一种肽偶联物及其制备方法和器官保存液以及应用

本申请属于生物医学与器官移植，具体涉及一种肽偶联物及其制备方法和器官保存液以及应用。

背景技术：

1、器官移植是目前治疗终末期肝、肾、心、肺等重要器官衰竭的主要手段。随着外科技术及免疫抑制策略的不断优化，移植手术的短期成功率已显著提高，但移植物长期功能维持仍面临巨大挑战。缺血-再灌注损伤及其诱发的炎症反应和免疫排斥，是导致移植物功能损伤和慢性排斥的重要原因。

2、在临床实践中，供体器官自离体后需经历保存、运输及再灌注等多个阶段。目前常用的低温静态保存（scs）或机器灌注保存（mp）方式，通常配合uw 液、htk液或celsior液等传统器官保存液使用。这类保存液主要通过维持细胞渗透压、离子稳态及基础能量代谢，延缓低温缺血造成的细胞损伤，但对保存及移植过程中持续发生的血管内皮激活、免疫细胞黏附和炎症反应的主动干预能力仍较有限。

3、供体器官在缺血保存及再灌注过程中，血管内皮细胞可发生炎症激活，促进t细胞、单核细胞等免疫细胞在血管内皮表面的黏附、募集和浸润，进一步加重内皮损伤及移植物炎症反应。因此，如何在器官保存或移植前预处理阶段对炎症激活的血管内皮进行局部靶向保护，减少免疫细胞黏附和浸润，是改善移植物早期损伤的重要技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种血管内皮靶向肽偶联物，可在供体器官保存、运输或移植前预处理阶段作用于炎症激活的血管内皮，减少免疫细胞与血管内皮细胞的黏附以及移植物内t细胞浸润，减轻移植物组织损伤，并改善移植后的生存情况。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种肽偶联物，包括含马来酰亚胺基团的载体和偶联于所述载体上的结合肽；所述结合肽包括icam-1结合肽和/或vcam-1结合肽；

3、所述icam-1结合肽的氨基酸序列如seq id no:1所示；

4、所述vcam-1结合肽的氨基酸序列如seq id no:7所示；

5、所述含马来酰亚胺基团的载体为本领域常规的含马来酰亚胺基团的生物相容性高分子，只要其带有马来酰亚胺基团即可与含半胱氨酸的结合肽发生偶联，例如多臂型聚乙二醇-马来酰亚胺（peg-mal）、磷脂-聚乙二醇-马来酰亚胺和马来酰亚胺化多糖聚合物。

6、优选的，所述结合肽含有半胱氨酸残基，通过所述半胱氨酸残基的巯基与所述载体上的马来酰亚胺基团发生巯基-马来酰亚胺加成反应而偶联。

7、进一步优选的，所述马来酰亚胺化多糖聚合物包括马来酰亚胺化葡聚糖（dextran-mal）、马来酰亚胺化壳聚糖、马来酰亚胺化透明质酸（ha-mal）、马来酰亚胺化普鲁兰多糖和马来酰亚胺化海藻酸钠；

8、进一步优选的，所述多臂型聚乙二醇-马来酰亚胺为四臂聚乙二醇-马来酰亚胺、六臂聚乙二醇-马来酰亚胺或八臂聚乙二醇-马来酰亚胺。

9、进一步优选的，所述磷脂-聚乙二醇-马来酰亚胺包括以下至少一种：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺（dspe-peg-mal）、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、二油酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺和二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺。

10、本发明提供了一种所述肽偶联物的制备方法，包括以下步骤：将含马来酰亚胺基团的载体与结合肽通过巯基-马来酰亚胺加成反应偶联，偶联产物经除杂，得到肽偶联物。

11、本发明提供了一种器官保存液，包括基础保存液和所述的肽偶联物或所述制备方法制备得到的肽偶联物。

12、优选的，所述基础保存液为uw液。

13、优选的，当偶联一种结合肽时，以结合肽计，所述肽偶联物中icam-1结合肽或vcam-1结合肽在所述器官保存液中的浓度为0.5 mm；

14、当偶联两种结合肽时，以结合肽计，所述肽偶联物中icam-1结合肽和vcam-1结合肽在所述器官保存液中的浓度独立为0.5 mm。

15、本发明提供了所述的肽偶联物或所述的器官保存液在离体器官保存、离体器官移植前预处理、体外抑制免疫细胞与血管内皮细胞黏附、减少离体移植物t细胞浸润和减轻离体移植物组织损伤中至少一项中的应用。

16、本发明提供了所述的肽偶联物或所述制备方法制备的肽偶联物在制备离体器官保存、离体器官移植前预处理、体外抑制免疫细胞与血管内皮细胞黏附、减少离体移植物t细胞浸润和减轻离体移植物组织损伤中至少一项的器官保存液中的应用。

