miR-673-5P在制备促进周围神经再生的制剂中的应用的制作方法

mir
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5p在制备促进周围神经再生的制剂中的应用
技术领域
1.本发明涉及一种mir
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5p的用途。


背景技术：

2.周围神经髓鞘由施万细胞的细胞膜层层包绕神经轴突而成，其主要成分是脂质，髓鞘中的脂质成分主要包括胆固醇(cholesterol)、磷脂(phospholipids)、鞘糖脂(glycosphing)等。胆固醇占髄鞘脂质的30％左右,髙比例的胆固醇有利于维持髓鞘的稳定性和增加其紧实性，胆固醇的主要作用是通过调节膜的流动性和渗透性来维持髓鞘的稳定性，并且在成髓神经胶质细胞中，胆固醇的作用远远超出其维持膜的生物物理特性的作用，胆固醇合成的速率还与髓鞘生物合成的速度有关。髄鞘中磷脂主要包括磷脂酰乙醇胺(28
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39％)、磷脂酰胆碱、缩醇磷脂酰胆碱、缩醇憐脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂(10
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35％)。在大多数细胞中，这些磷脂可与不同的蛋白相互作用，这些作用可调节细胞生理活动如内吞作用、细胞骨架重塑、细胞生长和极化等。与其生物膜相比，髓鞘中还有较高比例的鞘糖脂，其中最主要的鞘糖脂种类为半乳糖鞘糖脂,其在维持髓鞘稳定性中发挥了重要作用。综上，髄鞘是富含脂质的多层膜结构，且髄鞘中脂质成分比例与其他生物膜有着显著的差异，在促进髄鞘生成和维持长期完整与稳定方面扮演极其重要的角色。
3.micrornas(mirnas)是在真核生物中发现的具有非常广泛多样生物功能的一类内源性具有调控功能的非编码rna。近年来，基于生命科学和工程学的原理和技术发展起来的组织工程学为构建神经移替代品开辟了新的道路。现在的研究更倾向于制备带有神经生长因子或负载mirna，lncrna等功能性核酸的神经移植物。最新的研究表明mirna参与包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等各种各样的调节途径。目前，还没有关于mir
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5p与神经再生过程中脂质合成之间关联的研究。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种效果确切的mir
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5p在制备促进周围神经再生的制剂中的应用。
5.本发明的技术解决方案是：
6.一种mir
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5p在制备促进周围神经再生的制剂中的应用。
7.所述促进周围神经再生的制剂是通过提高坐骨神经中脂质的表达水平来促进周围神经再生的制剂。
8.所述提高坐骨神经中脂质的表达水平，是通过增加胆固醇合成基因hmgcr的表达实现的。
9.本发明提供了激动剂mir
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5p的新用途，且效果确切。
附图说明
10.下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
11.图1是mir
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5p序列示意图。
12.(http://www.mirbase.org/textsearch.shtml？q＝mir
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132
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5p&submit＝submit)
13.图2是sd乳鼠1
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15d皮下注射mir
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5p agomir/agomir
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nc后相关脂质成分表达水平示意图(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001vs.agomir
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nc)。
14.图3是脂质测序热图。
15.图4是sd乳鼠1
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15d皮下注射mir
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5p agomir/agomir
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nc后qrt
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pcr检测mtor下游转录因子srebp2及其下游基因的表达情况示意图。a：srebp2表达水平；b：hmgcr表达水平(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001vs.agomir
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nc)。
16.图5是体外转染mir
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5p mimics/inhibitor后qrt
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pcr检测mtor下游转录因子srebp2及其下游基因的表达情况示意图。a：srebp2表达水平；b：hmgcr表达水平(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001)。
具体实施方式
17.一种mir
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5p在制备促进周围神经再生的制剂中的应用。
18.所述促进周围神经再生的制剂是通过提高坐骨神经中脂质的表达水平来促进周围神经再生的制剂。
19.所述提高坐骨神经中脂质的表达水平，是通过增加胆固醇合成基因hmgcr的表达实现的。
20.实验：
21.1.构建mir
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5p模拟物和抑制物质粒
22.本实验mir
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5p模拟物和抑制物的构建，是直接购锐博公司microntmmirna系列试剂盒，直接向公司提供mir
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5p的成熟序列，合成序列正确的重组质粒。
23.2.原代施万细胞的培养与纯化及mir
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5p处理
