用于纸质酶联免疫吸附测定的酶标板的制作方法与流程

1.本发明涉及酶联免疫吸附技术领域，特别涉及一种用于纸质酶联免疫吸附测定的酶标板的制作方法。


背景技术：

2.酶联免疫吸附测定法(简写为elisa法)的起始步骤是将包被抗体附着于微孔板的反应孔表面，称为包被，包被的效率即最终结合于微孔板表面的包被抗体密度及其稳定性决定了其随后结合抗原的数量，也就是说决定了酶联免疫吸附测定法的敏感度。近年来，随着纸质微流控技术的诸多优点，2010年whitesides团队首次提出将纸作为固相载体运用于酶联免疫吸附试验，并且评价了纸质elisa(简写为p
‑
elisa)法的三个主要优势：标本量少，成本低，检测迅速，但p
‑
elisa法的灵敏度不如传统elisa法，限制了p
‑
elisa法的应用范围。


技术实现要素：

3.本发明提供了一种用于纸质酶联免疫吸附测定的酶标板的制作方法，以解决现有技术中p
‑
elisa法的灵敏度比传统elisa法低的技术问题。
4.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
5.本发明提供了一种用于纸质酶联免疫吸附测定的酶标板的制作方法，包括以下步骤：s1、制备纸质微孔板，所述纸质微孔板的表面形成多个疏水区，每一所述疏水区环绕一亲水区；s2、将所述步骤s1制备得到的所述纸质微孔板浸入至高碘酸钠溶液中，取出后向所述纸质微孔板上的每一所述亲水区滴加壳聚糖溶液，形成高碘酸钠
‑
壳聚糖修饰层；再向每一所述亲水区滴加包被抗体溶液，然后向每一所述亲水区滴加牛血清白蛋白溶液形成封闭层，即可得到所述用于纸质酶联免疫吸附测定的酶标板。
6.进一步地，所述步骤s2还包括：向每一所述亲水区滴加包被抗体溶液之前，先向每一所述亲水区滴加还原剂以还原所述高碘酸钠
‑
壳聚糖修饰层中的碳氮双键。
7.进一步地，所述步骤s2还包括：将所述纸质微孔板从高碘酸钠溶液中取出，浸泡于多元醇溶液中充分反应后，用水洗涤再滴加所述壳聚糖溶液。
8.进一步地，所述步骤s1中采用印章法制备所述纸质微孔板，制备方法包括以下步骤：将印章上沾染疏水剂后压于滤纸表面形成所述疏水区，所述疏水剂渗透所述滤纸后，干燥固化，得到所述纸质微孔板。
9.进一步地，所述疏水剂包括聚二甲基硅氧烷、环甲基硅氧烷、氨基硅氧烷、聚甲基苯基硅氧烷、聚醚聚硅氧烷共聚物中的一种或几种。
10.进一步地，所述印章上形成有多个环状的凸起，所述环状的凸起沾染所述疏水剂后压于滤纸的表面。
11.进一步地，所述印章法的步骤还包括：将所述疏水剂涂抹于纸表面，并使所述环状的凸起在纸表面上沾染所述疏水剂；其中，所述疏水剂的涂抹厚度为0.2mm～0.6mm，所述环状的凸起的高度为0.8mm～1.4mm。
12.进一步地，所述干燥固化的步骤中，干燥温度为50℃～85℃，干燥时间为20min～40min。
13.本发明提供的用于纸质酶联免疫吸附测定的酶标板的制作方法，通过印章法制作纸质微孔板，其制作的纸质微孔板表面包括多个疏水区及被疏水区环绕的亲水区，亲水区大小均一性好，且没有渗漏现象，能够很好地保持亲水区的均一性和密闭性；并在纸质微孔板的每一亲水区形成高碘酸钠
‑
壳聚糖修饰层，然后将包被抗体溶液滴加在亲水区形成的高碘酸钠
‑
壳聚糖修饰层上，并滴加牛血清白蛋白溶液形成封闭层，制得纸质酶联免疫吸附测定用的酶标板，使包被抗体溶液通过化学交联的方式与高碘酸钠
‑
壳聚糖修饰层连接，形成包被抗体层固定于纸质微孔板的亲水区表面，增强了包被抗体层固定的稳定性和有效性，提高了p
‑
elisa法的灵敏度并且重复性好。
附图说明
14.图1为本发明实施例提供的用于纸质酶联免疫吸附测定的酶标板的制作方法制作的酶标板的结构示意图；
15.图2为为未修饰的纸质微孔板(图a)和高碘酸钠
‑
壳聚糖修饰后的纸质微孔板(图b)的扫描电镜图；
