一株高效利用纤维素水解液中木糖的马克斯克鲁维酵母菌株及其应用

本发明属于生物工程，涉及一种高效利用带渣未脱毒纤维素水解液中木糖的马克斯克鲁维酵母菌株及其应用，具体涉及一种通过代谢工程和适应性进化来获得能高效利用未脱毒纤维素水解液的菌株，适用于木质纤维素生物质转化为生物乙醇的工业化生产。

背景技术：

1、木质纤维素是储量最丰富的可再生生物质资源，以其为原料生产燃料乙醇，能缓解化石能源短缺并降低碳排放，具有重要经济和社会意义。木质纤维素经预处理和酶解糖化后，纤维素水解为葡萄糖，半纤维素水解为木糖，二者共同构成水解液中的主要可发酵糖。木糖作为木质纤维素水解液中含量第二高的可发酵糖（lee, j.w., et al.engineering xylose metabolism in yeasts to produce biofuels and chemicals.current opinion in biotechnology, 2021,67,15-25.），其高效利用是提升纤维素乙醇生产效率的关键。

2、然而，当前纤维素乙醇生产面临诸多瓶颈：多数微生物缺乏高效木糖转运系统和代谢途径，木糖利用速率远低于葡萄糖；木质纤维素预处理产生的呋喃醛、5-羟甲基糠醛、酚类物质及甲酸、乙酸等小分子有机酸，严重阻碍微生物生长和发酵；葡萄糖对木糖代谢的碳代谢产物抑制（ccr）导致木糖利用率低，乙醇生产效率和产率均较低（zhang, y.w., etal. engineering a xylose fermenting yeast for lignocellulosic ethanolproduction. nature chemical biology, 2025, 21(3), 443-450.）。

3、马克斯克鲁维酵母（

kluyveromyces marxianus）作为安全级（gras）微生物，具有耐热性强、生长速率快、底物谱广等优势，能天然利用葡萄糖、木糖等多种碳源（baptista,m., et al.

kluyveromyces marxianusas a microbial cell factory forlignocellulosic biomass valorisation. biotechnology advances, 2022, 60,108027.），是纤维素乙醇生产的潜力菌株。但野生型菌株木糖代谢速率慢、抑制物耐受性不足，限制了其工业应用。现有技术多通过单一策略，如通过基因工程技术过表达木糖转运蛋白、木糖还原酶等，或进行适应性进化改良菌株，但难以同时解决木糖利用、抑制物耐受，以及葡萄糖抑制等多重难题，亟需开发结合多策略代谢工程和菌株驯化的性能优异的菌株，达到不脱毒纤维素水解液中混合糖直接发酵的目标。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的在于提供一种高效利用带渣未脱毒纤维素水解液中木糖的马克斯克鲁维酵母菌株及其应用，该马克斯克鲁维酵母菌株能够耐受带渣未脱毒纤维素水解液中的混合抑制物，实现高效利用未脱毒纤维素水解液中葡萄糖和木糖等混合糖转化为生物乙醇，乙醇产量较高、生产效率较高、成本较低，为纤维素乙醇工业化提供菌种支持。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一株高效利用未脱毒纤维素水解液中木糖的马克斯克鲁维酵母（

kluyveromyces marxianus）1727-5-x11，于2025年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no.39110。

4、基于上述技术方案，进一步地，所述的马克斯克鲁维酵母1727-5-x11是通过代谢工程策略及适应性进化筛选得到，能在固含量为20~30%未脱毒含渣纤维素水解液中高效利用葡萄糖和木糖产乙醇，乙醇生产速率达0.45 g/l/h以上。

5、基于上述技术方案，进一步地，所述的代谢工程策略是基于马克斯克鲁维酵母1727-5菌株改造而成（保藏编号为：cgmcc no.16757），改造步骤包含引入木糖转运蛋白，加强非氧化磷酸戊糖途径，促进辅因子平衡，敲除碳代谢抑制、乙醇消耗相关基因和优化代谢流，降低木糖醇积累。

6、基于上述技术方案，进一步地，所述的适应性进化筛选是采用接种量逐级降低、纤维素水解液浓度梯度升高的联合策略，于菌体对数生长末期连续传代，完成细胞加压驯化。

7、基于上述技术方案，进一步地，所述的马克斯克鲁维酵母1727-5-x11的全基因组重测序显示该菌株含15个编码区突变（9个snp和6个indel），关键突变靶点包括谷胱甘肽转移酶3（gst3）、转酮醇酶（tkl）、1,3-β-葡聚糖合成酶亚基、α-1,3-甘露糖转移酶、磷脂转运p型atp酶、絮凝蛋白flo11、g1/s期特异性周期蛋白cln1、核孔复合体支架nup192、组蛋白去乙酰化酶复合物亚基、前体mrna剪接因子8、rna甲基转移酶及真菌特异性转录因子和3个假定蛋白，这些突变获得了优秀表型。

8、第二方面，本发明提供上述的马克斯克鲁维酵母1727-5-x11高效利用未脱毒纤维素水解液发酵产生物乙醇的方法，包括如下步骤：将所述的马克斯克鲁维酵母1727-5-x11接种到未脱毒纤维素水解液中，初始接种量od620nm为1~5，20~35℃下搅拌发酵50~100h后得到生物乙醇。

9、基于上述技术方案，进一步地，所述的发酵所用的发酵罐为通气搅拌式发酵罐，搅拌转速为150~250 rpm，通气量为0.3~0.8 vvm，初始接种量od620nm为2~4，发酵时间为60~80h。

10、基于上述技术方案，进一步地，所述的发酵罐的容积为5 l，装液量为1.5~2.5 l。

11、基于上述技术方案，进一步地，所述的未脱毒纤维素水解液的制备方法如下：将2~5 wt%的稀硫酸水溶液喷洒到粉碎至1~5cm的干燥生物质上进行预处理，随后在180~240℃和1~4 mpa下蒸汽爆破3~10分钟，然后迅速释放压力至常压；加水制备成20~30%固含量的纤维素水解液，调节ph值至4.5~5.5，加入纤维素酶，添加量为5~20 fpu/g干物质，在40~55℃下酶解糖化60~90 h，添加0.5~1.5wt%玉米浆，获得带渣的未脱毒纤维素水解液。

12、基于上述技术方案，进一步地，所述的生物质包括玉米秸秆。

13、基于上述技术方案，进一步地，所述的未脱毒纤维素水解液中的抑制物包含3~4g/l乙酸，1~2 g/l甲酸，0.5~1 g/l 5-羟甲基糠醛，0.4~0.8 g/l糠醛和0.05~0.10 g/l香草醛。

14、基于上述技术方案，进一步地，在接种到未脱毒纤维素水解液中前，所述的马克斯克鲁维酵母1727-5-x11依次经活化和种子培养。

15、基于上述技术方案，进一步地，活化培养条件为25~35℃、100~300 rpm，培养时间12~36 h，活化培养基为ypd培养基。

16、基于上述技术方案，进一步地，种子培养的接种量为5~10%，培养条件为25~35℃、100~300 rpm，培养时间30~45 h；种子培养基的配方为：15~25 g/l蛋白胨，5~15 g/l酵母浸粉，15~25 g/l木糖。

17、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

18、本发明以马克斯克鲁维酵母1727-5为底盘细胞，集成代谢工程精准改造和适应性进化定向筛选，同步突破木糖利用弱、葡萄糖抑制、抑制物毒性、木糖醇高积累四大瓶颈，获得的突变菌株可直接用于未脱毒含渣纤维素水解液，乙醇产量较高、生产效率较高、成本较低，为纤维素乙醇工业化提供菌种支持。