的保护软骨细胞缓解骨关节炎活性成分是维拉帕米或其药学上可接受的盐。
73.维拉帕米(verapamil)是一类苯烷基胺型钙通道阻滞剂，临床上用于治疗高血压、心律失常和心绞痛。化学式：c27h38n2o4，分子量：454.6110。结构式如式所示：
[0074][0075]
在本发明中，一种优选的活性成分是维拉帕米的药学上可接受的盐，一种典型的药学上可接受的盐是盐酸盐，即盐酸维拉帕米(b1867)。常用的盐酸维拉帕米是1当量的维拉帕米与1当量盐酸形成的盐酸盐。
[0076]
维拉帕米为钙通道阻滞剂(钙拮抗剂)。由于抑制钙内流可降低心脏舒张期自动去极化速率，而使窦房结的发放冲动减慢，也可减慢传导。可减慢前向传导，因而可以消除房室结折返。对外周血管有扩张作用，使血压下降，但较弱，一般可引起心率减慢，但也可因血压下降而反射性心率加快。对冠状动脉有舒张作用，可增加冠脉流量，改善心肌供氧。
[0077]
药物组合物及施用方法
[0078]
本发明还提供了含有本发明活性成分的组合物或制剂或产品，所述组合物或制剂或产品可用于保护软骨细胞缓解骨关节炎。代表性的组合物或制剂或产品包括保护软骨细胞缓解骨关节炎的药物、保健品。
[0079]
一种优选的组合物是药物组合物，它含有有效量的维拉帕米或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
[0080]
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性(即保护软骨细胞缓解骨关节炎功能)的且可被人和/或动物所接受的量。
[0081]
如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
[0082]
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、凝胶及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
[0083]
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用
率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.01mg
‑
50mg/kg动物体重(较佳的0.1mg
‑
10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
[0084]
典型地，当以局部关节内注射方式给予维拉帕米时，一个60kg体重的对象(人)，日平均剂量通常为0.6
‑
3000mg，较佳地6
‑
600mg，更佳地45
‑
90mg。
[0085]
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
[0086]
保护软骨细胞缓解骨关节炎的方法
[0087]
本发明提供了一种保护软骨细胞缓解骨关节炎方法(包括治疗性方法、或体外非治疗性方法)，以及抑制txnip蛋白表达和/或活性的方法。
[0088]
典型地，该方法包括：向培养的细胞体系内加入本发明药物组合物或本发明活性成分，从而促进软骨细胞外基质的表达进程；或减少txnnip蛋白表达量。
[0089]
在另一优选例中，所述的细胞为atdc5细胞，尤其是正常的体细胞。
[0090]
本发明还提供了一种保护软骨细胞缓解骨关节炎方法，包括步骤：给需要的对象施用维拉帕米、或其光学异构体、或其药学上可接受的盐作为保护软骨细胞缓解骨关节炎活性成分。
[0091]
优选地，所述的保护软骨细胞缓解骨关节炎方法为给所述对象的关节周围施用(或施涂)含维拉帕米或其盐的保健品。
[0092]
在本发明中，代表性的化妆品的剂型可选自下组(但并不限于)：固体剂型、半固体剂型、液体剂型、或其组合，如溶液、凝胶、膏霜、乳液、精华、透皮贴、面膜等。
[0093]
本发明的主要优点包括：
[0094]
(a)首次证实了维拉帕米可以有效地降低软骨细胞内txnip水平，促进细胞外基质表达。
[0095]
(b)维拉帕米通过促进软骨细胞外基质表达，维持软骨基质稳定，延缓关节的发展。
[0096]
(c)通过关节内局部给药的方式，维拉帕米展现出保护软骨细胞缓解骨关节炎作用，避免全身给药造成的系统性影响。
[0097]
(d)维拉帕米作为一种已上市的老药，具有较高的使用安全性。
[0098]
因此，本发明的活性成分维拉帕米(或含维拉帕米的组合物和产品)可应用于保护软骨细胞，延缓骨关节炎疾病发病率等多方面。
[0099]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0100]
实施例1.
