细胞外泌体装载激发试剂和光敏剂的肿瘤联合治疗制剂及其应用的制作方法

1.本技术涉及医药生物技术领域，尤其涉及一种细胞外泌体装载激发试剂和光敏剂的肿瘤联合治疗制剂及其应用。


背景技术：

2.由于胶质瘤的复杂性、多样性及非均相性，利用外泌体（exosome）的免疫微环境调节功能难以完全治疗胶质瘤。将多种治疗模式进行联合使用，不仅可以有效克服单一治疗模式的弊端，还可以充分发挥多种治疗模式之间的协同增强作用。
3.微环境调节与化疗协同治疗肿瘤：由于胶质瘤属于实体性恶性肿瘤，单纯利用外泌体的免疫微环境调节功能在胶质瘤治疗过程中没有优势。化疗是目前胶质瘤治疗的一种常见方法，但即便利用胶质瘤的明星化疗药物“替莫唑胺”其中位生存期也仅能提高3个月，其疗效亟待提升。在过往的过程中，很少有将微环境的调控与化疗联动起来的报道，这为我们打开了思路。但传统的化疗手段在肿瘤治疗中仍存在以下问题：
①
化疗药物不会选择性的对肿瘤起效，对正常组织毒副作用大；
②
一些效果较好的化疗药物由于不能透过血脑屏障（bbb），难以用于胶质瘤的治疗；
③
化疗易产生耐药性；
④
有研究发现传统的化疗药物如dox、紫杉醇（ptx）等有助于癌细胞分泌含有膜联蛋白
‑
a6的外泌体促进癌症的转移导致治疗效果不佳。因此，激励着科研人员不断去寻找其他的联合治疗方法。
4.另外，如果能够挖掘出自由基杀伤和微环境之间的协同性，将能够显著提高肿瘤的疗效：随着技术的不断发展，逐渐兴起了一些以光动力学治疗（photodynamic therapy, pdt）为代表的治疗方法，有研究表明，pdt对胶质瘤有特殊的治疗作用，因为脑肿瘤细胞具有高度摄取光敏剂的能力。当利用pdt治疗时，加剧了肿瘤的乏氧水平。有科研人员将pdt与乏氧治疗结合起来，增加肿瘤的治疗效果。但以上体系在胶质瘤治疗中仍然存在以下问题：
①
大多数光敏剂具有疏水特性易聚集，不易到达肿瘤部位；
②
胶质瘤在脑室旁出现的概率最高，其距离皮层较远，利用激光照射很难穿透颅骨到达病灶部位，若利用植入发光器械或开颅手术等近距离照射肿瘤区域时又面临着感染的风险，且病人的接受程度低。
5.目前，脑胶质瘤的生物治疗尚处于摸索阶段，暂无良好的治疗方法。以上策略可以在一定程度上抑制肿瘤生长，但仍然存在一些问题：
①
多种治疗方案的协同仅是简单的作用叠加，达到“1 1=2”的效果，没有很好地联动起来；
②
没有针对胶质瘤特定的生理特性进行设计。
6.因此，开发出一种不需要激光照射的动力学治疗方法在脑肿瘤的治疗中具有十分重要的意义。


