一种位于猪12号染色体上与仔猪畸形数相关的SNP分子标记及其用途的制作方法

一种位于猪12号染色体上与仔猪畸形数相关的snp分子标记及其用途
技术领域
1.本发明涉及一种位于猪12号染色体上与仔猪畸形数相关的snp分子标记及其用途。


背景技术：

2.我国是世界上最大的猪肉生产国，生猪出栏量占世界生猪出栏总数的一半以上，养猪业创造的产值及经济效益对国民经济发展有着十分重要的影响。然而，畸形初生仔猪(包括阴囊疝、单睾、八字脚、锁肛等遗传缺陷)往往给养猪业带来巨大的经济损失。一方面，每年约180万头仔猪死于遗传缺陷，给我国生猪产业带来每年高达上亿的经济损失。另一方面，在实际育种生产中，发生遗传缺陷的种猪将不会再留作种用，甚至会导致其家系的个体都被淘汰，极有可能限制优秀基因在群体中的快速传递。遗传缺陷是一类复杂的性状，由多基因控制，且遗传机制尚未被解析。因此，鉴别猪遗传缺陷的数量性状位点(quantitative trait loci，qtl)，并最终定位到主效基因及其致病因果突变位点，继而进行遗传改良显得十分重要。
3.过去，对于猪育种常用传统育种方法，即基于猪的表型进行选育。该方法耗时长、成本高且无法从根本上解决猪遗传缺陷的发生。因此，采用常规育种方法难以快速实现预期的育种目标。相比于常规育种方法，新一代分子育种可对遗传缺陷性状进行早期选育，加快对遗传缺陷性状改良育种的进程，从而降低选育成本。目前，针对复杂多基因性状，主要采用全基因组关联分析(genome
‑
wide association studies,gwas)的研究策略进行遗传解析，是现代规模化养猪业分子育种的重要手段。gwas通过在全基因组范围内寻找与目的性状高度关联突变位点，该方法筛选出的分子标记可对目的性状进行早期的分子标记辅助选择，加快对目的性状遗传改良的进程。
4.杜洛克猪作为瘦肉型猪种，具有适应性强、分布广、生长速度快、饲料转化效率高、胴体瘦肉率高等特点，被广泛用作杜长大(杜洛克猪
×
长白猪
×
大白猪)商品猪的终端父本。杜洛克猪作为终端父本，其各项性能指标均具有极高的标准，由此种公猪的选育显得十分重要，而具有遗传缺陷的杜洛克种公猪将会直接影响种猪场收益。因而，探究造成杜洛克猪遗传缺陷的潜在致病位点并进行遗传改良，并结合分子育种进行遗传改良，可大幅度提高我国瘦肉型种猪的遗传优良程度，最大限度地降低养殖企业由猪遗传缺陷带来的极大经济损失，保障企业利润。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术的不足和缺点，本发明提供了一种位于猪12号染色体上与仔猪畸形数相关的snp分子标记及其用途，本发明还提供了一种用于检测如权利要求1所述的snp分子标记的引物对和试剂盒，本发明还提供一种鉴定仔猪畸形数的方法，本发明还提供一种鉴定位于猪12号染色体上与仔猪畸形数相关的snp分子标记基因型的方法，本发明还
提供一种猪的遗传改良的方法。
6.为实现上述目的，所采取的技术方案：一种位于猪12号染色体上与仔猪畸形数相关的snp分子标记，所述snp分子标记的位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列12号染色体上第13982775位a>g突变。
7.优选地，所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no：1所示，其中序列中的m是a或g，导致仔猪畸形数的不同。
8.本发明提供了一种用于检测上述所述的snp分子标记的引物对，包含上游引物primer
‑
f和下游引物primer
‑
r，其核酸序列如下：
9.上游引物primer
‑
f：5
’‑
tgcctggcctctcactgtcacac
‑3’
；
10.下游引物primer
‑
r：5
’‑
actcctctttgtccccggctt
‑3’
。
11.本发明提供了一种用于检测上述所述的snp分子标记的试剂盒，包含上述所述的引物对。
12.本发明提供了一种鉴定仔猪畸形数的方法，包含如下步骤：
13.检测猪12号染色体上上述所述的位于猪12号染色体上与仔猪畸形数相关的snp分子标记，所述snp分子标记的位点的单核苷酸是a还是g。
14.优选地，所述猪包括纯种杜洛克及其合成系。
15.本发明提供了一种鉴定位于猪12号染色体上与仔猪畸形数相关的snp分子标记基因型的方法，包含如下步骤：
16.(1)提取待测猪的基因组dna；
17.(2)采用上述所述的引物对或上述所述的试剂盒对步骤(1)获得的基因组dna进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；
18.(3)对步骤(2)获得的pcr扩增产物进行测序，以便获得测序结果；
19.(4)基于所述测序结果，确定待测猪的位于猪12号染色体上与仔猪畸形数相关的snp分子标记的基因型。
20.优选地，所述待测猪包括纯种杜洛克及其合成系。
21.本发明提供了一种猪的遗传改良的方法，包含如下步骤：
22.确定种猪核心群中种猪的上述所述的snp分子标记基因型，并根据所述snp分子标记基因型做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择国际猪基因组11.1版本参考序列12号染色体上第13982775位为gg、ag基因型的种猪个体，淘汰在第13982775该位点为aa基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因g的频率。
23.优选地，所述种猪包括纯种杜洛克及其合成系。
24.本发明提供了上述所述的snp分子标记、上述所述的引物对或上述所述的试剂盒在制备鉴定仔猪畸形数、筛选仔猪畸形数低的亲本猪的试剂中的用途。
25.本发明提供了上述所述的snp分子标记、上述所述的引物对或上述所述的试剂盒在猪遗传育种或降低仔猪畸形数中的用途。
26.有益效果：
27.(1)本发明研究并确定与仔猪畸形数显著相关的snp分子标记(seq idno:1序列标注位置为121位的核苷酸突变)位于猪的12号染色体上的核苷酸序列上，验证其对仔猪畸形数的影响效应，将其应用于种猪的遗传改良中，以保障企业利润，增加核心竞争力。
28.(2)本发明提供一种用于鉴定位于猪12号染色体上与仔猪畸形数相关的snp分子标记的引物对，通过该snp分子标记及引物对可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于种猪遗传改良中，能够大幅降低仔猪畸形数，并且为猪的抗病育种相关的筛选工作提供了新方法。