[0101]
一、维拉帕米的体外细胞实验
[0102]
1.1方法
[0103]
盐酸维拉帕米(b1867)，购自apexbio公司；atdc5软骨细胞系由上海交通大学附属第九人民医院骨科实验室提供。
[0104]
经cck8测定verapamil(txnip抑制剂)/dznep(txnip激动剂)的ic50值。有效药物浓度下verapamil(txnip抑制剂)/dznep(txnip激动剂)体外刺激atdc5软骨细胞系，观察细胞增殖分化及凋亡情况。药物刺激后利用wb检测txnip蛋白以水平变化。通过atdc5进行体外高密度，每天给药，刺激7天，进行alician蓝染色，观察细胞外基质来验证verapamil(txnip抑制剂)/dznep(txnip激动剂)对软骨分化成熟及软骨细胞外基质分泌的影响。通过atdc5进行体外成球培养，隔天给药刺激，培养4周后进行切片染色观察细胞外基质来验证verapamil(txnip抑制剂)/dznep(txnip激动剂)对软骨分化成熟及软骨细胞外基质分泌的影响。进行冰冻切片结合免疫荧光，验证verapamil(txnip抑制剂)对软骨细胞系分化成熟及软骨基质分泌的影响。
[0105]
1.2结果
[0106]
实验数据如图1所示。
[0107]
图1为体外软骨细胞系实验结果图。
[0108]
其中：a.左上为体外txnip激动剂与抑制剂刺激atdc5细胞系后蛋白质免疫印迹(western blot，wb)图，结果显示dznep刺激后促进txnip表达，verapamil抑制txnip表达，其中β
‑
actin为对照的内参蛋白；右上为wb条带灰度值定量分析，结果显示dznep刺激后txnip表达增加，verapamil刺激后txnip表达降低。下方为atdc5体外高密度培养图。结果显示，dznep刺激后细胞外软骨基质表达下降，染色面积减小，颜色深度下降；verapamil刺激后面积增加，色泽加深。txnip激动剂dznep促进软骨细胞系表达txnip，抑制软骨细胞外基质表达；verapamil降低txnip表达，促进软骨细胞外基质表达，具有保护作用。
[0109]
b.为il
‑
1β和tnf
‑
α两种炎症因子刺激atdc5细胞系。上部显示两种炎症因子刺激下wb结果显示txnip相较于对照组表达升高，其中β
‑
actin为对照的内参蛋白。下部为为atdc5体外高密度培养图，在两种炎症因子的刺激下txnip表达升高，体外高密度培养软骨基质分泌减少，图片显示面积下降，颜色变浅。
[0110]
c.为体外atdc5软骨球培养切片免疫荧光双标染色。结果显示txnip抑制剂verapamil抑制txnip表达量，促进软骨基质表达(coll2)；相反，txnip激动剂dznep促进txnip表达增加，抑制软骨细胞collagen ii表达。显著性差异相对于对照组：*表示p<0.05。
[0111]
二、小鼠dmm关节模型研究
[0112]
2.1方法
[0113]
选取成年(12周龄)野生型小鼠分为空白对照组，手术对照组，低浓(verapamil
‑
0.7mg/kg)以及高浓(verapamil
‑
1.4mg/kg)各15只建立dmm关节炎模型，在建模后每周2次关节内给药，共给药8周，分别于术后4、8和12周每次各组随机3只取材，进行膝关节组织学染色，通过h&e染色、番红固绿染色、天狼星红染色及免疫荧光染色观察软骨生理表型。进行膝关节组织学染色，组织学h&e染色、番红固绿染色、天狼星红染色等观察软骨细胞及细胞外基质差异并进行定量分析，免疫组化与免疫荧光观察软骨相关蛋白表达情况。
[0114]
同样的方法验证dznep激动txnip后对骨关节炎的影响。选取成年(12周龄)野生型小鼠分为空白对照组，手术对照组，低浓(dznep
‑
0.1mg/kg)以及高浓(dznep
‑
