一种利用食品加工尾水发酵生产聚羟基脂肪酸酯（PHA）的方法及应用与流程

本发明涉及生物基材料制造，具体为一种利用食品加工尾水发酵生产聚羟基脂肪酸酯（pha）的方法及应用。

背景技术：

1、屠宰加工、肉制品加工和水产品加工过程中会产生兼含可溶性蛋白、铵态氮、悬浮颗粒和动植物油的高有机过程尾水。常规处理通常把油脂视为影响生物处理的负荷，通过气浮除去后作为低值废油处置；可溶性氮则在后续生化单元中被去除。上述路线能够降低污染负荷，但没有充分利用油脂碳源和蛋白氮源。

2、pha是由多种微生物在营养不平衡条件下细胞内合成的聚酯。cupriavidusnecator在营养充足阶段需要碳、氮、磷及微量元素快速增殖，在碳源充足而氮受限阶段则把碳流导向pha积累。同一股含油食品加工尾水同时含氮和油脂，若不分级直接用作培养基，油脂的乳化和传质会妨碍增殖，持续输入的含氮组分又会削弱积累阶段所需的氮限制。

3、现有尾水制pha方案多采用整股废水酸化后供混合菌群利用，或以常规培养基增殖后另加商品脂肪酸。单独采用气浮、脂肪酶水解、两阶段发酵或溶解氧控制均不能解决同一尾水中碳氮组分在两个生理阶段需求相反的问题；而把含油相直接高剂量投罐还可能造成长链脂肪酸抑制和氧传递波动。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供一种利用食品加工尾水发酵生产聚羟基脂肪酸酯（pha）的方法及应用，以同一股尾水的油水分相为起点，把含氮水相用于增殖，把洗后低氮油相用于积累，避免额外设置相互独立的商品碳源和有机氮源。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种利用食品加工尾水发酵生产聚羟基脂肪酸酯（pha）的方法，包括以下步骤：

3、s1、将含油食品加工尾水除渣后经气浮分离为水相液和含油浓缩相。

4、s2、采用水对含油浓缩相进行至少两级逆流洗涤，将洗涤出液并入水相液，经水解、澄清、营养调节和灭菌制成菌体增殖液；将洗涤后的含油浓缩相经脂肪酶水解、固液分离、ph调节和灭菌，制成总有机碳与总氮质量比不低于30的pha积累液。

5、s3、将cupriavidus necator接种于菌体增殖液，以补料方式进行第一阶段有氧培养；当发酵液中铵态氮不高于50 mg/l，且暂停供入菌体增殖液5-15 min内、以空气饱和度计的溶解氧相对于暂停时回升至少10个百分点时，停止供入菌体增殖液。

6、s4、除pha积累液随带的尾水来源含氮组分外，在不另行补入含氮营养物的条件下，分段或连续供入pha积累液，使发酵液中以油酸计的游离脂肪酸维持在0.2-1.5 g/l，进行第二阶段有氧培养。

7、s5、分离含pha菌体并提取pha。

8、进一步地，含油食品加工尾水来自屠宰加工、肉制品加工或水产品加工过程，并在主体生物处理单元之前汇集；除渣后化学需氧量为2000-20000 mg/l、动植物油为0.2-5.0g/l、总氮为80-1500 mg/l、ph为5.5-8.5、总余氯不高于0.5 mg/l。

9、该优选方案的作用在于：把原料限定在主体生物处理之前，可保留供发酵利用的油脂和可溶性氮；同时用cod、动植物油、总氮、ph及总余氯共同界定可处理窗口，避免把有机物已被深度去除或余氯仍具明显抑菌作用的终端排水误纳入保护范围。

10、进一步地，气浮溶气压力为0.35-0.55 mpa、回流比为20%-40%、停留时间为15-30min；采用两级或三级逆流洗涤，温度为45-60℃，加水总质量与含油浓缩相质量之比为0.5-2.0∶1，新水加入末级并依次逆向进入前级。

11、该优选方案的作用在于：气浮参数先将油脂集中到可洗涤的浓缩相，两级或三级逆流洗涤再以较少新水把夹带的可溶性氮逆向带回水相。该操作同时提高增殖侧的含氮营养回收率和积累侧的碳氮比，是后续两阶段培养能够配合的物料基础。

12、进一步地，水相液和洗涤出液在45-55℃、ph 6.5-7.5下按每克可溶性蛋白500-2000 u加入中性蛋白酶，水解2-6 h；澄清后加入不超过最终体积10%的同源pha积累液，把总有机碳与总氮质量比调至8-18，并补充磷、镁和微量元素。除尾水来源组分外不加入非尾水来源的有机碳源和有机氮源，尾水来源液体不低于最终体积的85%。