16.图3为为纸质微孔板的红外光谱图，a线为未修饰的纸质微孔板，b线为高碘酸钠氧化后的纸质微孔板，c线为高碘酸钠
‑
壳聚糖修饰的纸质微孔板；
17.图4为未修饰的纸质微孔板(图a)与印章法制作的纸质微孔板(图b)的扫描电镜图；
18.图5为基于高碘酸钠
‑
壳聚糖修饰层化学交联固定包被抗体的p
‑
elisa法检测的标准曲线；
19.图6为本发明实施例提供的用于纸质酶联免疫吸附测定的酶标板的制作方法的反应及检测原理图。
20.附图标记说明：
21.1、纸质微孔板；2、亲水区。
具体实施方式
22.下面结合附图及具体实施例对本发明再作进一步详细的说明。
23.本技术实施例提供了一种用于纸质酶联免疫吸附测定的酶标板的制作方法，包括以下步骤：s1、制备纸质微孔板1，纸质微孔板1的表面形成多个疏水区，每一疏水区环绕一亲水区2；s2、将步骤s1制备得到的纸质微孔板1浸入至高碘酸钠溶液中，取出后向纸质微孔板1上的每一亲水区2滴加壳聚糖溶液，形成高碘酸钠
‑
壳聚糖修饰层；再向每一亲水区2滴加包被抗体溶液，然后向每一亲水区2滴加牛血清白蛋白溶液形成封闭层，即可得到用于纸质酶联免疫吸附测定的酶标板。本技术实施例制作的酶标板参照图1所示，酶标板包括设置有多个疏水区的纸质微孔板1和附着在每一亲水区2表面的包被层。
24.在常规的p
‑
elisa法中，包被抗体主要通过静电吸附于纸质微孔板1表面，固定不牢固的包被抗体容易在洗涤过程中被洗脱，容易导致生物分子的随机固定，影响包被抗体的稳定性和有效性，降低了p
‑
elisa法的灵敏度。包被抗体含有大量的氨基和羧基，我们在
研究中发现，可以通过化学交联的方式与固相载体即纸质微孔板1表面的醛基、羧基、氨基等基团进行化学偶联，增强p
‑
elisa法的免疫分析性能。
25.可以理解地，生物分子固定于纸质微孔板1上的方式多样，不同的固定方式对生物分子活性的影响也不同。壳聚糖是甲壳素脱n
‑
乙酰基的产物，含有大量的氨基，一方面可以直接通过静电吸附作用固定于纸质微孔板1表面，但这种固定方式不稳定，容易被洗脱；另一方面也可以与经氧化剂氧化后的纸质微孔板1表面的醛基或者羧基结合，将壳聚糖牢固的结合于纸质微孔板1表面，此方式不需要任何化学交联剂，能良好地保持滤纸的物理和化学性能。而高碘酸钠作为一种滤纸的氧化剂，其浓度、氧化液ph值、氧化时间和温度将影响滤纸的物理性质及醛基量，因此氧化过程必须得到良好的控制。
26.本技术实施例中，通过高碘酸钠与壳聚糖先后滴加至纸质微孔板1的亲水区2，经红外光谱表征，结果表明随着羟基特征峰的减弱及醛基峰的出现，高碘酸钠氧化剂成功氧化纸质微孔板1表面；同时醛基特征峰的消失及席夫碱中c＝n双键特征峰的出现，说明壳聚糖能够稳定地共价结合于高碘酸钠修饰的纸质微孔板1表面，为包被抗体稳定的化学交联提供良好的基础。
27.本技术实施例中，纸质微孔板1设置有多个疏水区，每一疏水区均环绕一亲水区2，形成类似微孔板的微孔结构。疏水区为封闭结构，本技术实施例对疏水区的形状不作限定。将纸质微孔板1浸入至高碘酸钠溶液中，并在其每一亲水区2滴加壳聚糖溶液，能够在每一亲水区2的表面形成高碘酸钠
‑
壳聚糖修饰层；当后续再向每一亲水区2滴加包被抗体溶液时，能够通过化学交联的方式将包被抗体固定于纸质微孔板1的亲水区2表面，增强了包被抗体固定的稳定性和有效性，提高了p
‑
elisa法的灵敏度并且重复性好。也就是说，亲水区2表面形成的高碘酸钠
‑
壳聚糖修饰层含有氨基，而包被抗体c端的羧基与修饰层的氨基发生化学交联，使包被抗体的n端可变区充分暴露，有利地提高抗原抗体之间结合的亲和力。
28.参见图2中扫描电镜图，图a为未修饰高碘酸钠
‑
壳聚糖的纸质微孔板1，图b为本技术实施例中高碘酸钠
‑
