一种联合适应性进化和体内连续进化获得维生素B12高产菌的方法及其应用

本发明涉及微生物诱变育种及生物工程，特别是涉及一种联合适应性进化和体内连续进化获得维生素b12高产菌的方法及应用。

背景技术：

1、维生素b12是一种重要的辅酶，在人体代谢中起着不可替代的作用，尤其是在dna合成、红细胞形成和维持神经功能等方面承担非常重要的角色。维生素b12是一种重要的活性物质，也是许多微生物、动植物的生长因子。它主要以辅酶的形式作用于生物体内的各种代谢活动，如促进甲基的转移、由核苷酸合成脱氧核苷酸，促进乙酰coa合成等代谢。维生素b12能促进人体中红细胞的生长发育，当人体维生素b12供给不足时，会造成恶性贫血，也可能会增加高甘氨酸尿症、心脑血管疾病和癌症的患病机率。

2、目前，工业上生产维生素b12主要依赖脱氮假单胞菌和费氏丙酸杆菌等菌株。脱氮假单胞菌和费氏丙酸杆菌发酵周期长。随着合成生物学和代谢工程技术的发展，大肠杆菌作为一种模式微生物，因其遗传背景清晰、培养条件简单、生长速度快等优势，逐渐成为维生素b12合成研究的新底盘细胞。但大肠杆菌合成维生素b12的初始能力有限，需要通过有效的育种手段对其进行改造，以提高维生素b12的产量。

3、传统的诱变育种方法如紫外线诱变、化学诱变等，存在突变率低、突变位点单一、遗传稳定性差等问题。而体内连续进化技术作为一种新型的育种手段，能够在活细胞内实现诱变，提高突变率，使菌株或基因能够在数天至数周内完成自然条件下数十万至数百万年的进化。目前，常见的体内连续进化技术包括基于易错dna复制、dna碱基修饰和dna重组三大突变机制的系统。然而，单一的体内连续进化技术往往存在突变谱窄、突变负荷与细胞活力难以平衡等问题，难以满足复杂代谢途径优化的需求。

4、此外，如何建立有效的定向筛选方法，将维生素b12的生产与菌株的生长偶联起来，也是提高育种效率的关键。传统的筛选方法往往需要复杂的检测手段，筛选效率低、成本高，难以大规模应用。

5、因此，开发一种联合多种体内连续进化技术，并结合定向筛选方法的育种策略，对于推动维生素b12的工业化生产具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种联合适应性进化和体内连续进化获得维生素b12高产菌的方法及其应用；

2、通过适应性进化工具，在体内连续传代培养不断积累有利突变，实现高产菌株的定向筛选，无需复杂的逐株检测即可高效富集高产菌株，有效解决了传统育种和单一体内连续进化存在的缺陷，大幅提升了育种效率。

3、本发明的另一个目的提供通过联合适应性进化和体内连续进化获得维生素b12高产菌的方法制备得到的维生素b12高产菌。获得的维生素b12高产菌遗传稳定性好，维生素b12合成能力显著提升，可应用于维生素b12的工业化发酵生产，为降低维生素b12的生产成本、推动产业升级提供了新的技术路径。

4、为实现本发明的目的所采用的技术方案是：

5、第一方面，在本技术中公开一种维生素b12高产菌，所述维生素b12高产菌的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。

6、seq id no.1为：msvqqidwdlaliqkynysgprytsyptalefsedfgeqaflqavaryperplslyvhipfchklcyfcgcnkivtrqqhkadqyldaleqeivhraplfagrhvsqlhwgggtptylnkaqisrlmkllrenfqfnadaeisievdpreieldvldhlraegfnrlsmgvqdfnkevqrlvnreqneefifallnhareigftstnidliyglpkqtpesfaftlkrvaelnpdrlsvfnyahlptifaaqrkikdadlpspqqkldilqetiafltqsgyqfigmdhfarpddelavaqregvlhrnfqgyttqgdtdllgmgvsaismigdcyaqnqkelkqyyqqvdeqgnalwrgialtrddcirrdvikslicnfrldyapiekqwdlhfadyfaedlkllaplakdglvdvdekgiqvtakgrllirnicmcfdtylrqkarmqqfsrvi。

