一种细胞色素P450单加氧酶CYP109B2及其应用的制作方法

一种细胞色素p450单加氧酶cyp109b2及其应用
技术领域
1.本发明属于生物催化酶技术领域，具体涉及一种细胞色素p450单加氧酶cyp109b2及其应用。


背景技术：

2.甾体类(激素)化合物通常都具有环戊烷多氢菲的基本母核骨架的生物活性化合物，甾体类激素在生物机体内广泛参与新陈代谢合成，对生物的生命活动起着非常重要的调节作用。而甾体类药物主要包括肾上腺皮质激素和性激素两大类，作为“生命的钥匙”维护生理活动正常进行，在临床上广泛用于治疗心血管、风湿、炎症、内分泌失调和抗肿瘤等疾病。目前，甾体类药物是市场上仅次于抗生素的第二大类药物，全球年产量超过100万吨，市场年销售额大约有1000亿美元。
3.对甾体的四个环进行化学修饰能赋予甾体类药物更强的生理和药理活性，且不同位置碳原子的化学修饰产物也会表现出不同的药理活性。相比于甾体底物而言，甾体母核上非活泼碳的羟基化修饰不仅能够通过改变甾体药物本身的极性来增强其生理和药理活性，而且还为甾体药物中间体的进一步衍生修饰提供更广阔的改造空间。如通过特异性羟基化修饰可以得到治疗风湿、哮喘和脑水肿的地塞米松(dexamethasone)，具有抗炎特效的氢化可的松(hydrocortisone)，合成避孕药的重要中间体11α
‑
羟基孕酮(11α
‑
hydroxylated progesterone)以及具有增加糖皮质激素活性的功能的16α
‑
羟基化的类固醇(16α
‑
hydroxylated steroids)等等。甾体分子结构的复杂性决定了甾体母核功能化的多样性，将近20个甚至更多的羟基化位点为甾体类化合物的定点修饰带来了巨大挑战。羟基化甾醇的化学合成途径非常复杂，不仅需要比较苛刻的合成条件，而且产物的总收率低下，加上产物分离纯化所带来的加工成本严重制约着甾体类药物的工业化生产。目前几乎没有有效的合成特定羟基化甾醇化学方法，仅有的几个报道中，除了需要多步反应和苛刻的反应条件之外，往往还需要对特殊的化学活性基团进行保护和去保护等修饰，制备工艺十分复杂，并且成本高昂，试剂毒性大。
4.而生物催化法可以选择性地在惰性c
‑
h键之间引入氧原子，实现羟基化甾醇的一步合成，利用生物催化法合成羟基化甾体表现出化学合成方法所不具备的选择性高、环境污染小以及反应条件温和等巨大优势。目前生物催化法合成重要的医药中间体由于反应工艺相对比较简单，环境污染小，成本低廉，产物的理论得率可以达到100％，非常符合“绿色化学”和“原子经济性”的可持续发展理念，日益成为国际公认的合成高附加值化学品最具潜力的方案。细胞色素p450单加氧酶作为已报道的甾体羟基化酶的主体，为甾体药物的绿色合成提供了重要的开发资源，其对甾体底物的定点羟基化能够有力地推动甾体类药物的技术革新，有望实现一系列羟基化甾醇的高效合成，促进甾体类药物工业化生产，为人类健康做出新的贡献。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种新的细胞色素p450单加氧酶cyp109b2及其应用，本发明首次从索诺拉沙漠芽孢杆菌bacillus sonorensis中克隆获得了一个新的细胞色素p450单加氧酶cyp109b2蛋白酶基因(sequence id:wp_029419899.1)，并以prsfduet
‑
1作为表达载体，大肠杆菌bl21(de3)作为宿主细胞实现了该蛋白酶的异源表达，发现该蛋白酶能够对甾体化合物的16β位进行高效选择性的羟基化修饰，为甾体化合物的定点羟基化修饰和甾体羟基化产物合成提供了新思路，且催化效率高、经济环保。
6.本发明的目的之一在于提供一种细胞色素p450单加氧酶cyp109b2，所述cyp109b2的氨基酸序列如seq id no：1所示。
7.进一步的，所述cyp109b2来源于索诺拉沙漠芽孢杆菌bacillus sonorensis。
8.本发明的目的之二在于提供了一种编码上述细胞色素p450单加氧酶cyp109b2的基因，该基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
