沙门氏菌全预混RT-qPCR试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学检测，具体涉及一种沙门氏菌全预混rt-qpcr试剂盒。

背景技术：

1、沙门氏菌（salmonella）是一类常见的革兰氏阴性肠道杆菌，属于人兽共患的食源性致病菌，其血清型多达2600余种，可直接导致人类感染，引发伤寒、副伤寒、急性胃肠炎等疾病，严重时可导致败血症、休克甚至死亡，尤其对儿童、老人、孕妇及免疫力低下人群的威胁更为显著。该致病菌广泛分布于自然界，可通过污染肉类、蛋类、奶制品、蔬菜等食物，以及水源、厨具等传播媒介进入人体，其中约95%的沙门氏菌感染病例源于食用受污染的食物，是全球食源性疾病的主要诱因之一。因此建立快速、准确、灵敏的沙门氏菌检测方法，对食品卫生监督、疫情防控、临床诊断及口岸检疫具有重要意义。

2、目前对于沙门氏菌的检测主要是细菌培养、生化检测、血清学、聚合酶链式反应、环介导等温扩增技术等。但是，以上检测方法存在检出周期长、灵敏度差、容易出现漏检和假阳性的情况。随着分子生物学技术的发展，实时荧光定量聚合酶反应（rt-qpcr）技术因具有特异性强、灵敏度高、检测速度快（通常可在数小时内完成）等优势，已广泛应用于沙门氏菌的快速检测领域。rt-qpcr技术为沙门氏菌的检测提供了分子水平的精准利器，通过靶向沙门氏菌保守基因inva的特异性引物与探针设计，将检测灵敏度大幅提升，较传统病毒分离培养（2-7天）和免疫荧光法效率提升百倍，为潜伏期病毒感染的早期识别提供了不可替代的工具，解决了沙门氏菌 “诊断繁琐、诊断灵敏度低”的困境。

3、但是，传统的rt-qpcr检测流程中，操作人员需要分别对引物、探针、酶、缓冲液等多种试剂进行解冻、混匀、分装、稀释等一系列繁琐操作，步骤多、耗时长及易污染等问题。而全预混体系将所有反应组分预先混合好，直接取用即可进行后续的加样和扩增反应，大幅缩短样本制备时间、降低操作失误风险，尤其适配高通量场景并提升检测通量。

4、但是，要实现全预混体系均一稳定，仍有尚未解决的痛点和难点。首先，在长期保存过程中，尤其是4℃或室温储存时，引物与引物以及引物和探针之间容易产生二聚体，导致体系内部出现非特异性扩增，增加了体系复杂性，限制后续主反应进行，并消耗反应所需组分，从而造成扩增曲线荧光强度下降、ct 值滞后，或者出现 ct 值大幅提前，大大增加假阳性概率。当引物二聚体扩增产生的“种子”模板浓度高于待测靶核酸浓度时，甚至出现主反应不发生，表现为无扩增曲线，造成灵敏度大幅下降的问题。因此，开发一种快速、灵敏、特异、不易污染且均一稳定的全预混检测试剂盒非常必要。

技术实现思路

1、本发明提供一种快速，高灵敏度、高特异性，污染易控，均一稳定的沙门氏菌全预混检测试剂盒。

2、在一种实施方式中，提供一种沙门氏菌全预混rt-qpcr试剂盒，所述试剂盒包括rt-qpcr全预混检测混合液，所述混合液包括：针对所述沙门氏菌序列设计第一引物、第二引物、检测探针以及用于扩增检测的酶体系，其中：

3、（1）第一引物，所述第一引物是一种自身形成茎环结构的第一茎环引物，所述第一茎环引物具有如下特征：

4、a. 所述第一茎环引物从5’端至3’端顺序连续的包含区域1-4；

5、b. 所述区域1序列与所述区域3序列互补配对，形成茎部结构，且该茎部结构在逆转录及pcr退火-延伸阶段保持稳定；

6、c. 所述区域2序列特异性识别沙门氏菌inva基因序列，且不与引物其他区域互补；

7、d. 所述区域3序列和所述区域4序列特异性识别沙门氏菌inva基因序列，且区域4序列不与其他区域序列互补配对，所述区域4序列以单链形式存在；

8、e. 所述第一茎环引物一方面通过区域1-3互补形成自身发夹结构，另外一方面两个所述茎环引物中，一个茎环引物的区域1序列和区域3序列分别与另一个茎环引物的区域3序列和区域1序列互补配对，由此二个茎环引物间通过区域1和区域3互补组装成更稳定的同源二聚物，双重结构保障其构象稳定性；

9、（2）第二引物，所述第二引物也是一种自身形成茎环结构的第二茎环引物，所述第二茎环引物具有与所述第一茎环引物相同的上述特征：

10、（3）检测探针，所述检测探针与所述沙门氏菌inva基因序列特异性结合，且不与第一引物和第二引物特异性结合，检测探针5 '端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。