7、seq id no.2为：mqnsalkawldssylsganqswieqlyedfltdpdsvdanwrstfqqlpgtgvkpdqfhsqtreyfrrlakdasrysstisdpdtnvkqvkvlqlinayrfrghqhanldplglwqqdkvadldpsfhdlteadfqetfnvgsfasgkktmklgellealkqtycgpigaeymhitsteekrwiqqriesgratfnseekkrflseltaaeglerylgakfpgakrfsleggdalipmlkemirhagnsgtrevvlgmahrgrlnvlvnvlgkkpqdlfdefagkhkehlgtgdvkyhmgfssdfqtdgglvhlalafnpshleivspvvigsvrarldrldepssnkvlpitihgdaavtgqgvvqetlnmskargyevggtvrivinnqvgfttsnpldarstpyctdigkmvqapifhvnaddpeavafvtrlaldfrntfkrdvfidlvcyrrhghneadepsatqplmyqkikkhptprkiyadkleqekvatledatemvnlyrdaldagdcvvaewrpmnmhsftwspylnhewdeeypnkvemkrlqelakristvpeavemqsrvakiygdrqamaageklfdwggaenlayatlvdegipvrlsgedsgrgtffhrhavihnqsngstytplqhihngqgafrvwdsvlseeavlafeygyataeprtltiweaqfgdfangaqvvidqfissgeqkwgrmcglvmllphgyegqgpehssarlerylqlcaeqnmqvcvpstpaqvyhmlrrqalrgmrrplvvmspksllrhplavssleelangtflpaigeideldpkgvkrvvmcsgkvyydlleqrrknnqhdvaivrieqlypfphkamqevlqqfahvkdfvwcqeeplnqgawycsqhhfrevipfgaslryagrpasaspavgymsvhqkqqqdlvndalnve。

8、所述维生素b12高产菌是通过联合适应性进化和体内连续进化方法获得的。

9、第二方面，在本技术中公开一种联合适应性进化和体内连续进化获得维生素b12高产菌的方法，所述方法包括以下步骤：

10、步骤（1）构建维生素b12和甲硫氨酸营养缺陷型菌株：以能够合成维生素b12的大肠杆菌为出发菌株，敲除甲硫氨酸合成酶基因

mete，得到维生素b12和甲硫氨酸营养缺陷型菌株，建立维生素b12生产与生长偶联的定向筛选方法。

11、进一步地，所述能够合成维生素b12的大肠杆菌为出发菌株为菌株zxf30（所述菌株来源于专利2026109885889“高效合成维生素b12的无质粒生产菌及其构建方法和应用”），所述菌株zxf30为以大肠杆菌为底盘菌，将cby模块整合至

tolc位点，将cbi模块整合至

argh位点，再将整合后的cby模块与cbi模块组合。

12、进一步地，利用crispr-cas9基因编辑技术敲除所述甲硫氨酸合成酶基因

mete。

13、大肠杆菌有两种甲硫氨酸合成酶：mete和meth。其中meth需要维生素b12作为辅因子，而mete在缺乏维生素b12时也发挥作用，当环境中缺乏维生素b12时，

mete基因编码的mete酶会成为甲硫氨酸合成的主要途径。敲除

mete基因时，大肠杆菌只能依赖另一个甲基转移酶meth来完成同型半胱氨酸的甲基化，而meth需要维生素b12作为辅因子。

mete基因缺失时，该菌株只能依赖以维生素b12为辅酶的meth合成甲硫氨酸，细胞对维生素b12的需求会显著增加，如果外部供应不足，维生素b12可能成为限制因素，因此，该策略可以用于筛选维生素b12高产菌。

14、步骤（2）体内连续进化技术：在步骤（1）获得的菌株中应用

dnaq介导的基因组诱变，用于体内连续定向进化。

15、其中：

16、

dnaq介导的全基因组随机诱变为：

dnaq基因编码dna聚合酶iii的ε亚基，具有3'→5'核酸外切酶活性，负责dna复制过程中的校对功能。通过对

dnaq基因进行突变，降低其校对活性，可提高全基因组的突变率，实现全基因组的随机诱变。

17、步骤（3）适应性进化培养：将携带体内连续进化工具的菌株连续传代到甲硫氨酸浓度递减的培养基中，富集维生素b12高产菌。

18、进一步地，将携带体内连续进化工具的菌株连续传代到甲硫氨酸浓度递减的培养基中为：将第一代菌株接种于含有100mg/l甲硫氨酸筛选培养基的试管中，最后一轮传代到不含甲硫氨酸筛选培养基的试管中。

