抗昆虫CDA纳米抗体及其用途的制作方法

本发明在其一些实施方式中涉及抗昆虫cda纳米抗体及其用途。

背景技术：

1、在过去70年里，昆虫害虫的管理主要是通过施用合成农药来实现的。自paul müller于1939年发现ddt的杀虫特性以来，已经开发了数百种杀虫化合物，同时杀虫剂的使用也相对稳定地增加。目前使用的大多数化学杀虫剂都有很高的破坏生态系统的潜力，它们直接或通过食物链对人类有毒，并且它们的使用也受到昆虫遗传抗性发展的阻碍。目前使用的最突出的生物解决方案包括减少昆虫危害的有益生物或天敌、充当诱饵或危害繁殖的信息素、释放不育雄性、喷洒苏云金芽孢杆菌毒素或使用含有对昆虫致命但对人无害的苏云金杆菌毒素基因的转基因作物。然而，这些生物解决方案也有缺点，包括效率低、有破坏自然生态平衡的危险和发展遗传昆虫抗性（例如，在使用芽孢杆菌毒素的情况下）。

2、纳米抗体，也称为vhh抗体，是单结构域抗体，其实际上含有抗体的重链（hcab），并且完全没有轻链。它们是由雷蒙德·哈默斯在骆驼血液中发现的，他于1989年在布鲁塞尔自由大学获得了这一发现。纳米抗体是最小的可用完整抗原结合片段（cortez–retamozo等人，2004；revets等人，2005），大小约为15kda。纳米抗体具有显著的优势，包括在各种表达系统中的高产量，它们的最小尺寸允许对其表位的高度可及性，高物理化学稳定性，可逆的复性和在水溶液中的高溶解度，高度均匀，没有自发二聚化的迹象，并且能够特异性识别具有亚纳摩尔亲和力的独特表位。先前已经建议使用纳米抗体作为杀虫剂（参见例如ep专利申请公开号：ep3415010和ep2609116；美国专利公开号：us9516879；美国专利申请公开号：us9803003b2；以及国际专利申请公开号wo2014191146）。

3、几丁质脱乙酰酶（cda）是一种将几丁质转化为壳聚糖的酶，从而影响结构（比如角质层和围食膜基质等）的机械和渗透性能。大多数cda样蛋白都具有假定的信号肽，这与它们在形态发生和蜕皮期间修饰角质层和围食膜中的细胞外几丁质的作用一致[dixit r.等人（2008）insect biochem mol biol. 38（4）:440-51]。cda中的缺陷会扰乱昆虫的进食和消化，抑制其生长，损害其发育，并且甚至导致死亡[yinchen等人（2021）j pestic sci. 46（1）：43–52]。事实上，小分子或rna干扰对昆虫cda的抑制显示可诱导发育缺陷、异常生长和蜕皮，并增加死亡率[yingchen等人（2021）j pestic sci. 46（1）：43–52；jian-jian wu等人（2018）insect molecular biology 28（1）：52-64；chikate等人（2016）pestic biochemphysiol. 133：44-51；zhao等人（2021）pesticide biochemistry and physiology 173：104770]。还公开了抗昆虫cda纳米抗体及其作为杀虫剂的用途（国际专利申请公开号wo2021/095031）。

技术实现思路

1、根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种与昆虫cda的非线性表位特异性结合的纳米抗体，该非线性表位在昆虫cda的催化和/或几丁质结合结构域中，其中纳米抗体与昆虫cda结合赋予纳米抗体昆虫防治活性。

2、根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种与昆虫cda的非线性表位特异性结合的纳米抗体，该非线性表位包括选自由seq id no:1的d170、d175、e360、d361、d365、d384、y387、n388、n391、h392、d395、y398、e399、e419、e422、e430、s433和s434组成的组的氨基酸残基，或直系同源多肽中的相应氨基酸残基，其中纳米抗体与昆虫cda结合赋予纳米抗体昆虫防治活性。

3、根据本发明的一些实施方式，昆虫cda的非线性表位包括所有氨基酸残基。

4、根据本发明的一些实施方式，氨基酸残基选自由seq id no:1的e360、d361、d365、d384、y387、n388、n391、h392、d395、y398、e399、e419、e422、e430、s433和s434组成的组，或直系同源多肽中的相应氨基酸残基。

5、根据本发明的一些实施方式，昆虫cda的非线性表位包括seq id no:1的氨基酸残基e360、d361、d365、d384、y387、n388、n391、h392、d395、y398、e399、e419、e422、e430、s433和s434，或直系同源多肽中的相应氨基酸残基。