17、本发明提供的肽偶联物，包括含马来酰亚胺基团的载体和偶联于所述载体上的结合肽；所述结合肽包括icam-1结合肽和/或vcam-1结合肽；所述icam-1结合肽的氨基酸序列如seq id no:1所示；所述vcam-1结合肽的氨基酸序列如seq id no:7所示。所述结合肽与载体的偶联使所述肽偶联物作为功能化材料作用于炎症激活的血管内皮，减少免疫细胞与血管内皮细胞的黏附，并减轻移植物内t细胞浸润及组织损伤。体外实验进一步表明，采用不同类型的含马来酰亚胺基团载体（包括聚乙二醇-马来酰亚胺、dspe-peg-马来酰亚胺、马来酰亚胺化葡聚糖和马来酰亚胺化透明质酸）均可构建具有抑制免疫细胞与血管内皮细胞黏附作用的肽偶联物。所述肽偶联物可作为器官保存液的功能化材料，用于离体器官低温保存或移植前预处理。体外实验结果表明，含icam-1和vcam-1双肽功能化peg材料的器官保存液能够减少外周血单个核细胞与炎症激活内皮细胞的黏附，并降低培养体系中il-6和tnf-α水平。同时小鼠同种异体血管移植实验结果表明，与常规uw保存液组相比，采用含所述肽偶联物的器官保存液处理后的移植血管，其血管壁结构较为完整，炎症细胞及cd3阳性t细胞浸润减少。小鼠同种异体肝移植实验结果表明，与普通uw液组以及单一icam-1肽功能化peg组或单一vcam-1肽功能化peg组相比，icam-1/vcam-1双肽功能化peg组的移植肝组织损伤以及cd4、cd8阳性t细胞浸润程度减轻，并能够延长受体动物的生存期。安全性实验结果表明，所述功能化peg材料未引起明显的主要器官病理损伤，血清alt和ast水平与空白对照组无显著差异；斑马鱼胚胎发育毒性实验中，在本发明测试条件下亦未观察到明显的胚胎死亡或典型发育毒性相关表型。

18、本发明还提供了一种器官保存液，所述肽偶联物可作为基础器官保存液的功能添加组分使用，不需要替代基础保存液的渗透压调节、离子稳态维持及能量代谢支持功能，即可在现有器官保存或移植前预处理流程中增加血管内皮靶向保护和局部免疫调控作用，与现有器官获取、保存及移植流程完全兼容，无需额外设备或复杂操作，具有良好的临床转化潜力和推广应用价值。

1.一种肽偶联物，其特征在于，包括含马来酰亚胺基团的载体和偶联于所述载体上的结合肽；所述结合肽包括icam-1结合肽和/或vcam-1结合肽；

2.根据权利要求1所述的肽偶联物，其特征在于，所述结合肽含有半胱氨酸残基，通过所述半胱氨酸残基的巯基与所述载体上的马来酰亚胺基团发生巯基-马来酰亚胺加成反应进行偶联。

3.根据权利要求1所述的肽偶联物，其特征在于，所述马来酰亚胺化多糖聚合物包括以下至少一种：马来酰亚胺化葡聚糖、马来酰亚胺化壳聚糖、马来酰亚胺化透明质酸、马来酰亚胺化普鲁兰多糖和马来酰亚胺化海藻酸钠。

4.根据权利要求1所述的肽偶联物，其特征在于，所述多臂型聚乙二醇-马来酰亚胺包括以下至少一种：四臂聚乙二醇-马来酰亚胺、六臂聚乙二醇-马来酰亚胺和八臂聚乙二醇-马来酰亚胺。

5.根据权利要求1所述的肽偶联物，其特征在于，所述磷脂-聚乙二醇-马来酰亚胺包括以下至少一种：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、二油酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺和二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺。

6.一种权利要求1～5任一项所述肽偶联物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将含马来酰亚胺基团的载体与结合肽通过巯基-马来酰亚胺加成反应偶联，偶联产物经除杂，得到肽偶联物。

7.一种器官保存液，其特征在于，包括基础保存液和权利要求1～5任一项所述的肽偶联物或权利要求6所述制备方法制备得到的肽偶联物。

8.根据权利要求7所述的器官保存液，其特征在于，当偶联一种结合肽时，以结合肽计，所述肽偶联物中icam-1结合肽或vcam-1结合肽在所述器官保存液中的浓度为0.5 mm；

9.权利要求1～5任一项所述的肽偶联物或权利要求7或8所述的器官保存液在离体器官保存、离体器官移植前预处理、体外抑制免疫细胞与血管内皮细胞黏附、减少离体移植物t细胞浸润和减轻离体移植物组织损伤中至少一项中的应用。

10.权利要求1～5任一项所述的肽偶联物或权利要求6所述制备方法制备的肽偶联物在制备离体器官保存、离体器官移植前预处理、体外抑制免疫细胞与血管内皮细胞黏附、减少离体移植物t细胞浸润和减轻离体移植物组织损伤中至少一项的器官保存液中的应用。