壳聚糖修饰后的纸质微孔板1，其表面形态未发生改变，仍然保持着滤纸松散的三维多孔结构。由图2可知，经扫描电镜观察，小分子壳聚糖未改变滤纸原本的结构，比表面积未发生改变，保证了包被抗体的有效吸附量，可呈现快速、灵敏的免疫反应，同时疏水区环绕亲水区2的类似多孔的结构有利于洗涤未结合在滤纸上的物质，降低检测的背景影响，可保持纸质微孔板1良好的分析性能。
29.参见图3中高碘酸钠
‑
壳聚糖修饰的纸质微孔板1的红外光谱图，其中，a线为未经高碘酸钠与壳聚糖修饰的纸质微孔板1的红外光谱图；b线为高碘酸钠修饰以后的纸质微孔板1的红外光谱图；c线为高碘酸钠
‑
壳聚糖修饰后的纸质微孔板1的红外光谱图。
30.从图中可以看出，纸质微孔板1含有多个羟基基团，在a线上只能看到羟基特征光谱峰(3300cm
‑1)；当在微孔表面附着高碘酸钠之后，观察到1730cm
‑1醛基特征峰的出现(b线)，同时可见羟基特征光谱峰(3300cm
‑1)减弱；壳聚糖修饰纸质微孔板1之后，c线醛基特征峰消失，在1642cm
‑1处出现了c＝n双键特征峰，说明壳聚糖已经成功结合于微孔表面。红外光谱图的结果表明，随着羟基特征峰的减弱及醛基峰的出现，高碘酸钠氧化剂成功氧化纸质微孔板1；醛基特征峰的消失及c＝n双键特征峰的出现说明壳聚糖能够稳定地共价结合于高碘酸钠修饰的亲水区2表面，为包被抗体稳定的化学交联提供良好的基础。反应原理图参照图6所示。
31.本技术实施例中，纸质微孔板1中疏水区的形状可以为环形。可以理解地，将疏水区设置为环形，则亲水区2即为圆形，与溶液的表面张力使液滴呈现的形状相同，便于在亲水区2滴加壳聚糖等液体。
32.本技术实施例中，高碘酸钠溶液为高碘酸钠溶解于乙酸铵缓冲溶液中形成；纸质微孔板1从高碘酸钠溶液中取出后，用水洗涤并吸干。另外，包被抗体溶液在制备时，分别用mes缓冲液(即2
‑
(n
‑
吗啡啉)乙磺酸)溶解edc(即1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐)和sulfo
‑
nhs(即n
‑
羟基硫代琥珀酰亚胺)，并将溶解后的edc溶液和溶解后的sulfo
‑
nhs溶液混合形成edc/sulfo
‑
nhs混合溶液，将包被抗体溶液与edc/sulfo
‑
nhs混合溶液混合，然后滴加至每一亲水区2。edc/sulfo
‑
nhs溶液为无毒害、生物相容性良好的交联剂之一，保持着蛋白分子的生物活性，能够使蛋白分子稳定地固定于纸质微孔板1表面，同时也不影响抗原与包被抗体的结合能力。
33.一些实施例中，步骤s2还包括：向每一亲水区2滴加包被抗体溶液之前，先向每一亲水区2滴加还原剂以还原高碘酸钠
‑
壳聚糖修饰层中的碳氮双键。从图3的红外光谱图可以看出，在纸质微孔板1表面形成的包被层中，高碘酸钠
‑
壳聚糖修饰层c＝n双键特征峰的出现，而c＝n双键为不稳定的结构，本技术实施例在滴加包被抗体溶液之前，向每一亲水区2先滴加还原剂，从而使c＝n双键反应为ch2‑
nh2的稳定状态，保证后续包被抗体层的形成及抗原与包被抗体的结合能力。本技术实施例中，还原剂选取氰基硼氢化钠等温和的还原剂。
34.一些实施例中，步骤s2还包括：将纸质微孔板1从高碘酸钠溶液中取出，浸泡于多元醇溶液中充分反应后，用水洗涤再滴加壳聚糖溶液。可以理解地，将纸质微孔板1从高碘酸钠溶液中取出以后，纸质微孔板1的表面有高碘酸钠溶液的残留；因而将纸质微孔板1浸入至多元醇的溶液中，使多元醇与纸质微孔板1表面残留的高碘酸钠溶液充分反应，避免过多高碘酸钠溶液在纸质微孔板1表面的残留。本技术实施例中，多元醇溶液选取乙二醇。
35.一些实施例中，步骤s1中采用印章法制备纸质微孔板1，制备方法包括以下步骤：将印章上沾染疏水剂后压于滤纸表面形成疏水区，疏水剂渗透滤纸后，干燥固化，得到纸质微孔板1。本技术实施例中，采用印章法制作的纸质微孔板1，亲水区2大小均一性好，且没有渗漏现象，能够很好地保持亲水区2的均一性和密闭性。参见图4中未修饰的滤纸与印章法制作的纸质微孔板1的扫描电镜图，可以观察到未修饰的滤纸表面粗糙，相互交织形成一个多孔结构(图4a)；印章法处理的滤纸多孔结构消失，光滑度明显提高(图4b)，可形成良好的疏水区边缘。