11、在一种实施方式中，所述用于扩增检测的酶体系有m-mlv反转录酶、taq dna聚合酶和热敏ung酶及反应缓冲液。

12、在一种实施方式中，所述试剂盒还包括阳性质控品，所述阳性质控品为冻干粉，由包含沙门氏菌inva基因保守区靶序列的重组质粒制备而成。

13、在一种实施方式中，所述阳性质控品是如seq id no.1所示。

14、在一种实施方式中，所述第一引物和所述第二引物分别是如seq id no.2和seqid no.3所示。

15、在一种实施方式中，所述检测探针是如seq id no.4所示。

16、本发明相比现有技术具有以下优点：

17、a.本发明提供了一种基于rt-qpcr技术的沙门氏菌（salmonella, sal）全预混检测试剂盒，相较于传统rt-qpcr技术，本发明解决了人工加样误差、混合不均及操作习惯差异导致的系统性/随机误差，显著提升检测准确性与批内批间重复性；同时将传统繁琐的多试剂解冻、混匀、分装流程简化为“一管式”操作，大幅缩短样本制备时间、降低操作失误风险；在生物安全层面，减少开盖频次与样本接触，降低气溶胶污染风险；通过减少人力培训、试剂浪费、质控成本实现综合成本优化，提升产品竞争力与用户易用性，最终以“精准、高效、安全、经济”的综合优势重塑分子检测流程，为产业标准化、智能化升级提供核心支撑；

18、b.本发明提供的沙门氏菌全预混检测试剂盒中，引物设计方法通过茎环引物结构创新，通过引物自身形成发夹结构或同源二聚物，在引物、探针及酶体系全预混的体系中构建规则自锁构象，从根本上优化反应稳定性与特异性。具体而言，引物以自锁状态有序存在时，体系熵值显著降低，分子间的无序碰撞大幅减少，从而有效抑制引物间及引物-探针的非特异性结合，解决了全预混检测试剂盒长期保存中因引物非特异扩增导致的假阳性风险，同时避免了热加速后荧光信号增量不足、ct值延后及检测灵敏度下降等问题。这一创新通过构象调控实现“熵减稳序”，为全预混检测试剂盒的长效存储与精准检测提供了可靠保障；

19、c.本发明提供的沙门氏菌全预混检测试剂盒中，引物设计方法通过茎环引物结构创新，克服了传统全预混检测试剂盒对酶原料高度依赖以及引物探针设计时二聚体无序扩增的困境。本发明提供的茎环引物形成发夹结构或同源二聚物特性，有效抑制引物间的非特异性结合，从而大幅降低对taq dna聚合酶与抗体封闭效率的严苛要求。这一突破性设计使得即使存在taq dna聚合酶酶活泄漏，其活性也不会引发非特异性扩增，从根本上解决了传统方法中因酶活泄漏导致的假阳性问题，为高通量核酸检测提供了更经济高效的解决方案；

20、d.本发明提供的引物设计方法相较于传统分子信标的发夹结构具有显著优势。传统分子信标因5'端与3'端完全配对形成封闭茎环结构，在待测靶核酸存在时，其自锁状态的解除完全依赖动力学驱动（需通过升高温度被动打开茎部），导致以下缺陷：①热力学层面，分子信标无法自发形成链置换反应，茎部结构难以自发解锁，造成引物失效，表现为扩增曲线无“s”形特征、ct值延后及荧光信号增量不足；②动力学层面，靶核酸浓度较低时，分子信标即使被动解锁，但仍优先维持自身结构，无法有效结合靶标，导致灵敏度大幅下降。相比之下，本发明茎环引物通过创新性区域设计（区域2~4序列共同构成了与待测靶核酸特异性结合的引物， 区域2为茎环结构，区域4为游离序列，区域1-3形成自锁茎部）实现了动态自适应调节：当靶核酸存在时，区域4序列通过碱基互补自发触发链置换反应，热力学上优先形成茎环-靶标复合物，实现茎环引物自发解锁，同时动力学层面，游离序列（区域2、4）的柔性结构使链置换速率大幅提升，从而迅速完成自锁到解锁的转变，有效解决了低丰度核酸检测的灵敏度瓶颈问题；

21、e.本发明提供的引物设计方法通过茎环引物结构创新，实现了沙门氏菌检测一步法逆转录rna扩增的兼容性突破。相较于传统两端完全封闭的发夹引物，其茎部完全配对形成刚性结构，本设计在茎环引物的3'端保留未封闭区域（区域4），所述区域在逆转录温度（如42-55℃）下可动态解链，与沙门氏菌模板高效结合。随着逆转录酶沿模板移动，茎环引物通过链置换反应逐步释放发夹结构，同时维持引物活性位点的稳定性——这一过程在热力学上优先形成茎环-靶标复合物，且动力学层面游离茎部（区域2、4）的柔性设计使解链速率大幅提升，确保逆转录效率不受抑制。关键优势在于：① 特异性保障：未封闭茎部在逆转录温度（如50℃）下仍保持足够热稳定性，避免引物自主解链形成二聚体；② 兼容性突破：在沙门氏菌逆转录中，未封闭茎部与模板结合效率高，且扩增产物特异性与灵敏度均优于传统发夹引物。该设计通过构象动态调控，实现引物双功能，既作为dna扩增的高效引物，又作为逆转录的精准引导引物，为检测沙门氏菌的rt-qpcr全预混试剂提供了创新解决方案。