一种甘蔗杂种真实性鉴定的分子标记体系及其开发方法与流程

1.本发明涉及生物信息学与分子遗传育种技术领域，尤其涉及一种甘蔗杂种真实性鉴定的分子标记体系及其开发方法。


背景技术：

2.甘蔗是全球最为重要的糖料与能源作物，其蔗糖产量占世界蔗糖产量的80％以上。现代甘蔗栽培种主要由具有高糖含量的热带种和抗逆性强的割手密种杂交而来。但是，热带种和割手密种均为多倍体植物，基因组复杂。热带种是一个含有80条染色体的八倍体(2n＝8x＝80)；割手密种的基因组较热带种更为复杂，其不同材料(clone，克隆)间往往具有不同的染色体组成。目前，已发现从2n＝40至2n＝128多达近40个不同的染色体数目类型的割手密种材料，其基因组包含从四倍体到十三倍体等多种倍性类型。同时，由于甘蔗花为圆锥花序，花结构小且多，人工去雄十分困难，因此，杂交后代杂种真实性鉴定成为甘蔗杂交育种工作关键。但是，至今仍没有建立高效且具有普遍适用性的杂种真实性鉴定方法，严重制约了甘蔗杂交制种工作的开展。
3.近年来，人们通过筛选亲本多态标记方法，尝试进行杂种真实性的筛选工作。其原理是采用现有分子标记在杂交亲本间进行pcr和电泳检测，获取具有多态的标记，并用于杂交后代的杂种真实性检测。这一方法主要存在三个问题：一是，可利用标记数量十分有限。甘蔗基因组十分复杂，分子标记开发进展缓慢，目前所用的标记主要来源于近缘物种如高粱等材料的分子标记，因此，难以获得足够数量的亲本间的多态标记。二是，杂种真实性鉴定过程漏筛严重。由于标记数量少，特别是标记分布不均匀，即获得的标记可能仅仅来源于少数染色体区间，因此在杂种真实性鉴定过程会导致严重的漏筛情况。如，由于重组使得杂交后代未能带有检测标记所覆盖的染色体，则会被认为是假杂种而淘汰，导致漏检。三是，现有标记适用性较差，无法作为通用标记进行杂种真实性利用。例如，某一标记在某一杂交亲本组合间具有多态，但在其它亲本组合间无差异等。这主要是由于标记并未进行种内筛选，不具备种内保守性导致。这些问题严重制约了甘蔗杂交制种工作的开展，因此，亟待针对甘蔗现代栽培种的两个亲本种进行标记开发，建立种内保守、覆盖不同染色体的种间多态标记体系。开发上述多态标记将对甘蔗杂种真实性鉴定起到极大推动作用，也将对甘蔗遗传育种工作开展提供重要借鉴。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种甘蔗杂种真实性鉴定的分子标记体系及其开发方法，通过采用生物信息分析进行两个物种基因组序列比较分析，获得差异dna序列，并设计分子标记引物、电泳检测后，筛选种内保守、种间多态且覆盖不同染色体的标记；该标记可大大降低漏检率，且具有较高适用性，为甘蔗杂种真实性鉴定提供了一种可靠、高效的新方法。
5.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
6.一种甘蔗杂种真实性鉴定的分子标记体系，所述分子标记体系由8个来自不同染色体且在割手密种和热带种间具有多态的分子标记构成，名称分别为ssch1、ssch2、ssch3、ssch4、ssch5、ssch6、ssch7及ssch8；其扩增引物的核苷酸序列分别为seq id no.1
‑
16所示。
[0007][0008][0009]
本发明还提供了一种甘蔗杂种真实性鉴定的分子标记体系的开发方法，包括如下步骤：
[0010]
步骤1、首先，采用生物信息分析方法比对热带种和割手密种基因组，获得两者具有差异的同源dna序列；
[0011]
步骤2、根据上述差异的dna序列分别设计引物；
[0012]
步骤3、分别采用多个热带种和割手密种材料进行pcr扩增和聚丙烯凝胶电泳检
测，获得在种间具有多态，且种内具有保守性的标记；
[0013]
步骤4、选取符合以下标准8个标记：标记在两个种间呈现差异带型、标记在种内材料间具有高度保守带型、标记来自不同染色体，即每条染色体各选取1个标记，共计8个标记作为杂种真实性鉴定标记体系。
[0014]
优选地，所述步骤(3)中，pcr扩增的条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸60s，28个循环，72℃终延伸10min。
[0015]
优选地，所述步骤(3)中，所述pcr扩增反应体系为：上下游引物各为0.25μl，dna模板2μl，pcrmix 5μl，最后加入ddh2o将总体积补足至10μl。
[0016]