36.本技术实施例中，滤纸由多孔结构的纯纤维素构成，纯纤维素是由d
‑
吡喃型葡萄糖基组成的一个线性高分子链，具有亲水性和生物相容性，同时表面带有数个羟基基团使其表面化学、光学性质对制备p
‑
elisa装置也有着独特的优势。其一方面保持了蛋白吸附的比表面积，另一方面由于毛细作用力，液体易在其表面发生移动。经印章法处理后的纤维素多孔结构封闭完全，样品和试剂全部禁锢于亲水区2内，能确保亲水区2实验的准确性，是较好的纸质微孔板1制作方法。
37.进一步地，疏水剂包括聚二甲基硅氧烷、环甲基硅氧烷、氨基硅氧烷、聚甲基苯基硅氧烷、聚醚聚硅氧烷共聚物中的一种或几种。以上疏水剂都可以用于本技术实施例的印章法制作纸质微孔板1的过程中，优选聚二甲基硅氧烷。
38.一些实施例中，印章上形成有多个环状的凸起，环状的凸起沾染疏水剂后压于滤
纸的表面。可以理解地，当印章上形成有多个环状的凸起时，印章沾染疏水剂并压于滤纸表面上时，形成的疏水区为环形，而亲水区2为圆形，即亲水区2、疏水区形成类似微孔板的微孔结构。具体地，印章为橡胶材质，印章上的环状凸起通过激光切割技术形成，环形凸起在印章上形成有孔，孔的直径为6mm左右，深度为1mm，孔间距为2mm。
39.进一步地，印章法的步骤还包括：将疏水剂涂抹于纸表面，并使环状的凸起在纸表面上沾染疏水剂；其中，疏水剂的涂抹厚度为0.2mm～0.6mm，环状的凸起的高度为0.8mm～1.4mm。可以理解地，需要在纸表面涂抹疏水剂达到一定的厚度，才能够满足印章的沾染要求；另外，环状凸起的高度大于疏水剂在纸上的涂抹厚度，这样疏水剂就不会进入到环状凸起在印章上形成的孔内，避免印章压于滤纸上时进入到孔内的疏水剂流至亲水区2内。这里的纸可以用普通的纸。疏水剂涂抹的厚度太厚，会使印章沾染的疏水剂太多，压于滤纸表面之后，污染亲水区2，且难以干燥固化，提高成本；疏水剂涂抹的厚度太薄，印章压于滤纸上的疏水剂不均匀，影响纸质微孔板1的均一性和密闭性。
40.进一步地，干燥固化的步骤中，干燥温度为50℃～85℃，干燥时间为20min～40min。采用上述干燥温度与干燥时间，能够保证疏水剂完全干燥，便于后续使用。
41.以下各实施例中所用试剂均为市售。
42.实施例1
43.一种用于纸质酶联免疫吸附测定的酶标板的制作方法，包括以下步骤：
44.1、通过印章法制备纸质微孔板1。
45.通过激光切割技术在橡胶表面形成孔直径7mm、深度1mm且孔间距2mm的微孔模型，即做好印章。随后将pdms疏水剂置于磁力搅拌器上缓慢搅拌均匀，不要产生气泡。其中，pdms疏水剂为sylgard184聚合物与固定剂的混合物。pdms为聚二甲基硅氧烷的简称。待疏水剂搅拌均匀后，平整地涂抹于纸的表面，涂抹的厚度约为0.5mm。
46.将形成有微孔模型的橡胶印章均匀地沾染纸表面的疏水剂，然后用力压于滤纸的表面，在滤纸表面形成多个疏水区，等待疏水区的疏水剂完全渗透滤纸(约20s时间)，并将滤纸放置于恒温箱中75℃保温固化30min，取出冷却，形成亲水区2的直径6mm、亲水区2间距2mm的纸质微孔板1。
47.2、在纸质微孔板1的亲水区2表面形成高碘酸钠
‑
壳聚糖修饰层。
48.将高碘酸钠溶解于乙酸铵缓冲液中，将步骤1制作的纸质微孔板1完全浸入到上述高碘酸钠溶液中，室温下避光摇晃20min，均匀后用超纯水充分洗涤并吸干。然后将上述纸质微孔板1浸泡于乙二醇溶液中充分反应，20min后用超纯水充分洗涤并吸干待用。向上述纸质微孔板1的每一亲水区2滴加5μl壳聚糖溶液，壳聚糖的浓度为0.25mg/ml，室温下反应至干燥，随后向每一亲水区2滴加4μl氰基硼氢化钠还原剂，37℃下反应20min，水洗涤6次，吸水纸吸去多余的残留液，待用。