13、该优选方案的作用在于：中性蛋白酶把水相中的大分子蛋白转化为较易利用的肽和氨基酸；用少量同源积累液调节碳氮比，可在不引入外源有机碳氮的前提下补足增殖碳源。尾水来源液体比例和碳氮比共同保证该培养液既具有资源化实质，又能支持稳定增殖。

14、进一步地，洗涤后的含油浓缩相按每克油脂500-3000 u加入脂肪酶，在38-48℃、ph 7.0-8.0下水解3-8 h，使油脂水解率不低于60%；去除不溶性蛋白并均质后，积累液中以油酸计游离脂肪酸为20-80 g/l、总有机碳与总氮质量比为30-100、乳滴中位粒径为5-30 μm。

15、该优选方案的作用在于：罐外脂肪酶水解把甘油三酯预先转化为可摄取的游离脂肪酸，去除不溶性蛋白并控制乳滴粒径可减少氮夹带和油滴聚并。游离脂肪酸浓度、碳氮比及d50三项指标共同限定积累液的碳源强度、氮限制程度和传质状态。

16、进一步地，菌株为cupriavidus necator dsm 545或h16。发酵前以菌体增殖液按20%、40%、60%、80%和100%的体积比例依次替代含果糖和硫酸铵的种子培养基，每一比例传代2-4次；本级延滞期不超过8 h，且培养样品经等体积取样、离心洗涤并重悬至原体积后在600 nm处的终点吸光度较上一替代比例下降不超过10%时，再进入下一级。

17、该优选方案的作用在于：递增替代培养使菌体逐步适应尾水中的盐分、有机酸和痕量抑制物；以延滞期和经洗涤重悬后的od变化作为进入下一级的双重条件，可避免原液浊度造成的假性适应判断。

18、进一步地，第一阶段接种量为5%-15%、温度为28-33℃、ph为6.8-7.2、溶解氧为30%-50%，采用初装结合补料培养8-24 h；优选在铵态氮不高于30 mg/l且暂停补料10 min内溶解氧回升至少15个百分点时转段。第二阶段温度为28-33℃、ph为6.8-7.2、溶解氧为20%-40%，培养18-48 h；在停止供入pha积累液的状态下，当游离脂肪酸低于0.3 g/l且5min内溶解氧回升至少8个百分点时开始或恢复供料，当游离脂肪酸达到0.8-1.0 g/l或溶解氧低于20%时暂停供料。

19、该优选方案的作用在于：第一阶段用铵态氮阈值表征氮源接近耗尽，用暂停含氮补料后的do回升表征易利用底物摄取下降；第二阶段再以停料状态下的游离脂肪酸和do响应决定恢复供料，以供料状态下的脂肪酸上限或低do决定暂停。两组信号分别约束转段和底物抑制，避免仅按培养时间或累计加料量控制。

20、进一步地，培养结束后采用孔径0.1-0.2 μm错流膜截留菌体。透过液经热处理后作为下一批第一级洗涤补充液，占该级总洗涤液体积的10%-30%；浓缩菌体经高压均质破壁、酶解除去非pha细胞物质、水洗和干燥，得到pha。未回用发酵液进入主体生物处理单元，pha用于制造可降解包装膜、包装内托或农用覆盖材料。

21、该优选方案的作用在于：错流膜先实现菌体与发酵液分离，热处理后的透过液只回到下一批第一级洗涤，使其残余氮最终随首级洗涤出液进入增殖侧，而不直接污染完成末级洗涤的油相。该回用位置兼顾节水和积累液低氮稳定性。

22、与现有技术相比，本发明提供了一种利用食品加工尾水发酵生产聚羟基脂肪酸酯（pha）的方法及应用，具备以下有益效果：本发明以同一股尾水的油水分相为起点，把含氮水相用于增殖，把洗后低氮油相用于积累，避免额外设置相互独立的商品碳源和有机氮源。逆流洗涤不是单纯净化油相：其一方面把油相夹带的可溶性氮转移至增殖液，提高前段可利用氮回收；另一方面提高积累液碳氮比，强化后段氮限制，因而在两个阶段产生方向一致的协同作用。

23、在罐外用脂肪酶把甘油三酯预先转化为游离脂肪酸，降低了对菌株胞外脂解能力的依赖；配合乳滴粒径控制，提高疏水底物的可利用性和批次可复制性。铵态氮阈值确认氮接近耗尽，暂停补料后的溶解氧回升反映易利用底物摄取速率下降；两者共同满足后再转段，可降低仅按时间或单一氮指标造成的过早、过晚切换。第二阶段以游离脂肪酸残余和溶解氧联合启停供料，使碳源保持过量而不过度累积，减少高浓度长链脂肪酸对膜结构、氧传递和细胞活性的影响。错流截留后的部分透过液返回下一批第一级洗涤，其残余氮随首级洗涤出液进入增殖液，而不会直接接触已完成末级洗涤的油相，兼顾水回用和低氮积累液稳定性。