技术实现要素：

7.本技术提供了一种细胞外泌体装载激发试剂和光敏剂的肿瘤联合治疗制剂及其应用，以解决如何针对肿瘤特定的生理特性进行设计，得到一种不需要激光照射肿瘤制剂
的技术问题。
8.第一方面，本技术提供了一种细胞外泌体装载激发试剂和光敏剂的肿瘤联合治疗制剂，所述肿瘤联合治疗制剂为胶质细胞外泌体差异化空间装载激发试剂、光敏剂和生物还原药的运载体，所述激发试剂能激发光敏剂进行反应发光，用于替换激光；所述生物还原药负载于胶质细胞外泌体，用于穿透深层次组织进行免疫微环境调控。
9.可选的，述肿瘤联合治疗制剂调控促炎因子的表达量，进行免疫微环境调控。所述促炎因子包括il
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12、il
‑
6、tnf
‑
α和ifn
‑
γ中至少一种。
10.可选的，所述化学激发试剂包括：鲁米诺、光泽精、双草酸酯（cppo）中至少一种。
11.可选的，所述光敏剂包括：5－氨基酮戊酸、苯并卟啉衍生物单酸环ａ、二氢卟吩（ce6）中至少一种。
12.可选的，所述生物还原药包括aq4n。
13.第二方面，本技术提供了一种细胞外泌体装载激发试剂和光敏剂的肿瘤联合治疗制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：选取胶质细胞，将所述胶质细胞与脂多糖溶液接触并培养，得到m1型小胶质细胞；将所述m1型小胶质细胞与所述生物还原药进行共培养，破碎细胞，纯化后，得到包裹生物还原药的m1型外泌体，即含生物还原药的外泌体；将化学激发试剂cppo、光敏剂ce6与含生物还原药的外泌体的共孵育，以实现差异化的空间装载，得到m1胶质细胞外泌体装载激发试剂和光敏剂的肿瘤联合治疗制剂（ccexosa）。
14.可选的，所述脂多糖溶液的摩尔浓度为1
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4μg/ml。
15.可选的，所述破碎细胞包括：用无外泌体的血清进行细胞培养。
16.可选的，所述纯化的方式为离心和去杂质取上清液中至少一种。
17.一种细胞外泌体装载激发试剂和光敏剂的肿瘤联合治疗制剂的应用，其所述应用包括在脑胶质瘤、肿瘤和胶质瘤任意一种中的应用。
18.本技术实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：本技术实施例提供的所述肿瘤联合治疗制剂为m1型胶质细胞外泌体差异化空间装载激发试剂、光敏剂和生物还原药的运载体，所述激发试剂能激发光敏剂进行反应发光，用于替换激光治疗，穿透颅骨到达病灶部位，可以避免感染的风险；差异化空间装载，解决了光敏剂易聚集不易到达肿瘤部位的缺陷，所述生物还原药负载于胶质细胞外泌体，能穿透深层次组织；ccexosa能够调控促炎因子的表达量，调控免疫微环境。本技术的肿瘤联合治疗制剂对正常组织无毒副作用，能透过bbb，耐药性小，不会导致肿瘤细胞转移。
附图说明
19.此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1为外泌体的分离提取情况及分析效果；图2为m1型外泌体调控肿瘤免疫微环境及化学动力学治疗制剂体应用情况。
具体实施方式
22.为使本技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
23.本技术利用纳米制剂包裹光敏剂可很好解决光敏剂的聚集现象，另外，化学发光试剂如鲁米诺、光泽精、双草酸酯（cppo）可与过氧化氢等反应发光，用化学发光取代激光激发光敏剂用于深层肿瘤组织的动力学治疗。
24.本技术实施例中，所述生物还原药可以为缺氧条件下活化的化疗药物，包括aq4n。
25.本技术实施例中，ccexosa能够调控促炎因子的表达量，调控免疫微环境，促炎因子包括il
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12、il
‑
6、tnf
‑
α和ifn
‑
γ中至少一种。
26.本技术提出的肿瘤联合治疗制剂通过外泌体递送系统与肿瘤微环境调控、化学激发动力学及肿瘤乏氧治疗合理有序地共载于同一平台中，形成优势互补，实现真正意义上的联动协同治疗，具有选择性、能够穿透深层次组织、调控免疫微环境及联动治疗的功能。
27.本发明首先涉及一种制备基于m1型小胶质细胞外泌体装载化学激发试剂和光敏剂，构建化学激发光动力治疗与乏氧联动治疗联动的胶质瘤治疗制剂（ccexosa）的方法，所述方法包括如下步骤：（1）体外诱导活化，构建m1型小胶质细胞，并获得含有aq4n的外泌体；（2）考察cppo、ce6与含aq4n的外泌体的孵育条件，得到协同作用复合体ccexosa。