24.首先用75％乙醇对刚出生1d的sd乳鼠进行消毒，在超净工作台中剖离出坐骨神经，置于倒有基础培养基的培养皿中(放在冰上)。然后弃掉基培，加入1ml3mg/ml的胶原酶，用显微剪快速剪碎坐骨神经，轻轻吹打混匀后放在37℃，5％co2培养箱中消化30min。30min后弃掉胶原酶，加入1ml0.25％胰蛋白酶，轻轻吹打混匀后在培养箱中消化5min。5min后加三倍量完全培养基来终止消化，1200rpm5min离心。然后弃上清加入新鲜完全培养基，吹打混匀后过筛网，将细胞种在提前用适量多聚l赖氨酸(pll)包被过的培养皿上，置于培养箱中培养。16h后以1：1000的比例往完全培养基中加入阿糖胞苷(工作浓度为10μmol/l)。培养24h后换成完全培养基，再过24h换成含有2μmol/lforskolin和25ng/mlhrg的完全培养基，每2d换一次液。
25.待细胞密度达到80％以上，用pbs清洗一遍细胞。加入1ml0.25％胰蛋白酶，消化1min后弃掉胰酶，加入3ml完全培养基来终止消化并且收集细胞于15ml离心管中。1200rpm5min离心弃上清后加入新鲜完全培养基，然后按1：1000的比例向完全培养基中加入成纤维细胞特异性抗体thy1.1。在冰上作用2h后，离心弃上清，以1：3的比例往基础培养基中加入补体，吹打混匀后放入培养箱中作用30min。拿出来以后离心弃上清，用完全培养基清冼1遍。再次离心弃上清，加入新鲜的完全培养基，将细胞种在提前用pll包被过的培养
皿中。第二天换成含有2μmol/lforskolin和25ng/mlhrg的完全培养基，每2d换一次液，待细胞长满后种孔板使用。
26.通过使用ribofect
tm
cp转染试剂，采用100nm的转染浓度，根据说明书将mir
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5p的模拟物和抑制物转染至纯化好的施万细胞中。
27.3.动物模型构建及mir
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5p处理
28.准备60只新生(p0)的sd乳鼠，将其分为两大组：agomir
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nc组和mir
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5pagomir组，每组分别有30只。agomir是体内过表达的mirna模拟物，agomir
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nc组为对照组，mir
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5pagomir组为实验组。两者购买回来后均是冻干粉状态，用depc水溶解，现用现溶，避免反复冻融。
29.sd乳鼠1d时，用微量注射器分别向乳鼠背部靠近两后肢的部位皮下局部注射30μlagomir
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nc和mir
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5pagomir，每次注射5nmol，每间隔2d再注射一次。设置相应时间点，在第2、5、7、11和15天取材，取两后肢的坐骨神经，根据不同的实验目的取材方式不同。
30.4.定量pcr检测基因表达水平
31.使用trizol试剂(invitrogen公司产品)提取细胞总rna，再经cdna合成试剂盒(takara公司产品)转录成cdna。以此cdna为模板，用sybr green supermix(bio
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rad公司产品)分析基因表达水平。检测仪器为iq5 multicolor real
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time pcr detection system(bio
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rad公司产品)。结果2
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δct
方法计算mrna水平。以18s持家基因来校准mrna的水平。所使用的引物序列如下：
32.18s rrna正向引物:5
’‑
agtccctgccctttgtacaca
‑3’
；
33.18s rrna负向引物:5
’‑
cgttccgagggcctcact
‑3’
.
34.srebp2正向引物：5'
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ctgtcgggtgtcatggg
‑
3'；
35.srebp2负向引物：5'
‑
gctcgctgttctcatcca
‑
3'.
36.hmgcr正向引物：5'
‑
ggctgaagatgtgtccaag
‑
3'；
37.hmgcr负向引物：5'
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agccaaaagcaacgctaa
‑
3'。
38.mir
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5p序列如图1所示。为了研究mir
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5p对脂质合成的作用，我们构建了mir
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5p agomir，通过将其皮下局部注射到刚出生1d的sd乳鼠中。每两天注射一次，在第2、5、7、11和15天取材，观察坐骨神经中脂质水平的表达，比较发现，通过过表达mir
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5p可以提高坐骨神经中脂质的表达水平(图2)。进一步的脂质测序结果显示，过表达mir
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5p使得脂质中各个成分表达含量都有所升高(图3)。为进一步验证实验mir
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5p的现象，又对坐骨神经进行qrt
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pcr检测，结果表明，过表达mir
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5p增加了胆固醇合成基因hmgcr的表达，hmgcr的表达水平在第2、7和11天均显著升高(图4)。为了进一步确认mir
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5p对hmgcr的表达水平的影响，我们通过体外实验将mir
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5p mimics和inhibitor分别转染到施万细胞中，进一步验证基因hmgcr的表达水平的变化，结果显示，相较于对照组，转染mir
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5p mimics后，srebp2和hmgcr表达上升，转染mir
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5p inhibitor后，srebp2和hmgcr表达下降，均有显著差异(图5)。综上所述，通过体内和体外实验均证明了过表达mir
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5p可以调控合成大量周围神经髓鞘形成过程中所需的脂质，从而达到促进髓鞘形成的作用，使得神经再生能力进一步增强。