一种高效诱导多能干细胞肝向分化的方法与流程

本发明属于细胞生物学，尤其涉及一种诱导多能干细胞肝向分化的方法。

背景技术：

1、肝细胞是开展肝脏疾病机制研究、药物代谢与毒性评价以及细胞治疗研究的重要细胞来源。原代人肝细胞受供体来源有限、体外扩增能力不足及长期培养后功能下降等因素限制，难以满足稳定、大规模应用需求。诱导多能干细胞具有较强的自我更新和多向分化潜能，可通过阶段性模拟胚胎肝脏发育过程诱导形成肝细胞样细胞，为获得稳定的人源肝细胞提供了新的技术途径。

2、目前，人多能干细胞向肝细胞分化通常经历确定性内胚层形成、肝祖细胞形成及功能成熟等阶段，并主要依赖细胞因子或小分子化合物调节相关信号通路。dihexa是一种能够激活hgf/c-met相关信号的小分子，已有研究将其用于人多能干细胞肝向分化，在肝谱系指定及后续成熟过程中可与其他小分子配合促进肝细胞样表型形成。 然而，现有诱导体系获得的细胞在成熟程度、药物代谢酶活性及不同批次间一致性方面仍存在进一步改善空间。

3、长链非编码rna参与细胞分化、代谢及表观遗传调控。已有研究发现，linc00662在异常代谢背景ipsc由未分化阶段至确定性内胚层、肝祖细胞及肝细胞阶段持续高表达，提示其可能参与异常肝发生过程。此外，linc00662可调节mat1a和ahcy，影响sam/sah代谢平衡及基因组甲基化状态。现有研究主要集中于linc00662在异常代谢及肝细胞癌中的作用，其在诱导多能干细胞肝向分化及功能成熟过程中的调控作用尚不明确，亦缺乏将linc00662调控与dihexa诱导相结合的肝向分化方法。因此，有必要开发新的诱导多能干细胞肝向成熟调控方案。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种高效诱导多能干细胞肝向分化的方法。

2、首先，本发明提供了一种高效诱导多能干细胞肝向分化的方法，包括如下步骤：

3、（1）培养脐带来源诱导多能干细胞，待细胞贴壁并生长稳定后进行肝向诱导；

4、（2）采用内胚层诱导培养液对所述脐带来源诱导多能干细胞进行确定性内胚层诱导，所述内胚层诱导培养液以rpmi 1640培养基为基础，含有b27添加剂和activin a，并在确定性内胚层诱导初期加入chir99021；

5、（3）采用肝谱系诱导培养液进行肝谱系诱导，所述肝谱系诱导培养液以rpmi 1640培养基为基础，含有b27添加剂、bmp4和fgf2；随后采用肝祖细胞诱导培养液进行培养，所述肝祖细胞诱导培养液以dmem/f12培养基为基础，含有b27添加剂和hgf，获得肝向分化中间细胞；

6、（4）将所述肝向分化中间细胞置于肝细胞成熟培养液中进行成熟培养，所述肝细胞成熟培养液以hepatozyme-sfm培养基为基础，含有osm、its-x、地塞米松；

7、（5）采用小分子化合物dihexa对所述肝向分化中间细胞预诱导后，抑制细胞中linc00662的表达，并继续进行成熟培养，获得肝细胞样细胞。

8、优选地，步骤（1）中，所述脐带来源诱导多能干细胞采用mtesr1培养基培养于matrigel包被的培养基质上，并在细胞接种初期加入y-27632。

9、优选地，步骤（2）中，首先采用含1×b27无胰岛素添加剂、100 ng/ml activin a和2 μmol/l chir99021的rpmi 1640培养基培养24 h；随后采用含1×b27无胰岛素添加剂和100 ng/ml activin a的rpmi 1640培养基继续培养2 d。

10、优选地，步骤（3）中，所述肝谱系诱导培养液以rpmi 1640培养基为基础，含有1×b27添加剂、20 ng/ml bmp4和20 ng/ml fgf2，所述肝谱系诱导培养液的培养时间为5 d。

11、优选地，步骤（3）中，所述肝祖细胞诱导培养液以dmem/f12培养基为基础，含有1×b27添加剂和20 ng/ml hgf，所述肝祖细胞诱导培养液的培养时间为2 d。

