一种基于5′非翻译区发夹结构改造的植物基因表达调控方法及应用

本发明涉及植物基因工程与作物遗传育种，尤其涉及一种基于5′非翻译区发夹结构改造的植物基因表达调控方法及应用。

背景技术：

1、真核生物mrna的5′非翻译区（5′utr），即位于5′端帽子结构（m7gpppn）与翻译起始密码子aug之间的非编码序列，是核糖体识别、结合并启动翻译过程的重要调控区域。5′非翻译区内含有多种顺式调控元件，其中上游开放阅读框（upstream open reading frame，uorf）是目前研究较为充分的一类翻译调控元件。uorf能够通过干扰核糖体扫描、竞争翻译起始复合物、降低翻译再起始效率或诱导核糖体停滞等方式，抑制下游主开放阅读框（mainopen reading frame，morf）的翻译效率。

2、基于上述作用机制，通过基因编辑手段靶向破坏内源uorf或人为引入新的uorf，已被用于调控目标基因蛋白表达水平，并在植物性状改良和基因功能研究中展现出良好的应用潜力。然而，现有基于uorf的蛋白表达调控策略仍存在明显局限：一方面，并非所有目标基因的5′非翻译区均含有天然uorf，据植物转录组统计，仅约20%~50%的转录本在其5′非翻译区中含有uorf序列，大量目标基因缺乏可直接编辑的内源uorf靶点；另一方面，uorf的调控效应通常受到其起始密码子环境、长度、终止位置及其与morf之间距离等因素影响，单独依赖uorf难以实现更广泛、精细和可预测的蛋白表达调控。因此，开发不依赖或不完全依赖uorf的新型5′非翻译区调控元件及其改造方法，对于拓展基因表达调控工具具有重要意义。

3、除uorf外，5′非翻译区中还广泛存在rna二级结构，例如发夹结构、假结结构等。已有研究提示，当稳定rna二级结构位于翻译起始密码子附近时，可能通过物理阻碍核糖体扫描或影响翻译起始复合物装配，从而降低下游morf的翻译效率。但是，现有技术对于5′非翻译区二级结构的调控规律仍缺乏系统认识，尤其是不同位置发夹结构对翻译效率的影响、天然发夹结构删除后的表达调控效果、人工引入发夹结构能否实现表达抑制，以及发夹结构与uorf之间是否存在协同、叠加或拮抗关系，均尚未形成明确的技术方案；现有技术也尚未将5′非翻译区发夹结构的精准改造作为一种独立或联合的通用调控手段，用于目标基因蛋白表达水平的人工干预。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于5′非翻译区发夹结构改造的植物基因表达调控方法及应用，其通过精准改造目标基因mrna 5′非翻译区的发夹结构，和/或联合改造同一区域内的uorf，实现基因翻译效率和蛋白表达水平的双向调控。

2、本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

3、一种基于5′非翻译区发夹结构改造的植物基因表达调控方法，包括如下步骤：

4、（1）获取目标基因的5′非翻译区序列，筛选并确定位于主开放阅读框起始密码子上游的抑制性发夹结构；

5、（2）对所述抑制性发夹结构进行定向改造，改变其对核糖体扫描及翻译起始过程的阻碍作用，调控morf的翻译效率，实现目标基因蛋白表达水平的双向调控。

6、作为本发明的优选方式之一，所述步骤（1）中，筛选并确定抑制性发夹结构的方法包括：对5′非翻译区序列进行rna二级结构预测，得到候选发夹结构；从候选发夹结构中确认能够阻碍核糖体扫描、抑制morf翻译效率的发夹，作为所述抑制性发夹结构。

7、作为本发明的优选方式之一，所述步骤（2）中，抑制性发夹结构的定向改造包括上调表达改造和/或下调表达改造；

8、所述上调表达改造为：对5′非翻译区内天然存在的抑制性发夹结构进行删除或破坏；

9、所述下调表达改造为：在5′非翻译区中人工插入或替换抑制性发夹结构，和/或对原有的抑制性发夹结构进行稳定化改造；更优选为在5′非翻译区中人工插入抑制性发夹结构。

10、作为本发明的优选方式之一，所述下调表达改造中，人工插入或替换得到的抑制性发夹结构位于主开放阅读框起始密码子上游-415bp至-15bp区域内。

11、作为本发明的优选方式之一，还包括对同一5′非翻译区内的uorf进行联合改造，通过发夹结构与uorf的叠加或协同调控效应，实现蛋白表达水平的调控。

12、作为本发明的优选方式之一，所述uorf的改造方式包括减弱或消除其翻译抑制作用的改造和/或增强其翻译抑制作用的改造；

13、所述减弱或消除其翻译抑制作用的改造为：对uorf进行删除、破坏或功能失活；更优选为突变uorf的起始密码子使其功能失活；

14、所述增强其翻译抑制作用的改造为：突变uorf终止密码子，延长uorf，或人工引入uorf；更优选为人工引入抑制型uorf；

15、作为本发明的优选方式之一，所述联合改造至少包括如下协同调控模式：

16、（1）将天然uorf功能失活，同时删除所述抑制性发夹结构，联合提升对下游基因表达效果；

17、（2）向5′非翻译区人工引入uorf，同时删除所述抑制性发夹结构，使下游基因表达水平回升，实现下游基因的梯度表达。

18、作为本发明的优选方式之一，所述植物为水稻、小麦。

19、一种上述植物基因表达调控方法在作物农艺性状改良、合成生物学表达元件构建、外源基因表达优化或者植物基因功能验证中的应用。

20、本发明相比现有技术的优点在于：

21、（1）本发明将抑制性发夹结构作为独立翻译调控元件，无需依赖uorf的存在即可实现目标基因的表达调控，突破了现有翻译调控策略高度依赖内源uorf的局限，为不含天然uorf或uorf调控效果不理想的目标基因提供了全新的表达调控靶点，拓展了5′非翻译区调控工具的适用基因范围；

22、（2）本发明建立了清晰可预测的发夹结构双向调控体系，揭示了5′非翻译区发夹结构调控翻译效率的位置依赖性规律；删除或破坏内源天然抑制性发夹可有效上调下游基因的翻译效率，人工插入或替换抑制性发夹可实现下游基因表达下调；且在主开放阅读框起始密码子上游1~415bp区间内，发夹结构越靠近起始密码子，其对翻译的抑制作用越强，为精准调控蛋白表达幅度提供了明确的设计依据。

23、（3）本发明还揭示了发夹结构与uorf的组合调控特征，证实二者存在叠加或协同调控效应，建立了“发夹结构单独改造”与“发夹结构与uorf联合改造”并行的新型表达调控策略；通过组合改造二者可实现更精细、灵活的表达控制，既可通过“uorf功能失活+删除发夹”获得强于单一元件改造的协同上调效果，也可通过“引入uorf+删除发夹”部分解除翻译抑制，获得中间梯度的表达水平，满足不同场景下的精准调控需求。

24、（4）本发明兼具扎实的机制验证与明确的产业应用价值，既在水稻、小麦原生质体瞬时表达系统中系统验证了调控规律，也通过基因组原位编辑靶向修饰水稻内源osdlt、ossbi基因的5′非翻译区发夹结构，成功获得叶夹角、株高等农艺性状定向改变的突变体，证明该方法可直接应用于作物遗传改良；该方法可广泛应用于作物农艺性状改良（包括抗病抗逆性状调控）、合成生物学表达元件构建、外源基因表达优化、基因功能验证及其他需要精细调控蛋白表达水平的生物技术领域。