9.本发明的目的之三在于提供了一种用于扩增上述基因的扩增引物，所述扩增引物的核苷酸序列如seq id no：3
‑
4所示。
10.本发明的目的之四在于提供了一种载体，所述载体中包含上述基因。
11.进一步的，所述载体上还包含氧化还原伴侣蛋白的基因和/或p450单加氧酶氧化还原结构域基因。
12.进一步的，所述氧化还原伴侣蛋白为铁氧还蛋白还原酶和铁氧还蛋白。
13.进一步的，所述铁氧还蛋白还原酶和铁氧还蛋白为：来源于聚球藻synechococcus elongates pcc7942的细胞色素p450单加氧酶氧化还原伴侣蛋白，或来源于菠菜e.c.1.18.1.2的细胞色素p450单加氧酶氧化还原伴侣蛋白。
14.进一步的，所述p450单加氧酶氧化还原结构域为：来源于巨大芽孢杆菌bacillus megaterium的细胞色素p450单加氧酶p450
‑
bm3的还原酶结构域；或来源于红球菌rhodococcus sp.ncimb 9784的细胞色素p450单加氧酶p450
‑
rhf(cyp116b2)的还原酶结构域。
15.本发明的目的之五在于提供了一种遗传工程菌，所述遗传工程菌中包含上述载体。
16.本发明的目的之六在于提供了上述细胞色素p450单加氧酶cyp109b2，或上述索诺拉沙漠芽孢杆菌bacillus sonorensis，或上述载体，或上述遗传工程菌在催化甾体化合物羟基化修饰中的应用。
17.进一步的，所述羟基化修饰为甾体化合物的16β羟基化修饰。
18.进一步的，所述甾体化合物包括：睾酮、去甲睾酮、勃地龙、甲基双烯醇酮、雄烯二酮、肾上腺酮、18
‑
甲基双酮、49物和炔孕酮。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明以甾体底物睾酮为模式底物，筛选得到一株可选择性代谢底物睾酮的索诺拉沙漠芽孢杆菌bacillus sonorensis，并通过分子生物学手段，首次从该菌株中克隆得到了其细胞色素p450单加氧酶cyp109b2蛋白酶的基因，该基因全长1218bp，编码405个氨基酸，进一步，以prsfduet
‑
1作为表达载体，大肠杆菌bl21(de3)作为宿主细胞实现了该蛋白酶的异源表达，实验验证发现cyp109b2蛋白酶能够对甾体化合物的16β位进行高效选择性的羟基化修饰。即本发明提供了一个全新的细胞色
素p450单加氧酶，并验证了其对于甾体化合物羟基化修饰的功能，这为甾体化合物的定点羟基化修饰和甾体羟基化产物合成提供了新思路，且催化效率高、经济环保，为p450单加氧酶应用于合成生物学提供更多资源，促进了甾体类药物的工业化生产，为人类的健康发展做出新贡献。
附图说明
20.图1为本发明实施例1中索诺拉沙漠芽孢杆菌bacillus sonorensis培养后的菌液图；
21.图2为本发明实施例1中扩增得到的cyp109b2的基因检测结果；
22.图3为本发明实施例1中细胞色素p450单加氧酶cyp109b2的系统发育树；
23.图4为本发明实施例1中细胞色素p450单加氧酶cyp109b2的序列保守性；
24.图5为本发明实施例1中细胞色素p450单加氧酶cyp109b2的同源序列比对结果；
25.图6为本发明实施例3中重组细胞e.coli(prsfduet
‑1‑
cyp109b2)异源表达cyp109b2的sds
‑
page检测结果；
26.图7为本发明实施例4中细胞色素p450单加氧酶cyp109b2转化睾酮后的hplc分析检测结果；
27.图8为本发明实施例4中细胞色素p450单加氧酶cyp109b2转化甾体底物睾酮、去甲睾酮、雄烯二酮和肾上腺酮后的hplc分析检测结果；
28.图9为本发明实施例4中细胞色素p450单加氧酶cyp109b2转化甾体底物勃地龙、甲基双烯醇酮、18
‑
甲基双酮、49物和炔孕酮的hplc分析检测结果；
29.图10为本发明实施例4中细胞色素p450单加氧酶cyp109b2转化多种不同甾体化合物的催化能力和催化产物检测结果。
具体实施方式
30.下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
