一种提高解脂耶氏酵母单位菌体虾青素含量的发酵方法与流程

本发明涉及微生物发酵领域，特别是涉及一种提高解脂耶氏酵母单位菌体虾青素含量的发酵方法。

背景技术：

1、虾青素（3,3'-二羟基 -β,β'-胡萝卜素-4,4'-二酮）是一种高价值类胡萝卜素，具备极强的自由基清除能力，抗氧化活性显著高于β-胡萝卜素、维生素e等物质，在功能食品、保健品、化妆品、水产养殖饲料、医药领域具备广阔应用前景。

2、目前工业化虾青素主要来源分为化学合成法、天然提取法与微生物发酵法三类。化学合成的虾青素产物为多种立体异构体混合物，生物利用度偏低，含有机合成副产物，多数国家限制其直接应用于人类保健食品；从虾蟹加工副产物天然提取虾青素产量极低、原料供应不稳定、提取成本高昂，难以进行规模化供应。雨生红球藻是天然左旋虾青素主流生产菌株，但存在培养周期长、依赖光照、易污染、细胞壁厚、产物提取难度大等短板；红法夫酵母作为天然产虾青素酵母，存在发酵温度区间窄、菌株易退化、虾青素胞内积累水平有限等问题。解脂耶氏酵母（

yarrowia lipolytica）属于安全级的非常规产油酵母，可利用多种廉价碳源，胞内乙酰辅酶a供给充足，天然具备脂质储存细胞器，能够为疏水性类胡萝卜素提供储存位点，是构建虾青素细胞工厂极具潜力的底盘微生物。

3、现有研究通过异源表达crti、crtyb、crtw、crtz等途径基因，成功实现解脂耶氏酵母从头合成虾青素。当前提升解脂耶氏酵母虾青素产能的策略多集中于代谢途径基因改造、培养基组分优化、总发酵效价提升。但工程菌株普遍存在突出瓶颈：菌体生长阶段与虾青素合成阶段代谢需求冲突，单纯提高生物量往往无法同步提升胞内产物富集水平，单位菌体虾青素含量（mg/g·dcw）偏低。单位菌体含量直接决定后续菌体干燥、破壁、萃取工段的物料处理量、溶剂消耗与生产成本；若单位菌体虾青素积累量不足，即便发酵液总虾青素浓度有所提升，下游分离纯化成本仍居高不下，制约产业化落地。因此，开发能够有效提升解脂耶氏酵母的单位菌体虾青素含量、促进胞内虾青素高效富集、工艺易于放大的发酵调控方法，对推动解脂耶氏酵母生物合成虾青素工业化生产具有重要现实意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种提高解脂耶氏酵母单位菌体虾青素含量的发酵方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过优化氮源供给策略或碳源分阶段补料策略，提升了胞内虾青素富集效率，在保障菌体基本生物量的前提下显著提高单位菌体产物积累量，从而降低下游菌体处理及分离纯化成本，推动虾青素的工业化绿色制造。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种提高解脂耶氏酵母单位菌体虾青素含量的发酵方法，包括以下（1）或（2）所示的方法：

4、（1）在解脂耶氏酵母的发酵过程中，补料葡萄糖和玉米浆干粉，并控制葡萄糖与玉米浆干粉的质量比为（3～5）:1，以限制氮源供给；

5、（2）在解脂耶氏酵母的发酵前期，以葡萄糖为碳源进行补料；当发酵液中的菌体浓度od600达到200-300时，将补料碳源替换为葡萄糖和醋酸钠组成的复合碳源，进行中后期补料发酵。

6、优选的是，在方法（1）中，所述葡萄糖和所述玉米浆干粉的质量比为4:1。

7、优选的是，在方法（1）中，所述补料的时机为：发酵前期，当初始培养基中的葡萄糖碳源消耗完时，发酵体系溶解氧浓度将出现回升且超过50%，以该溶氧回升节点作为补料启动信号，开启葡萄糖补料程序，补料的初始速率设定为10 ml/(h・l)，之后每间隔2 h补料速率提升4 ml/(h・l)，整个补料阶段控制发酵液残糖浓度为1～4 g/l。

8、优选的是，在方法（1）中，发酵过程中以氢氧化钠溶液或者氢氧化钾溶液作为ph调节剂，控制ph恒定在5.5；发酵温度控制在28 ℃。

9、优选的是，在方法（2）中，所述补料的时机为：发酵前期，当初始培养基中的葡萄糖碳源消耗完时，发酵体系溶解氧浓度将出现回升且超过50%，以该溶氧回升节点作为补料启动信号，开启葡萄糖补料程序，补料的初始速率设定为10 ml/(h・l)，之后每间隔2 h补料速率提升4 ml/(h・l)，整个补料阶段控制发酵液残糖浓度为0～1 g/l；