28.步骤（1）所述的制备化动力与乏氧联动治疗制剂是ccexosa为例，制备的方法为：1）m1型小胶质细胞外泌体的分离提取，选取小鼠小胶质细胞bv2为研究对象进行培养，加入一定浓度的lps刺激产生m1型小胶质细胞，整个过程中均利用无外泌体的血清进行细胞培养，利用超离提取外泌体，方法如下：收集刺激后的细胞培养上清40 ml，300 g，4℃离心15 min，去除杂质取上清；3 000 g，4℃离心15 min，去除细胞碎片取上清；20 000 g，4℃离心70 min，取上清用0.22 μm的筛子过滤；120 000 g，4℃离心120 min，小心取出上清，并倒立在滤纸上吸干，外泌体包含在沉淀中，用适量的pbs重悬，收集在无菌的ep管中，
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80℃保藏备用，以静息态小胶质细胞（m0）分泌的外泌体作为对照；2）包裹aq4n的m1型外泌体的制备，bv2细胞培养36 h后，加入10 g/ ml 的脂多糖（lps）刺激12 h产生m1型小胶质细胞，同时加入1 mg/ ml的aq4n孵育48 h后按如上方法提取外泌体，从而得到包裹aq4n的m1型外泌体（exosome@aq4n）；步骤（2）所述的复合体ccexosa的制备方法为：室温条件下，将1 mg/ ml的化学发光试剂cppo、光敏剂ce6与aq4n
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exosome共孵育12 h，得到粒径约50 nm左右的ccexosa。
29.本技术所述的制备得到集乏氧治疗、化学动力学及免疫微环境调控为一体的外泌体递送系统，获得尺寸50 nm左右，结构稳定，无系统毒性。
30.本技术涉及所述的治疗制剂在恶性脑胶质瘤中应用。
31.实施例1、外泌体的分离提取lps（脂多糖）诱导后小胶质细胞形态发生明显变化，呈现阿米巴状活化状态，胞体变大，突起回缩，促炎因子tnf
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α、il
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12等显著升高，表现为m1型小胶质细胞，并成功分离得到m1型小胶质细胞分泌的外泌体。摸索aq4n对细胞的毒性，结果发现1 mg/ ml的aq4n与正常小胶质细胞共孵育48 h后没有明显的细胞毒性。图1a为小胶质细胞表型检测pbs处理的bv2;图1b为小胶质细胞表型检测lps诱导后的bv2;图1c为elisa检测tnf
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α、il
‑
12、il
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10极化细胞因子；检测是否得到m1型小胶质细胞；图1d为 rt
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pcr检测相关因子表达情况，其中inos和arg1为m1型标记物;图1e为外泌体的透射电镜鉴定；图1f为外泌体的粒径分析；图1g为外泌体的蛋白质免疫印迹(wb)分析，分为对照（control）组和m1型外泌体（exosome）组，其中cd63和cd81为外泌体的标记物，gapdh为内参。
32.实施例2、m1型exosome调控肿瘤免疫微环境及化学动力学治疗制剂体内应用构建荷瘤小鼠，将ccexosa通过尾静脉注射到荷瘤小鼠体内，ccexosa可以穿过bbb到达肿瘤部位并在肿瘤部位富集。图2a为ccexosa跨bbb及体内分布情况，随时间不同体内分布情况图；图2b为ccexosa提高促炎因子的表达效果图；图2c为肿瘤微环境中m2/m1比例变化，其中m2为m2型小胶质细胞，m1为m1型小胶质细胞，pbs对照组中m2/m1比值高于ccexosa，说明了ccexosa可以提高肿瘤微环境中il
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12、il
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6、tnf
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α及ifn
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γ的分泌，降低肿瘤部位m2型小胶质细胞与m1型小胶质细胞比率，ccexosa具有免疫微环境调控的功能。；图2d为水溶液中ccexosa产生1o2的能力，利用abda检测溶液中1o2的生成，当溶液中存在h2o2时可促使ccexosa产生1o2，随着h2o2浓度的升高，产生1o2能力增强，abda的紫外吸收量越来越小，表明ccexosa可以被化学发光试剂cppo激活产生1o2，杀伤肿瘤细胞。
33.需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
34.以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。