31.实施例1细胞色素p450单加氧酶cyp109b2的基因克隆
32.1、索诺拉沙漠芽孢杆菌bacillus sonorensis的培养
33.从甘油管中挑取索诺拉沙漠芽孢杆菌(bacillus sonorensis)的菌液，在海水2216琼脂平板培养基上划线活化，于30℃恒温培养箱倒置培养48h。待平板上长出单菌落，挑取单菌落接种于5ml无抗性的lb培养基中，30℃，220rpm振荡培养48h。培养得到的菌体整体呈灰白色，如图1所示。菌体od
600
为2.5左右。
34.为了确认该细菌是否具有转化甾体化合物的能力，以睾酮作为模式底物，用bacillus sonorensis对睾酮进行了全细胞反应检测，具体为：细菌培养后，于4000rpm离心10min收集菌体，用ph 8.0的磷酸钾缓冲液重悬细胞，调od
600
＝20，向菌悬液中加入终浓度5％的葡萄糖(glucose)，5％的甘油(glycerol)，终浓度1u的葡萄糖脱氢酶(gdh)和终浓度1mm的nadp

和1mm溶解于二甲基甲酰胺(dmf)的甾醇睾酮，25℃，200rpm的振荡摇床中进行
睾酮的生物转化9h，在反应9h后取样检测。取样的反应液加入等体积(500μl)的乙腈，1200rpm离心1min，过膜处理后用于高效液相色谱(hplc)分析检测。检测结果显示，反应后的样品中检测到了除底物睾酮以外的液相峰，而未检测到底物睾酮的液相峰，说明该细菌中存在催化睾酮转化的酶，并且在30h内将1mm睾酮完全转化。
35.2、bacillus sonorensis基因组信息和cyp109b2基因克隆
36.将培养得到的菌液在12000rpm转速下离心2min收集菌体，并根据商用的基因组抽提试剂盒的说明书抽提基因组。抽提得到的基因组通过跑核酸检测胶进行鉴定，验证正确后于
‑
25℃保存备用。
37.根据bacillus sonorensis的菌种属性在ncbi数据库中查询相关基因组信息，并根据基因组的序列信息设计特异性引物，采用分子克隆技术从基因组中克隆得到新型p450单加氧酶基因，具体如下：
38.以bacillus sonorensis基因组为模板，引物为：
39.cyp109b2
‑
f：atgaactcggcaaaacagcagaac(seq id no:3所示)
40.cyp109b2
‑
r：tcatgatgaaagcagcgcctctttg(seq id no:4所示)
41.pcr体系(50μl)：1μl基因组模板，引物各1μl(10μm)，25μl prime star max dna聚合酶，加灭菌蒸馏水至50μl。
42.pcr反应程序为：(1)98℃变性3min；(2)98℃变性10sec，(3)55℃退火15sec，(4)72℃延伸20sec，步骤(2)
‑
(4)共进行30个循环，最后72℃延伸5min，12℃保藏产物。
43.克隆扩增得到的pcr产物用0.8％的琼脂糖凝胶核酸电泳检测，在紫外核酸成像仪下观察到大小在1000～1500之间的条带(如图2所示)，目的条带理论大小为1218bp，实际得到的目的基因大小与理论一致，说明克隆得到了目标基因。进一步将得到的pcr产物送交公司测序，结果显示，克隆得到的pcr产物的核苷酸序列以及氨基酸序列与数据库中一致，说明确准确克隆得到目的基因，该基因的核苷酸序列如seq id no:2所示，氨基酸序列如seq id no:1所示。
44.利用ncbi分析该新型p450单加氧酶的同源序列，并在此基础上利用生物学序列分析软件mega 6.0对新型p450单加氧酶进行系统发育树的构建，结果如图3所示，结果显示，该新型p450单加氧酶与已经报道的cyp109家族的cyp109b1氨基酸序列同源性达61.9％，由此确认了新型p450单加氧酶是细胞色素单加氧酶cyp109b亚家族的一员，由此将该蛋白酶命名为cyp109b2。
45.进一步分析cyp109b2的酶学结构特征，首先利用生物信息学手段对cyp109b2的保守性进行了分析，结果如图4所示；并结合mega 6.0和在线weblog、在线espript 3.0对cyp109b2进行序列分析，探索cyp109b2与其同源酶基因序列的差异之处，同源序列比对结果如图5所示。