附图说明
29.图1是纯种杜洛克猪在12号染色体上关于仔猪畸形数的全基因组关联分析(gwas)曼哈顿图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示
‑
logp值。
30.图2是不同基因型猪的仔猪畸形数结果分析图。
具体实施方式
31.为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
32.实验猪群：本实验一共使用了来源于温氏股份种猪场的603头纯种杜洛克。猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。
33.实施例1
34.(1)纯种杜洛克猪耳样组织dna的提取方法参照标注苯酚
‑
氯仿法提取全基因组dna。用nanodrop
‑
nd1000分光光度计对纯种杜洛克群体的dna进行质量检测和浓度测定。a260/280比值在1.8～2.0，a260/230比值在1.7～1.9判定为合格。最后将合格的dna样品统一稀释成50纳克/微升。再将6μl已提取好的待测dna样品与2μl loading buffer混合，上样到质量体积比为1％的琼脂糖凝胶中，150v电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察dna的完整性。dna完整性检测合格后进行基因型检测。
35.(2)猪全基因组50k snp基因型检测：dna样品送纽勤生物科技(上海)有限公司，在illumina beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组50ksnp芯片(illumina,美国)基因型判定。利用plink v1.9对所有样本50k芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于90％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代
‑
温伯格平衡显著性水平高于10
‑
6的snp，最终得到42141个snp的有效基因型数据。
36.(3)全基因组关联(gwas)分析：为了消除群体层化效应，本发明采用线性混合模型单点回归分析并结合gemma软件进行gwas分析，分析模型中利用个体间基因组相似度校正层化效应。采用bonferrini法确定snp与仔畸形数性状关联程度的显著性阈值，染色体水平显著阈值为1除以有效snp位点数量，及染色体水平阈值为2.27e
‑
7，即1/42141(有效snp数量)。
37.gwas分析结果如图1所示。从图1可知，在杜洛克中，在12号染色体中存在显著影响仔猪畸形数的位点，最强关联的snp为g.121a>g(p＝4.03e
‑
06)。
38.(4)不同基因型与仔猪畸形数表型的关联性分析：
39.据表1、图2可知，分子标记的snp位点g.121a>g(seq no.1中第121位核苷酸)与仔猪畸形数性状存在极显著关联。gg型、ag型比aa型个体所产后代仔猪畸形数少，其中gg型个体所产后代仔猪畸形数较aa型个体少1.22头。因此，在育种中保留gg、ag基因型的种猪，以逐步提高该位点的等位基因g的频率，可以显著减少仔猪畸形数，为企业带来更大的经济效
益。
40.表1 snp位点g.121a>g的不同基因型个体所产后代仔猪畸形数比较
[0041][0042]
实施例2检测snp分子标记
[0043]
(1)含有与杜洛克猪后代仔猪畸形数显著相关的snp位点的目的片段为12号染色体中的一段224bp的核苷酸序列，序列扩增的上下游引物为primer
‑
f和primer
‑
r，其核酸序列如下：
[0044]
上游引物primer
‑
f：5
’‑
tgcctggcctctcactgtcacac
‑3’
；
[0045]
下游引物primer
‑
r：5
’‑
actcctctttgtccccggctt
‑3’
；
[0046]
(2)pcr扩增的体系与条件设置
[0047]
配置10μl体系，其中dna样品1.0μl，上游引物0.3μl，下游引物0.3μl，pcr starmix 5.0μl，ddh2o 3.4μl，pcr条件为94℃预变性2min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸15s，共35个循环，最后延伸为72℃5min。
[0048]
(3)dna序列测序鉴定：序列测序在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与ncbi基因组序列对比，得出对应snp位点的突变，测序结果如下所示：
[0049]
tgcctggcctctcactgtcacacgtaggaaggtggggtcctcgccagtgggcccttgaatgactatggttggattagaggtgatcttaaaaatatgaagtcatatccgtttgtgccaaaam(a/g)gaacaaattagctttatgtcttgttgctctgaaatgggggaccaggcctgaagccggggacaaagaggagt；
[0050]
注：序列中标注的m为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为引物序列结合位置。
[0051]
实施例3分子标记的snp位点g.121a>g效应分析
[0052]
根据表1、图2可知，分子标记的snp位点g.121a>g(seq no.1中第121位核苷酸)与仔猪畸形数存在极显著关联。gg型、ag型比aa型个体所产后代仔猪畸形数少，其中gg型个体所产后代仔猪畸形数较aa型个体少1.22头。因此，在育种中保留gg、ag基因型的种猪，以逐步提高该位点的等位基因g的频率，可以显著减少仔猪畸形数，为企业带来更大的经济效益。
[0053]
本发明通过对seq id no:1序列中的第121位碱基突变位点进行检测，初步进行其基因型与仔猪畸形数发生之间的关联分析，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记，利用该分子标记和对应引物对可建立高效准确的分子标记辅助育种技术。
[0054]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。