12、优选地，步骤（4）中，所述肝细胞成熟培养液包括hepatozyme-sfm培养基、10 ng/ml osm、1×its-x和1×10^-8 mol/l地塞米松。

13、优选地，步骤（5）中，所述小分子化合物dihexa的终浓度为0.05～0.20 μmol/l，采用dihexa预诱导24 h后抑制linc00662的表达。

14、优选地，所述小分子化合物dihexa的终浓度为0.10 μmol/l；所述linc00662的表达通过转染linc00662特异性sirna进行抑制，所述linc00662特异性sirna的终浓度为20nmol/l；

15、所述linc00662特异性sirna的正义链序列为：

16、5′-auuuaaaaaaguagauguggc-3′；

17、反义链序列为：

18、5′-cacaucuacuuuuuuaaaugu-3′。

19、此外，本发明提供了小分子化合物dihexa与linc00662抑制剂联合在协同促进诱导多能干细胞向肝细胞样细胞分化和/或提高肝细胞样细胞功能成熟程度中的应用，所述应用先采用小分子化合物dihexa对肝向分化中间细胞进行预诱导，再采用linc00662抑制剂抑制linc00662的表达。

20、优选地，所述小分子化合物dihexa的终浓度为0.10 μmol/l；

21、所述linc00662特异性sirna的正义链序列为：

22、5′-auuuaaaaaaguagauguggc-3′；

23、反义链序列为：

24、5′-cacaucuacuuuuuuaaaugu-3′。

25、本发明的有益效果在于：

26、本发明通过将dihexa预诱导与linc00662表达抑制进行特定时序组合，显著促进uc-ipsc向功能成熟肝细胞样细胞分化。与dihexa单独处理或linc00662单独抑制相比，本发明实施例1的alb+/asgr1+双阳性细胞比例、白蛋白分泌量、尿素合成量及cyp3a4活性均进一步提高，且均超过两种单因素作用的背景校正加和预期，表明二者并非简单叠加，而具有明显的协同促进作用。同时，实施例1的效果优于dihexa与linc00662抑制同步处理及反向时序处理，说明该协同作用具有明显的时序依赖性。通过先采用dihexa预诱导、再抑制linc00662，可更充分地促进肝细胞样细胞形成及功能成熟，为获得高成熟度人源肝细胞样细胞提供新的技术方案。

1.一种高效诱导多能干细胞肝向分化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述脐带来源诱导多能干细胞采用mtesr1培养基培养于matrigel包被的培养基质上，并在细胞接种初期加入y-27632。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，首先采用含1×b27无胰岛素添加剂、100 ng/ml activin a和2 μmol/l chir99021的rpmi 1640培养基培养24 h；随后采用含1×b27无胰岛素添加剂和100 ng/ml activin a的rpmi 1640培养基继续培养2 d。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述肝谱系诱导培养液以rpmi1640培养基为基础，含有1×b27添加剂、20 ng/ml bmp4和20 ng/ml fgf2，所述肝谱系诱导培养液的培养时间为5 d。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述肝祖细胞诱导培养液以dmem/f12培养基为基础，含有1×b27添加剂和20 ng/ml hgf，所述肝祖细胞诱导培养液的培养时间为2 d。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述肝细胞成熟培养液包括hepatozyme-sfm培养基、10 ng/ml osm、1×its-x和1×10^-8 mol/l地塞米松。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述小分子化合物dihexa的终浓度为0.05～0.20 μmol/l，采用dihexa预诱导24 h后抑制linc00662的表达。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述小分子化合物dihexa的终浓度为0.10μmol/l；所述linc00662的表达通过转染linc00662特异性sirna进行抑制，所述linc00662特异性sirna的终浓度为20 nmol/l；

9.小分子化合物dihexa与linc00662抑制剂联合在协同促进诱导多能干细胞向肝细胞样细胞分化和/或提高肝细胞样细胞功能成熟程度中的应用，其特征在于，所述应用先采用小分子化合物dihexa对肝向分化中间细胞进行预诱导，再采用linc00662抑制剂抑制linc00662的表达。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物dihexa的终浓度为0.10 μmol/l；