46.实施例2氧化还原伴侣蛋白酶基因或p450单加氧酶氧化还原结构域的获取
47.细胞色素p450单加氧酶在催化过程中需氧化还原伴侣蛋白酶或氧化还原结构域进行电子传递，本实施例分别列举了几种氧化还原伴侣蛋白和p450单加氧酶氧化还原结构域的获取方法。
48.(1)来源于聚球藻synechococcus elongates pcc7942的细胞色素p450单加氧酶氧化还原伴侣蛋白酶，具体为：铁氧还蛋白还原酶synpcc7942_0978(fdr_0978)和铁氧还蛋
白synpcc7942_1499(fdx_1499)。
49.分别以pet
‑
28a
‑
fdr_0978和pet
‑
28a
‑
fdx_1499质粒为模板，以引物：
50.fdr_0978
‑
f:atgttgaatgcgagtgtggctg(seq id no:5)
51.fdr_0978
‑
r:ctagtaggtttcaacatgccaacgacc(seq id no:6)；
52.fdx_1499
‑
f:atggcaacctacaaggttacgct(seq id no:7)
53.fdx_1499
‑
r:ctagtagaggtcttcttctttgtgggtttcg(seq id no:8)
54.pcr体系(10μl)：模板0.1～4ng，引物各0.5μl(10μm)，5μl prime star max dna聚合酶，加灭菌蒸馏水至10μl，进行常规pcr扩增。
55.(2)来源于菠菜e.c.1.18.1.2的细胞色素p450单加氧酶氧化还原伴侣蛋白酶，具体为：铁氧还蛋白还原酶fnr和铁氧还蛋白fd i。基因扩增方法同上，扩增引物包括：
56.fnr
‑
f:atgcagatcgcctctgatgtgg
57.fnr
‑
r:ttagtagacttcaacgttccattgttctgcc；
58.fd i
‑
f:atggccgcctacaaggtgac
59.fd i
‑
r:ttaggcggtcagctcctcttctt。
60.(3)来源于巨大芽孢杆菌bacillus megaterium的细胞色素p450单加氧酶p450
‑
bm3(cyp102a1)的氧化还原结构域。基因扩增方法同上，扩增引物包括：
61.(cyp109b2)
‑
r
bm3
‑
f:
62.gcgctgctttcatcaccttcacctagcactgaacagtctg
63.(cyp109b2)
‑
r
bm3
‑
r:
64.gcattatgcggccgcttacccagcccacacgtcttttgc。
65.(4)来源于红球菌rhodococcus sp.ncimb 9784的细胞色素p450单加氧酶p450
‑
rhf(cyp116b2)的氧化还原结构域。基因扩增方法同上，扩增引物包括：
66.(cyp109b2)
‑
r
rhf
‑
f:gcgctgctttcatcagtgctgcaccggcatcaacc
67.(cyp109b2)
‑
r
rhf
‑
r:gcattatgcggccgctcagagtcgcagggccagc。
68.实施例3重组质粒prsfduet
‑1‑
cyp109b2
‑
fdr_0978
‑
fdx_1499构建
69.在成功得到cyp109b2基因后，通过生物信息学分析确定了cyp109b2属于i型的细胞色素p450单加氧酶。为了让cyp109b2在大肠杆菌中发挥其催化活性，筛选了cyp109b2合适的氧化还原伴侣，其中在铁氧还蛋白还原酶fdr_0978和铁氧还蛋白fdx_1499的辅助下，cyp109b2能表现出很好的催化活性，因此构建重组质粒。
70.1、cyp109b2重组质粒构建(prsfduet
‑1‑
cyp109b2)
71.(1)线性载体片段prsfduer
‑
1的扩增：
72.模板：质粒prsfduet
‑
1，引物：
73.prsfdute
‑1‑
f1:gcggccgcataatgcttaag(seq id no:9)
