稳定的重组病毒及其使用方法与流程

本发明涉及分子生物学、病毒学和基因疗法领域。更具体地，本发明涉及用于在昆虫细胞或哺乳动物细胞中合成重组蛋白的稳定病毒系统。

背景技术：

1、基因疗法已被开发用于治疗多种病症，如癌症和遗传相关疾病。这种治疗包括使用已经在哺乳动物系统中使用病毒载体产生的重组蛋白。在重组蛋白和病毒载体生产领域中有几种技术，这些技术使用将外源基因引入宿主细胞中的不同手段，并且在这些系统中病毒载体生产仍然存在挑战。

技术实现思路

1、引入aav基因的传统方法可以利用三重或双重质粒转染哺乳动物细胞系诸如hek-293或hela细胞(xiao, li

等人 1998, grimm，kay

等人2003)。其他技术可以利用

单纯疱疹病毒(hsv)感染哺乳动物细胞进行aav制造(zhang, de alwis

等人1999)或利用带有aavrep和cap基因的腺病毒感染哺乳动物细胞进行aav制造(zhang, wang等人2001, su,patricio等人2022)。尽管aav载体生产取得了进展，但仍然存在阻碍商业规模aav制造的挑战。例如，已有报道称(i)在生成足够的hsv种子库方面存在困难，并且(ii)在带有aav rep和cap基因的重组腺病毒的数次传代后，rep基因可丢失(zhang, wang等人2001)。

2、其他重组蛋白和病毒生产系统包括在昆虫细胞中使用杆状病毒(chen 2008,kotin 2011)。杆状病毒表达载体(或杆粒)系统(bevs)已被认为是用于生产要用作疫苗、治疗分子或诊断试剂的重组蛋白的方法(van oers, pijlman

等人2015)。相对于其他aav生产技术，该系统提供了增加的aav生产产量(galibert和merten 2011)。然而，已知bevs存在挑战，因为从rbv中逐渐缺失异源基因造成重组杆状病毒(rbv)的遗传不稳定性(kohlbrenner, aslanidi等人2005)。还报道将杆状病毒hr2序列插入rbv中aav rep-cap基因附近会改善rbv的稳定性(参见，例如us 20180371495)。然而，在一系列传代后，异源dna逐渐从重组杆状病毒中缺失，导致aav产生或蛋白质表达的丧失。

3、已经报道在传代期间从rbv自发切除非aav异源基因(pijlman, van schijndel等人2003)。已经报道将tn7转座子重新定位到另一位置会改善带有异源dna的重组杆状病毒的稳定性(pijlman, grose等人2020)。

4、us 6,428,960 b1 (“‘960”)描述了一种用于产生携带药物选择标记基因的重组杆状病毒的选择方法。‘960专利描述了将感兴趣的基因与嘌呤霉素基因一起克隆在穿梭质粒中并且与杆状病毒dna一起用于共转染sf9细胞，以在嘌呤霉素选择下生成重组杆状病毒。然而，‘960专利并未提供在昆虫细胞中用于在多次传代和/或扩增中维持rbv稳定性的方法。因此，仍然需要开发实现稳定性改善的低成本、大规模重组病毒生产系统的方法，这些方法在一系列传代和/或扩增后产生有用量的重组病毒载体和蛋白质。

5、本公开提供了先前未解决的技术问题的解决方案。本公开部分地提供了一种rbv，该rbv的基因组包括与一个或多个外源基因表达盒连接的选择标记基因表达盒，使得其自身能够在选择药物的存在下在一系列传代后稳定地维持外源基因表达盒。因此，包括与异源dna序列连接的选择标记基因表达盒的rbv可以扩增数次以获得足够数量的病毒，而不会丢失用于大规模产生病毒载体或蛋白质表达的外源基因表达盒。

6、本公开另外提供了以下见解：本文所述的方法可用于改善重组腺病毒、疱疹病毒、痘苗病毒或通常用于蛋白质表达或病毒载体生产的其他病毒的生产稳定性。在重组病毒的扩增或传代期间，将选择药物添加到细胞培养物中以杀伤受没有药物抗性基因的重组病毒感染的细胞。因此，携带与外源基因表达盒连接的药物抗性基因的重组病毒将选择性地扩增和维持。

7、在一个方面，本公开提供了包括与选择标记基因表达盒连接的外源基因表达盒的rbv。在一些实施方案中，与没有与选择标记基因表达盒连接的外源基因表达盒的rbv相比，该外源基因表达盒在昆虫细胞中在一系列传代/扩增后相对稳定。例如，在一些实施方案中，rbv包括与选择标记基因表达盒连接的外源基因表达盒，并且在昆虫细胞中在一次或多次(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次)传代/扩增后，相对于具有未与选择标记基因表达盒连接的外源基因表达盒的rbv，更高百分比的rbv包含外源基因表达盒。