49.3、制备包被抗体层。
50.分别用mes缓冲液(0.1mol/l，ph值4.7)溶解edc、sulfo
‑
nhs，然后将溶解后的edc溶液与sulfo
‑
nhs溶液按照摩尔比4∶5混合得到混合溶液；将包被抗体溶液与edc/sulfo
‑
nhs混合溶液混合，然后滴加至每一亲水区2，37℃下活化15min后，再滴加牛血清白蛋白溶液形成封闭层。包被抗体溶液的浓度为0.2mg/ml。
51.利用实施例1制作的酶标板分析基于高碘酸钠
‑
壳聚糖化学交联固定包被抗体的
p
‑
elisa法检测性能。以不同浓度的甲胎蛋白标准溶液为例，实验组每一亲水区滴加4μl甲胎蛋白标准溶液与酶标抗体混合液，酶标抗体的最佳稀释比为1∶600，对照组每一亲水区直接加4μl酶标抗体溶液，室温下反应8min后，用洗涤液洗涤6次并吸干多余的残留液；随后实验组和对照组的每一亲水区滴入3μl tmb显色液显色，参照图6所示。显色情况通过扫描仪捕捉，image j软件分析图像，利用image j软件分析rgb图片，分别得出实验孔rn、gn、bn值，对照孔r0、g0、b0值，通过公式计算p
‑
elisa检测的信号，绘制p
‑
elisa法检测的标准曲线，结果如图5所示，从图中得出检测范围为0.08ng/ml～20ng/ml。另外，测定20个阴性对照的δrgb值，计算平均值和标准差(s)，并将此值带入标准曲线计算检测限，得到最低检测限为0.035ng/ml。
52.检测实验选用20ng/ml、10ng/ml和1ng/ml三个甲胎蛋白浓度比较p
‑
elisa检测方法的重复性，通过公式计算，结果如表1所示，基于高碘酸钠
‑
壳聚糖与包被抗体交联p
‑
elisa检测方法的批内变异系数为7.66％、8.40％与8.68％，批间变异系数为7.78％、9.56％与10.49％。
53.表1 p
‑
elisa检测方法的批内、批间检测结果
[0054][0055]
上述p
‑
elisa法检测与传统商业化96孔板传统elisa法对相同甲胎蛋白抗原进行比较，从结果显示检出限明显升高。因此p
‑
elisa法检测的灵敏度得到了有效的提高。同时，经过批内、批间变异系数可观察到同一样品在同一批次试验和不同批次试验中变异系数小，说明p
‑
elisa法具有较好的重复性和稳定性。
[0056]
选用1ng/ml、10ng/ml和20ng/ml三个已知浓度的甲胎蛋白标准品，添加于2.01ng/ml人血清样品中(人血清样品来自株洲市中医伤科医院)，计算得到高碘酸钠
‑
壳聚糖化学交联固定包被抗体的p
‑
elisa法的回收率分别为104.00％、98.50％、96.30％，与采用相同包被抗体的商业化96孔板传统elisa法比较，其样品检测结果无显著差异，参见表2。p
‑
elisa法通过对样品的添加回收试验及与传统elisa法比较，说明其检测方法的结果具有可靠性。
[0057]
表2 p
‑
elisa法与商业化96孔板传统elisa法的样品分析比较
[0058][0059]
本技术实施例的酶标板用于纸质酶联免疫吸附测定的方法，在复杂的基体环境中对于待测物具有良好的分析性能；与传统的elisa相比，其检测结果可靠性强，分析性能良好，为资源匮乏地区的疾病检测提供了一种低成本、准确、快速和高灵敏度的方法。
[0060]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不同限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。并且，本发明各个实施方式之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。