74.prsfdute
‑1‑
r1:aagcttgtcgacctgcaggc(seq id no:10)
75.pcr体系(50μl)：模板0.5～20ng，引物各1μl(10μm)，25μl prime star max dna聚合酶，加灭菌蒸馏水至50μl。
76.pcr反应程序为：(1)98℃变性3min；(2)98℃变性10sec，(3)55℃退火15sec，(4)72℃延伸40sec，步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后72℃延伸5min，12℃保藏产物。
77.(2)cyp109b2基因扩增
78.模板：扩增的cyp109b2基因片段
79.引物：
80.(prsfduet)
‑
cyp109b2
‑
f:
81.caggtcgacaagcttatgaactcggcaaaacagcagaac(seq id no:11)(prsfduet)
‑
cyp109b2
‑
r:
82.gcattatgcggccgcttacgcctggaacgataaagatgcctc(seq id no:12)
83.pcr扩增体系和反应程序同步骤(1)。
84.(3)将克隆扩增得到的pcr产物用0.8％的琼脂糖凝胶核酸电泳检测，在紫外核酸成像仪下观察条带大小是否正确。检测正确后用dpn i消化pcr产物中剩余的模板，体系(50μl)为：5μl cutsmart buffer，2μl dpn i，43μl pcr产物。在37℃消化5h，之后80℃灭活15min。用1.5％的琼脂糖凝胶核酸电泳和omega回收试剂盒进行胶回收。
85.(4)将目的基因片段cyp109b2和线性载体片段prsfduer
‑
1在t5外切酶的作用下形成15bp或者20bp的粘性末端从而连接在一起，具体方法为：在5μl反应体系中按照摩尔比3:1加入目的片段cyp109b2和线性化载体prsfduet
‑
1(控制线性化载体的量为30～50ng)，再加入t5外切酶和buffer 4.0，不够5μl用水补足。加入t5外切酶后计时5min，时间到后立即加入50μl dh5α感受态细胞按照常规转化的基本步骤进行转化，加培养基复苏1h后转移到含有相应抗性kan(50μg/ml)的lb固体培养基(蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 10g/l，15g/l琼脂粉)上过夜培养，并且取相应转化子送测序公司进行dna测序最终得到正确重组子prsfduet
‑1‑
cyp109b2。
86.(5)将重组子prsfduet
‑1‑
cyp109b2转化到大肠杆菌bl21(de3)中，并在含有抗性kan(50μg/ml)的lb固体培养培养，得到可以单独表达细胞色素cyp109b2单加氧酶的重组细胞e.coli(prsfduet
‑1‑
cyp109b2)，使其异源表达cyp109b2，sds
‑
page检测结果如图6所示。结果显示，在45kd附近有比较亮的蛋白条带，与cyp109b2的实际蛋白大小44.5kd一致，说明cyp109b2在大肠杆菌中异源表达得较好。
87.2、氧化还原伴侣重组质粒(petduet
‑1‑
fdr_0978
‑
fdx_1499)构建
88.(1)线性载体片段petduet
‑
1的扩增：
89.模板：质粒petduet
‑
1，引物：
90.petduet
‑
f:gcctgcaggtcgacaagctt(seq id no:13)
91.petduet
‑
r:gcgccgagctcgaattcg(seq id no:14)
92.pcr扩增体系和反应程序同上。
93.(2)fdr_0978和fdx_1499基因扩增
94.模板：fdr_0978目的基因片段或fdx_1499目的基因片段；引物：
95.(petduet)
‑
fdr_0978
‑
f:cgaattcgagctcggcgcatgttgaatgcgagtgtggctg(seq id no:15)
96.fdr_0978
‑
(rbs)
‑