8、在另一个方面，本公开提供了包括与选择标记基因表达盒连接的外源基因表达盒的重组腺病毒。在一些实施方案中，与没有与选择标记基因表达盒连接的外源基因表达盒的重组腺病毒相比，该外源基因表达盒在哺乳动物细胞中在一系列传代/扩增后相对稳定。例如，在一些实施方案中，重组腺病毒包括与选择标记基因表达盒连接的外源基因表达盒，并且在哺乳动物细胞中在一次或多次(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次)传代/扩增后，相对于具有未与选择标记基因表达盒连接的外源基因表达盒的重组腺病毒，更高百分比的重组腺病毒包含外源基因表达盒。

9、在一些实施方案中，外源基因表达盒包括人工内含子，该人工内含子包含没有聚腺苷酸化信号的选择标记基因表达盒，使得人工内含子可在转录期间被剪接掉以形成用于蛋白质表达的完整外源基因转录物。位于人工内含子内的选择标记基因可以通过表达盒中其自身的启动子转录，由外源基因表达盒的相同聚腺苷酸化信号终止，并且可以翻译转录物以赋予药物抗性。

10、在一些实施方案中，rbv dna骨架包括与供体或穿梭质粒中的一个或多个外源基因表达盒侧翼的两个dna片段同源的dna序列，该一个或多个外源基因表达盒与昆虫细胞可操作的选择标记基因表达盒连接。在某些实施方案中，rbv dna骨架源自bmon14272(luckow, lee等人1993)。在一些实施方案中，rbv dna包括复制起点。在具体实施方案中，复制起点是微型 f-复制子、cole1、oric、oriv、orit或oris。在某些实施方案中，rbv dna骨架还包括报告基因。在具体实施方案中，报告基因是laczα。

11、本公开还提供了rbv基因组，该rbv基因组包括至少一个昆虫细胞可操作的选择标记基因表达盒和一个或多个外源基因表达盒。昆虫细胞可操作的选择标记基因表达盒可以位于外源基因表达盒附近(以任何取向)或外源基因表达盒之间。在一些实施方案中，与没有选择标记基因表达盒的rbv基因组相比，一个或多个外源基因表达盒相对稳定。在一些实施方案中，外源基因表达盒包括：至少一个外源蛋白基因和与至少一个外源基因可操作地连接的昆虫细胞启动子。

12、在一些实施方案中，外源基因表达盒中的至少一个外源蛋白基因包括至少一种病毒蛋白基因和/或至少一种哺乳动物蛋白基因。在某些实施方案中，病毒蛋白基因编码aav蛋白、腺病毒蛋白、逆转录病毒蛋白、sv40蛋白或单纯疱疹病毒蛋白。在具体实施方案中，外源基因表达盒包括编码至少一种aav衣壳蛋白的序列。在某些实施方案中，至少一种aav蛋白是vp1、vp2、vp3和/或rep蛋白，并且在特定实施方案中，至少一种sv40蛋白是vp1主要衣壳蛋白。

13、在一些实施方案中，外源基因表达盒包括与至少一个外源蛋白基因可操作地连接的昆虫启动子，诸如多角体蛋白、p10或p6.9昆虫启动子。

14、在一些实施方案中，外源基因表达盒包括与至少一个外源蛋白基因可操作地连接的哺乳动物启动子，诸如cmv、pgk、ubc、ef1α、sv40、p5、p19和p40启动子。

15、在一些实施方案中，dna序列使得外源基因表达盒和昆虫细胞可操作的选择标记基因表达盒能够整合到rbv dna骨架中。在一些实施方案中，使得外源基因表达盒和昆虫细胞可操作的选择标记基因表达盒能够整合到rbv dna骨架中的dna序列与rbv dna基因组中的dna序列同源。在特定实施方案中，使得外源基因表达盒能够整合到rbv dna骨架中的dna序列是转座元件。在某些实施方案中，使得外源基因表达盒能够整合到rbv dna骨架中的dna序列是tn7r和tn7l。

16、在另一个方面，本公开提供了包括与昆虫细胞可操作的选择标记基因表达盒连接的一个或多个外源基因表达盒的rbv载体或颗粒。在一些实施方案中，与没有昆虫细胞可操作的选择标记基因表达盒的rbv骨架相比，一个或多个外源基因表达盒相对稳定。与昆虫细胞可操作的选择标记基因表达盒连接的外源蛋白基因盒包括：至少一个外源蛋白基因；与至少一个外源基因可操作地连接的昆虫细胞启动子；昆虫细胞可操作的选择标记基因表达盒和两个dna序列，使得外源基因表达盒与昆虫细胞可操作的选择标记基因表达盒能够一起整合到rbv dna骨架中。在一些实施方案中，rbv载体或颗粒包括rbv骨架，该rbv骨架包括编码至少一种aav衣壳蛋白的外源基因表达盒。