优选地，所述步骤(3)中，聚丙烯凝胶电泳检测条件为：上样量为1ul，采用180v恒压进行电泳1h 40min，电泳后采用硝酸银染色15min，超纯水清洗后采用氢氧化钠/甲醛显色。
[0017]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0018]
1、本发明所开发标记是针对甘蔗材料，经热带种和割手密种基因组比较开发，扩增效果稳定、带型清晰，针对甘蔗材料具有较好适用性。
[0019]
2、本发明所开发标记分布于不同染色体，基因组覆盖度好，可极大降低真实杂种漏检率。
[0020]
3、本发明标记经检测，在种内具有稳定带型，因此，可适用于不同亲本组合间杂交的后代杂种真实性鉴定，具有很高的通用性，利于推广应用。
附图说明
[0021]
图1为本发明开发的8个标记的电泳结果图。m为分子量marker，泳道1
‑
19为19个割手密材料，泳道20
‑
26为7个热带种材料，泳道27为一个割手密和热带种杂交种f1材料。八个标记ssch1
‑
ssch8分别标记在图片左上角。
具体实施方式
[0022]
下面结合附图将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0023]
实施例1：热带种和割手密种的同源差异dna序列获得
[0024]
使用repeatmasker软件过滤热带种和割手密种基因组中的重复序列，然后，以5个碱基为间隔，将基因组打断成50bp的dna序列，并将这些短序列回帖到基因组，进一步验证序列的基因组来源。将两个基因组来源的短序列进行blast序列比对的方法相互比对，从而获得同源且具有差异dna序列。
[0025]
本发明使用全基因组序列信息，采用repeatmasker软件过滤重复序列，经过相互比对获得两个甘蔗种间全基因组水平的差异dna序列信息。
[0026]
需要说明的是，这里使用的repeatmasker软件过滤重复序列和blast序列比对的方法为现有技术，且也并非本发明重点保护的技术方案，因此其比对的具体步骤在这里不
再详细阐述。
[0027]
实施例2：差异dna序列的引物设计与pcr扩增
[0028]
利用引物设计软件primer premier 5.0对差异dna序列进行引物设计，引物设计时要求引物的长度20
±
5bp，且引物应设计在差异序列两端的保守区。
[0029]
pcr的反应体系为：引物为各0.25μl，dna模板2μl，pcrmix 5μl，最后加入ddh2o将总体积补足至10μl。
[0030]
pcr扩增的条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸60s，28个循环，72℃终延伸10min。
[0031]
实施例3：pcr产物的电泳检测
[0032]
本发明采用的电泳为聚丙烯酰胺电泳，流程为：
[0033]
1、将胶槽安装完毕，配置聚丙烯酰胺凝胶工作液(8％聚丙烯酰胺，300ul10％ap，60ul temed)，并灌入胶槽。
[0034]
2、待胶凝固后，加入1
×
tbe电泳缓冲液(10.8g tris，5.5g硼酸，4ml edta(0.5m,ph 8.0)，超纯水80ml，定容至100ml)。
[0035]
3、将pcr产物加入2ul上样缓冲液，取1ul点入制备好的凝胶点样孔中。
[0036]
4、采用180v恒压进行电泳100分钟。
[0037]
5、结束电泳，卸下凝胶放入染胶液(1l纯水加入1g硝酸银溶解)，摇床上水平旋转染制15min。
[0038]
6、用超纯水清洗凝胶两次，每次30s。
[0039]
7、倒入显色液(15g氢氧化钠，3ml甲醛溶液，用超纯水定容至1l)，水平摇床旋转显色，待条带清晰可见后倒掉显色液，用超纯水清洗两次。
[0040]
参照图1，本发明的8个标记可用来检测热带种和割手密种杂种真实性。八个标记在两个种间存在明显多态带型，且在种内不同材料间(割手密种为泳道1
‑
19；热带种材料为20
‑
26泳道)具有高度保守带型，而f1材料(27泳道)呈现杂合带型。
[0041]
从图片可以看出，8个标记在割手密种和热带种间具有明显的差异带型，同时，在各自种内不同材料间带型基本一致，具有较高的保守性。并且，在杂种f1可检测到杂合带型，印证可用来检测杂种真实性。
[0042]
本发明中披露的说明和实践，对于本技术领域的普通技术人员来说，都是易于思考和理解的，且在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，也应视为本发明的保护范围。