r:gatatatctccttaggtaccctagtaggtttcaacatgccaacgacc(seq id no:16)；
97.fdx_1499
‑
(rbs)
‑
f:ggtacctaaggagatatatcatggcaacctacaaggttacgct(seq id no:17)
98.(petduet)
‑
fdx_1499
‑
r:gcttgtcgacctgcaggcgtagaggtcttcttctttgtgggtttcg
(seq id no:18)
99.pcr扩增体系和反应程序同上。
100.(3)将线性化载体和目的基因片段fdr_0978
‑
rbs
‑
fdx_1499和线性载体片段petduet
‑
1在t5外切酶的作用下形成15bp或者20bp的粘性末端从而连接在一起。具体方法同重组子prsfduet
‑1‑
cyp109b2的构建，其中目的片段fdr_0978、fdx_1499和线性化载体petduet
‑
1的摩尔比为3:3:1。最终得到正确重组子petduet
‑1‑
fdr_0978
‑
fdx_1499。
101.3、重组质粒prsfduet
‑1‑
cyp109b2
‑
fdr_0978
‑
fdx_1499构建
102.(1)模板：质粒prsfduet
‑1‑
cyp109b2；引物：
103.prsfdute
‑1‑
f2:ggccggccacgcgatcgct(seq id no:19)
104.prsfdute
‑1‑
r2:gatatccaattgagatctgccatatgtatatctcct(seq id no:20)
105.常规pcr扩增得到线性化载体prsfduet
‑1‑
cyp109b2。
106.(2)fdr_0978
‑
rbs
‑
fdx_1499基因扩增
107.模板：质粒petduet
‑1‑
fdr_0978
‑
fdx_1499
108.引物：
109.(prsfduet)
‑
fdr_0978
‑
f1:tctcaattggatatcatgttgaatgcgagtgtggctg(seq id no:21)
110.(prsfduet)
‑
fdx_1499
‑
r1:atcgcgtggccggccctagtagaggtcttcttctttgtgggtttcg(seq id no:22)
111.常规pcr扩增得到入目的片段fdr_0978
‑
rbs
‑
fdx_1499
112.(3)将线性化载体和pcr扩增的基因片段在t5外切酶的作用下形成15bp或者20bp的粘性末端从而连接在一起。具体方法同上述重组子prsfduet
‑1‑
cyp109b2的构建，其中目的片段fdr_0978
‑
rbs
‑
fdx_1499和线性化载体prsfduet
‑1‑
cyp109b2的摩尔比为3:1。测序后得到正确重组质粒：pfsfduet
‑1‑
cyp109b2
‑
fdr_0978
‑
fdx_1499。
113.4、蛋白表达重组细胞构建
114.可将两种重组质粒prsfduet
‑1‑
cyp109b2和petdeut
‑1‑
fdr_0978
‑
fdx_1499同时转化到bl21(de3)中并培养，得到可以同时表达细胞色素单加氧酶cyp109b2、铁氧蛋白还原酶fdr_0978和铁氧蛋白fdx_1499的重组细胞e.coli(prsfduet
‑1‑
cyp109b2/petdeut
‑1‑
fdr_0978
‑
fdx_1499)。
115.也可将上述重组质粒pfsfduet
‑1‑
cyp109b2
‑
fdr_0978
‑
fdx_1499，转化到bl21(de3)中并在含有抗性kan(50μg/ml)的lb固体培养培养，得到可以同时表达细胞色素单加氧酶cyp109b2、铁氧蛋白还原酶fdr_0978和铁氧蛋白fdx_1499的重组细胞e.coli(pfsfduet
‑1‑
cyp109b2
‑
fdr_0978
‑
fdx_1499)。
116.实施例4蛋白质表达和功能验证
117.以实施例3中构建得到的重组细胞e.coli(pfsfduet
‑1‑
cyp109b2
‑
fdr_0978