1mg/kg)各15只建立dmm关节炎模型，在建模后每周2次关节内给药，共给药8周，分别于术后4、8和12周每
次各组随机3只取材，进行膝关节组织学染色，通过h&e染色、番红固绿染色、天狼星红染色及免疫荧光染色观察软骨生理表型。进行膝关节组织学染色，组织学h&e染色、番红固绿染色、天狼星红染色等观察软骨细胞及细胞外基质差异并进行定量分析，免疫组化与免疫荧光观察软骨相关蛋白表达情况。
[0115]
2.2结果
[0116]
实验结果如图2和图3所示。
[0117]
图2.为小鼠dmm关节模型verapamil关节内给药研究结果图(每周2次，膝关节内注射给药，共给药8周后)。
[0118]
其中：a.小鼠膝关节x线检查，分别为空白对照组(未手术关节内注射等体积pbs)，手术对照组(dmm手术 pbs)，低浓(dmm verapamil
‑
0.7mg/kg)以及高浓(dmm verapamil
‑
1.4mg/kg)，结果显示空白对照组小鼠膝关节间隙高度维持良好，关节周围无明显骨缀形成；手术对照组关节间隙变窄，周围骨质增生；verapamil治疗组(低浓和高浓)关节间隙高度有所改善，关节周围增生减少。以上结果证实verapamil对小鼠关节软骨具有保护作用。
[0119]
b.小鼠膝关节组织切片h&e染色，结果显示空白对照组小鼠膝关节股骨远端与胫骨近端组织结构完整，形态规则，关节软骨表面光滑；手术对照组关节间隙变窄，结构紊乱，关节软骨表面毛糙变性；verapamil治疗组(低浓和高浓)关节间隙内股骨远端以及胫骨近端结构形态有所改善，软骨面趋于光滑完整。
[0120]
c.番红固绿染色，结果显示(图2.c左侧)空白对照组小鼠膝关节股骨远端与胫骨近端表面关节软骨形态规则，厚度维持良好；手术对照组关节间隙变窄，关节软骨表面毛糙变薄；verapamil治疗组(低浓和高浓)关节间隙内股骨远端以及胫骨近端表面软骨结构形态有所改善，软骨面趋于光滑完整厚度增加。膝关节表面软骨厚度统计分析(图2.c右侧)verapamil治疗dmm小鼠关节炎模型后软骨厚度相较于单纯手术对照组有显著改善。以上结果证实verapamil抑制txnip水平，促进软骨细胞外基质表达，维持软骨组织厚度。*表示p<0.05。**表示p<0.01。
[0121]
图3.为小鼠dmm关节模型dznep关节内给药研究结果图(每周2次，膝关节内注射给药，共给药8周后)。
[0122]
其中：a.小鼠膝关节x线检查，分别为空白对照组(未手术关节内注射等体积pbs)，手术对照组(dmm手术 pbs)，低浓(dmm dznep
‑
0.1mg/kg)以及高浓(dmm dznep
‑
1mg/kg)药物组。结果显示空白对照组小鼠膝关节间隙高度维持良好，关节周围无明显骨缀形成；手术对照组关节间隙变窄，周围骨质增生；dznep给药组(低浓和高浓)关节间隙塌陷加重，关节周围增生明显。以上结果证实dznep通过激动txnip加重小鼠骨关节炎的进展。
[0123]
b.小鼠膝关节组织切片h&e染色。结果显示空白对照组小鼠膝关节股骨远端与胫骨近端组织结构完整，形态规则，关节软骨表面光滑；手术对照组关节间隙变窄，结构紊乱，关节软骨表面毛糙变性；dznep给药组(低浓和高浓)关节间隙内股骨远端以及胫骨近端结构形态进一步紊乱，软骨面粗糙塌陷。
[0124]
c.番红固绿染色，结果显示(图3.c左侧)空白对照组小鼠膝关节股骨远端与胫骨近端表面关节软骨形态规则，厚度维持良好；手术对照组关节间隙变窄，关节软骨表面毛糙变薄；dznep给药组(低浓和高浓)关节间隙内股骨远端以及胫骨近端表面软骨结构形态进一步紊乱，软骨面粗糙明显，厚度变薄。膝关节表面软骨厚度统计分析(图3.c右侧)dznep给
药组dmm小鼠关节炎模型后软骨厚度相较于单纯手术对照组变薄，两组有统计学差异。txnip激动剂加重关节退变，软骨组织厚度下降明显。*表示p<0.05。**表示p<0.01。