17、本公开还提供了包含rbv载体或颗粒的昆虫细胞，该rbv载体或颗粒包含：rbv基因组；和至少一种杆状病毒衣壳蛋白。在一些实施方案中，rbv基因组包括：rbv dna骨架；和与昆虫细胞可操作的选择标记表达盒连接的外源基因表达盒，该rbv dna骨架包括：使得与昆虫细胞可操作的选择标记基因表达盒连接的一个或多个外源基因表达盒能够整合到骨架中的dna序列。在一些实施方案中，与没有昆虫细胞可操作的选择标记基因表达盒的rbv骨架相比，一个或多个外源基因表达盒相对稳定。在一些实施方案中，rbv基因组包括rbv骨架，该rbv骨架包括编码至少一种aav衣壳蛋白的外源基因表达盒。

18、在一些实施方案中，昆虫细胞是sf9、sf21、s2、粉纹夜蛾、e4a或bti-tn-5b1-4细胞。在特定实施方案中，昆虫细胞还包括从rbv载体或颗粒的rbv基因组的rbv骨架中的外源基因表达盒表达的至少一种外源蛋白，并且在某些实施方案中，至少一种外源蛋白是至少一种aav衣壳蛋白。

19、在另一个方面，本公开提供了一种异源表达系统，该异源表达系统包括：rbv载体或颗粒；和昆虫细胞。在一些实施方案中，rbv载体或颗粒包括：rbv基因组；和至少一种杆状病毒衣壳蛋白。在一些实施方案中，rbv基因组包括：rbv dna骨架；和与昆虫细胞可操作的选择标记基因表达盒连接的外源基因表达盒，该rbv dna骨架包括：使得与昆虫细胞可操作的选择标记基因表达盒连接的一个或多个外源基因表达盒能够整合到骨架中的dna片段。在一些实施方案中，与没有昆虫细胞可操作的选择标记基因表达盒的rbv骨架相比，一个或多个外源基因表达盒相对稳定。在一些实施方案中，rbv基因组包括rbv骨架，该rbv骨架包括编码至少一种aav衣壳蛋白的外源基因表达盒。该系统中的昆虫细胞易受感染，并且能够表达由rbv载体或颗粒中的rbv骨架编码的至少一种外源蛋白。

20、在一些实施方案中，rbv载体或颗粒包括rbv骨架，该rbv骨架包括外源基因表达盒，该外源基因表达盒包括编码至少一种aav衣壳蛋白的序列。在一些实施方案中，昆虫细胞是sf9、sf21、s2、粉纹夜蛾、e4a或bti-tn-5b1-4细胞。

21、在再另一个方面，本公开提供了一种异源表达系统，该异源表达系统包括：rbv载体或颗粒；和昆虫细胞。在一些实施方案中，rbv载体或颗粒包括：rbv基因组；和至少一种杆状病毒衣壳蛋白。rbv基因组包括：rbv dna骨架；和与昆虫细胞可操作的选择标记表达盒连接的外源基因表达盒，该rbv dna骨架包括：使得与昆虫细胞可操作的选择标记基因表达盒连接的一个或多个外源基因表达盒能够整合到骨架中的dna片段。在一些实施方案中，与没有昆虫细胞可操作的选择标记基因表达盒的rbv骨架相比，一个或多个外源基因表达盒相对稳定。在一些实施方案中，rbv基因组包括rbv骨架，该rbv骨架包括编码至少一种aav衣壳蛋白的外源基因表达盒。该系统的昆虫细胞易受感染，并且能够表达由rbv载体或颗粒中的rbv骨架编码的至少一种外源蛋白。

22、在一些实施方案中，rbv载体或颗粒包括rbv骨架，该rbv骨架包括与昆虫细胞可操作的选择标记表达盒连接的外源基因表达盒，该外源基因表达盒包括编码至少一种aav衣壳蛋白的序列。在一些实施方案中，昆虫细胞是sf9、sf21、s2、粉纹夜蛾、e4a或bti-tn-5b1-4细胞。

23、在一些实施方案中，由rbv基因组编码的至少一种外源蛋白是至少一种aav衣壳蛋白。在一些实施方案中，昆虫细胞裂解物源自用rbv基因组感染的sf9、sf21、s2、粉纹夜蛾、e4a或bti-tn-5b1-4昆虫细胞。

24、在还有另一个方面，本公开提供了一种在昆虫细胞中产生外源蛋白的方法，该方法包括：用本文所述的重组杆状病毒(rbv)载体或颗粒感染昆虫细胞；在有利于至少一个外源蛋白基因表达的条件下培养所感染的细胞；并且分离外源蛋白。

25、在一些实施方案中，使昆虫细胞裂解以分离外源蛋白。在某些实施方案中，外源蛋白是至少一种重组aav衣壳蛋白。