‑
fdx_1499)，用于后续生物转化研究。
118.在超净工作台中将上述蛋白表达重组细胞e.coli(prsfduet
‑1‑
cyp109b2
‑
fdr_0978_fdx_1499)接种于3ml含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中在37℃,220rpm下培养大约6～8h，按2％的接种量将种子液转接于50ml含有50μg/ml卡那霉素的tb培养基中，37℃,220rpm下培养大约2h
‑
3h直到od
600
＝0.6～0.8，在超净工作台中向菌液中加入终浓度为
0.2mm的异丙基
‑
β
‑
d
‑
硫代吡喃半乳糖苷(iptg)在25℃,200rpm条件下诱导培养14
‑
16h。诱导结束后的菌体在15℃，4000rpm离心10min以收集菌体，菌体收集后用100mm ph 8.0的磷酸钾缓冲液清洗菌体两次，再次重悬调od
600
＝20。用液氮速冻细胞(增强细胞膜通透性，促进底物进入细胞)，室温冻融后用于甾醇转化。
119.取4ml菌悬液于50ml反应瓶中,并加入终浓度5％的葡萄糖(glucose)，5％的甘油(glycerol)，终浓度1u的葡萄糖脱氢酶(gdh)，终浓度1mm的nadp

和1mm溶解于二甲基甲酰胺(dmf)的甾醇睾酮，25℃,200rpm的振荡摇床中进行睾酮的生物转化9h，分别在反应1h、5h和9h取样检测。取样的反应液加入等体积(500μl)的乙酸乙酯萃取，1200rpm离心1min，取上层有机相，待乙酸乙酯挥发干后加入500μl的乙腈，过膜处理后用于高效液相色谱(hplc)分析检测，检测结果如图7所示。
120.结果显示，反应进行到9h，底物睾酮已完全反应完，hplc色谱图已检测不到底物峰图，且有四个异于底物的峰出现，说明cyp109b2能够高效催化底物睾酮的转化。
121.反应产物的分离纯化鉴定：按照上述体系进行大规模的制备反应，生物转化结束后取样，用等体积(50ml)乙酸乙酯萃取产物，有机相中加入无水硫酸钠过夜干燥。使用旋蒸仪在40℃，100rpm和
‑
0.1kpa的条件下蒸发除去乙酸乙酯，浓缩反应产物。在甲醇和二氯甲烷作为展开剂的条件下，用25
×
75mm的tlc硅胶板同时分析底物标品和反应产物，摸索底物和产物的分离条件。确定的分离的展开剂条件为甲醇：二氯甲烷＝1：15。装填纯化硅胶柱前(预装柱要保证洁净干燥)，先用展开剂润洗预装柱，再向预装柱中加入经展开剂拌匀的硅胶，边加边用橡胶敲打柱外壁，确保硅胶柱装填均匀，紧实，无气泡。待硅胶平面到达预装柱的4/5时，停止添加硅胶，向硅胶柱中加入3倍柱体积的展开剂，进一步压实硅胶柱，最后将硅胶柱中多余展开剂排出至展开剂液面与硅胶面相切，关闭硅胶柱活塞。采用湿法上柱，沿预装柱管壁小心缓慢加入产物粗品，并向上层产物中加入适当无水硫酸钠覆盖，确保硅胶柱处于无水条件。然后沿硅胶柱管壁缓慢加入展开剂，并打开硅胶柱下端活塞，用小试管收集流出液，并及时取样用tlc硅胶板检测各个试管的产物分布情况。收集只包含目标产物的流出液，并用旋蒸仪进行浓缩结晶，制备产物。用核磁分析分离得到的产物，通过核磁碳谱和核磁氢谱及底物结构确定反应产物的分子结构。
122.进一步，测定cyp109b2与睾酮反应的动力学参数，具体为：分别构建含cyp109b2、fdr_0978和fdx_1499的质粒，表达纯化并测定蛋白质浓度，然后将三种蛋白质按照浓度比1:4:20配成蛋白混合液，并向蛋白混合液中加入终浓度为1mm的mgcl2、终浓度为5％的葡萄糖和甘油、终浓度为1u的葡萄糖脱氢酶(gdh)，充分混匀后分装于30个1.5ml的ep管中，在这30个ep管中分别加入稀释于二甲基亚砜(dmso)浓度梯度为25～1000μm的睾酮底物,每个梯度设置三个平行样，于振荡金属浴上30℃，700rpm充分振荡混匀2min。在每个ep管中加入终浓度为1mm的nadp

起始反应，控制总反应体系为200μl(用磷酸钾缓冲液补足)，于振荡金属浴上30℃，700rpm充分振荡混匀反应5min后，迅速向各个ep管中加入等体积(200μl)的乙腈终止反应。1200rpm离心2min，用0.22μm的滤膜过滤处理，用于hplc分析，检测底物反应情况，通过计算蛋白酶的反应速率与底物浓度的关系依据米氏方程测定cyp109b2的动力学参数，其中k