19、进一步地，所述适应性进化培养至少连续进化三代。

20、进一步地，第一代菌株接种于含有100mg/l甲硫氨酸筛选培养基的试管中，然后传代到含有50μg/l甲硫氨酸筛选培养基的试管中，最后一轮传代到不含甲硫氨酸筛选培养基的试管中。

21、进一步地，传代过程中使用iptg或无水四环素作为诱导剂，根据体内连续进化质粒不同选用不同的诱导剂进行诱导进化。

22、在步骤（3）中通过传代过程中逐步降低培养基中外源甲硫氨酸的添加浓度，富集高产维生素b12菌株，实现适应性进化和体内连续进化的协同进化。

23、步骤（4）高产菌株筛选：在体内连续进化和适应性进化培养结束后，将样品进行梯度稀释后涂布于含甲硫氨酸和iptg的培养基平板上，对培养得到的菌落进行挑选，将挑选出的菌落接种于96深孔板中进行两阶段高通量发酵培养，发酵培养结束后测定发酵液中维生素b12的含量，筛选出维生素b12产量显著高于出发菌株的高产菌株。

24、进一步地，培养基平板为含有50μg/l甲硫氨酸和0.2mm iptg的无抗mr固体培养基平板，于30℃条件下培养约48h。

25、进一步地，两阶段高通量发酵培养包括：第一阶段为：挑选出的菌落接种于含700μl mr液体培养基（额外添加100 mg/l甲硫氨酸）的96孔板中，放入高通量震荡摇床中，于37℃、800rpm培养12h，待od600=0.8时进入第二阶段培养：加入0.2mm iptg，32℃、800rpm培养48小时。

26、进一步地，对培养得到的菌落进行挑选是利用全自动微生物克隆挑取系统在固体培养基上进行单菌落挑选，根据孔板装液量与孔板尺寸选择合适的针头，校准针头及摄像机位置后，进行900s紫外灭菌，设定菌落大小参数，执行相应的自动化挑选。

27、进一步地，所述菌落大小参数为菌落直径0.5-0.66mm。

28、进一步地，发酵结束后，采用高效液相色谱（hplc）法测定发酵液中维生素b12的含量，筛选出维生素b12产量显著高于出发菌株的高产菌株。

29、步骤（5）高产维生素b12靶点验证：对得到的高产菌株进行靶点验证。

30、第四方面，基于第三方面所公开的所述联合适应性进化和体内连续进化获得维生素b12高产菌的方法，公开一种基于所述方法的优化方法：所述优化方法为在所述联合适应性进化和体内连续进化获得维生素b12高产菌的方法步骤（4）高产菌株筛选时，从平板上挑取菌落直径为0.5-0.66mm的中等大小菌落，再应用

dnaq介导的全基因组随机诱变进行所述联合适应性进化和体内连续进化获得维生素b12高产菌的方法步骤（3）-步骤（4）。

31、进一步地，在优化方法中使用ptet启动子表达体内连续进化基因，获得最高的筛选效率。

32、第五方面，本技术涉及所述所述维生素b12高产菌在发酵生产维生素b12中的应用。

33、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

34、1.在本技术中公开了一种维生素b12高产菌，hemn蛋白d187n突变后维生素b12产量较未发生突变的对比组提升了28.84%，suca蛋白e149k突变后较未发生突变的对比组维生素b12产量提升了30.29%，所述维生素b12高产菌遗传稳定性好，维生素b12产量有明显提高，具有良好的工业化应用前景。

35、2.联合适应性进化和体内连续进化获得维生素b12高产菌的方法中，通过敲除甲硫氨酸合成酶基因

mete，建立了维生素b12生产与生长偶联的定向筛选方法，无需复杂的逐株检测即可高效、快速地筛选出维生素b12高产菌株，提高了育种效率。

36、3.通过体内连续进化技术，实现适应性进化和体内连续进化的协同进化，能够在全基因组范围内引入丰富的突变，同时对目标基因区域进行定向优化，提高了菌株的进化效率和维生素b12的产量。