10、发酵进入中后期，采用所述复合碳源进行补料时，葡萄糖补料速率设定为2～3 g/(h·l)，醋酸钠补料速率设定为1 g/(h·l)。

11、优选的是，在方法（2）中，所述复合碳源中葡萄糖和醋酸钠的质量比为（1-3）:1。

12、更优选的是，在方法（2）中，所述复合碳源中葡萄糖和醋酸钠的质量比为2:1。

13、优选的是，在方法（2）中，补料阶段当检测到发酵液中铵离子浓度低于0.1 g/l时，用氨水将发酵体系的ph值调控至6.0。

14、优选的是，所述解脂耶氏酵母的保藏编号为cgmcc no.31853。

15、优选的是，在方法（1）和（2）中，发酵初始阶段的工艺参数设置为：搅拌转速为300rpm、通气量为1 vvm，发酵罐罐压为0.03 mpa。

16、本发明公开了以下技术效果：

17、本发明针对解脂耶氏酵母发酵生产虾青素过程中单位菌体含量偏低的技术瓶颈，分别从氮源供给和碳源组成两个维度提出了有效的发酵调控策略，两者均可独立显著提升单位菌体的虾青素富集能力。

18、在氮源调控方面，依托氮源流加调控菌体生长峰值，从生长调控层面提高单位菌体虾青素含量。具体地，通过限制葡萄糖与玉米浆干粉补料的质量比，精准控制氮源供给以调节菌体生长上限，使代谢流更多转向产物合成。结果表明，当补料质量比为4:1时，单位菌体虾青素含量可达3.3%，较未限氮对照组（1.6%）提升约一倍，有效降低了菌体过度增殖带来的温控负担和下游处理规模。

19、在碳源调控方面，通过碳源优化筛选，采用葡萄糖与醋酸钠分段供给模式，从代谢底物供给层面强化虾青素合成，提升单位菌体产物含量。具体地，本发明采用发酵前期葡萄糖补料、中后期切换为葡萄糖-醋酸钠复合碳源的分阶段补料策略，该方案在基本维持菌体生物量的前提下，将单位菌体虾青素含量从单一葡萄糖对照组的1.85%提升至3.25%，提升幅度约75%。

20、综上，本发明操作简便、易于工业放大，能够有效压缩菌体干燥、破壁、萃取等下游工段的物料处理量和生产成本，为解脂耶氏酵母虾青素的产业化生产提供了可靠的发酵技术支撑。

1.一种提高解脂耶氏酵母单位菌体虾青素含量的发酵方法，其特征在于，包括以下（1）或（2）所示的方法：

2.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，在方法（1）中，所述葡萄糖和所述玉米浆干粉的质量比为4:1。

3.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，在方法（1）中，所述补料的时机为：发酵前期，当初始培养基中的葡萄糖碳源消耗完时，发酵体系溶解氧浓度将出现回升且超过50%，以该溶氧回升节点作为补料启动信号，开启葡萄糖补料程序，补料的初始速率设定为10 ml/(h・l)，之后每间隔2 h补料速率提升4 ml/(h・l)，整个补料阶段控制发酵液残糖浓度为1～4 g/l。

4.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，在方法（1）中，发酵过程中以氢氧化钠溶液或者氢氧化钾溶液作为ph调节剂，控制ph恒定在5.5；发酵温度控制在28 ℃。

5.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，在方法（2）中，所述补料的时机为：发酵前期，当初始培养基中的葡萄糖碳源消耗完时，发酵体系溶解氧浓度回升且超过50%，以该溶氧回升节点作为补料启动信号，开启葡萄糖补料程序，补料的初始速率设定为10 ml/(h・l)，之后每间隔2 h补料速率提升4 ml/(h・l)，整个补料阶段控制发酵液残糖浓度为0～1g/l；

6.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，在方法（2）中，所述复合碳源中葡萄糖和醋酸钠的质量比为（1-3）:1。

7.如权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，在方法（2）中，所述复合碳源中葡萄糖和醋酸钠的质量比为2:1。

8.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，在方法（2）中，补料阶段当检测到发酵液中铵离子浓度低于0.1 g/l时，用氨水将发酵体系的ph值调控至6.0。

9.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述解脂耶氏酵母的保藏编号为cgmccno.31853。

10.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，在方法（1）和（2）中，发酵初始阶段的工艺参数设置为：搅拌转速为300 rpm、通气量为1 vvm，发酵罐罐压为0.03 mpa。