m
值为0.21
±
0.02mm，k
cat
值为3.93
±
0.15min
‑1，通过k
cat
/k
m
衡量其催化活性，即为1.9
×
104m
‑1min
‑1。
123.接着，验证cyp109b2对其他甾体化合物的催化能力，分别以睾酮、去甲睾酮、勃地
龙、孕酮、甲基双烯醇酮、雄烯二酮、肾上腺酮、18
‑
甲基双酮、49物、炔孕酮、坎利酮、泼尼松龙、孕烯醇酮和雌二醇等14种甾体化合物为底物，按照上述方法鉴定cyp109b2对于其他甾体化合物的生物转化情况，通过高效液相色谱测定其催化选择性，并进行体系放大的制备反应，采用硅胶柱层析法分离纯化甾体底物的羟基化产物，计算产物制备得率，然后进一步通过质谱和核磁鉴定其分子结构，结果如图8
‑
10所示，图8和图9中的星号为甾体底物对应的出峰位置。结果显示，cyp109b2对包括睾酮、去甲睾酮、勃地龙和甲基双烯醇酮部分甾体化合物具有高效16β羟基化作用，其中对于睾酮的16β羟基化选择性为83％，转化率>99％，产率63％；对去甲睾酮16β羟基化的选择性为92％，转化率在75％左右，产率36％；对勃地龙16β羟基化的选择性为86％，转化率>99％,产率79％；对甲基双烯醇酮16β羟基化的选择性为71％，转化率>99％，产率62％。并且cyp109b2对雄烯二酮、肾上腺酮、18
‑
甲基双酮、49物和炔孕酮甾体底物也同样具备相对高效的催化作用，其中对雄烯二酮、18
‑
甲基双酮、49物的转化率>99％，对肾上腺酮、炔孕酮的转化率>50％。然而，cyp109b2对一些侧链比较大的甾体底物，如孕酮、坎利酮、泼尼松龙、孕烯醇酮和雌二醇未表现出催化活性，说明侧链大的甾体底物进入cyp109b2蛋白酶的活性口袋比较困难。
124.实施例5实验操作
125.1、cyp109b2、fdr_0978和fdx_1499蛋白的纯化和浓度测定
126.(1)cyp109b2、fdr_0978和fdx_1499蛋白的纯化可通过本领域常规方法获得。制备的纯化的目的蛋白纯酶液用液氮速冻后保存于
‑
80℃，后续备用。
‑
80℃取出的纯酶液在冰上解冻后，用co差谱分析测定cyp109b2的蛋白酶浓度。fdr_0978和fdx_1499蛋白浓度的测定可以使用bradford蛋白浓度测定试剂盒按照本领域常规方法测定。
127.(2)取50μl cyp109b2纯酶液，用100mm，ph 8.0的磷酸钾缓冲溶液稀释至2ml，按照每秒钟1个气泡的速率通入co一分钟，再用移液器分装1ml至另一比色皿中。向其中一个比色皿中加入20mg连二亚硫酸钠，上下颠倒混匀，立即用分光光度计进行波长扫描，波长范围设置为400～500nm，2nm/point。其中没有添加连二亚硫酸钠的一组作为空白对照，另外的作为测定实际p450含量的实验组，分别记录好450nm波长处和490nm波长处相比于空白组的吸光值变化。摩尔消光系数取值0.091m
‑1·
cm
‑1，p450蛋白的浓度按照下列公式计算：
128.p450蛋白浓度(μmol)＝(δa
450
‑
δa
490
)
·
稀释倍数/0.091m
‑1·
cm
‑1129.2、hplc分析
130.为了检测甾体化合物的反应情况，使用配备有fad检测器和agilent zorbax eclipsexdb
‑
c18 column(4.6
×
250mm,5μm；agilent technologies,santa clara,ca,usa)色谱柱的shimadzu lc2030c系统分析样品。流速1.5ml/min,柱温40℃，进样量10μl。分析程序采用梯度洗脱，洗脱程序如下表所示：
131.表1甾体底物液相检测梯度洗脱程序
[0132][0133][0134]
注：流动相a:超纯水流动相b:色谱级甲醇,c:色谱级乙腈.
[0135]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。