6、根据本发明的一些实施方式，昆虫cda的非线性表位包括seq id no:1的氨基酸残基e360、d361、d365、d384、h392、e419和e422，或直系同源多肽中的相应氨基酸残基。

7、根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种与昆虫cda的非线性表位特异性结合的纳米抗体，该非线性表位包括选自由v22、e23、l24、c25、d46、i48、i68、e99、p100、l101、c102、r286、a287、g293、g294、n295、n296、q297、m301、e302、e303、q304、l307、y308、d309、s310、t311、i312、p319、p320、p323、y324、t325、y327、f328、h332、r333、c334、h335、g336、n337、l338、q339、s340、c341、p342、t343、r344、w349、e350、m351、v352、n354、e355、d357、r358、e360、p362、n364、e366、m373、v374、d375、n391、h392、d395、y398、e399、a403、p404、l405、g406、r415、s434、m443、t444、q445、v446、i447、q448、p475、c477、w478、v479、p480、s482、c483、k484、l485、t499、c500、v501、r502、p508、l510、n511、d512、d516、g517、h518和y519组成的组的氨基酸残基，或直系同源多肽中的相应氨基酸残基，其中纳米抗体与昆虫cda的结合赋予纳米抗体昆虫防治活性。

8、根据本发明的一些实施方式，昆虫cda的非线性表位包括所有氨基酸残基。

9、根据本发明的一些实施方式，氨基酸残基选自由seq id no:1的w349、e350、m351、v352、n354、e355、d357、r358、e360、p362、n364、e366、m373、v374、d375、n391、h392、d395、y398、e399、a403、p404、l405、g406、r415、s434、m443、t444、q445、v446、i447和q448组成的组，或直系同源多肽中的相应氨基酸残基。

10、根据本发明的一些实施方式，昆虫cda的非线性表位包括seq id no:1的氨基酸残基w349、e350、m351、v352、n354、e355、d357、r358、e360、p362、n364、e366、m373、v374、d375、n391、h392、d395、y398、e399、a403、p404、l405、g406、r415、s434、m443、t444、q445、v446、i447和q448，或直系同源多肽中的相应氨基酸残基。

11、根据本发明的一些实施方式，氨基酸残基选自由seq id no:1的c25、d46、i48、i68组成的组或直系同源多肽中的相应氨基酸残基。

12、根据本发明的一些实施方式，昆虫cda的非线性表位包括seq id no:1的氨基酸残基c25、d46、i48、i68或直系同源多肽中的相应氨基酸残基。

13、根据本发明的一些实施方式，昆虫cda的非线性表位包括seq id no:1的氨基酸残基e350、m351和v352或直系同源多肽中的相应氨基酸残基。

14、根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种与昆虫cda特异性结合的纳米抗体，该纳米抗体包括seq id no:3-5、7-9、11-13、15-17、19-21、23-25、27-29、31-33、35-37、39-41、43-45、47-49、51-53、55-57、59-61、63-65、67-69、71-73、75-77、79-81、83-85、87-89、91-93、95-97、99-101、103-105、107-109、111-113、115-117、119-121、123-125、127-129、131-133、135-137、139-141、143-145、147-149、151-153、155-157或159-161中列出的三个互补决定区（cdr），这三个互补决定区在纳米抗体上按从n到c的顺序排列，其中纳米抗体与昆虫cda的结合赋予纳米抗体昆虫防治活性。

15、根据本发明的一些实施方式，纳米抗体包括seq id no:15-17、83-85或95-97中列出的三个cdr，这三个cdr在纳米抗体上按从n到c的顺序排列。

16、根据本发明的一些实施方式，纳米抗体包括seq id no:15-17中列出的三个cdr，这三个cdr在纳米抗体上按从n到c的顺序排列。

17、根据本发明的一些实施方式，纳米抗体包括seq id no:83-85中列出的三个cdr，这三个cdr在纳米抗体上按从n到c的顺序排列。

18、根据本发明的一些实施方式，纳米抗体进一步包括具有昆虫防治活性的异源毒素部分。

19、根据本发明的一些实施方式，纳米抗体下调昆虫cda的活性。

20、根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种编码纳米抗体的多核苷酸。

21、根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种核酸构建体，其包括多核苷酸和用于指导多核苷酸表达的顺式作用调控元件。

22、根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种宿主细胞，其包括纳米抗体或编码纳米抗体的多核苷酸或核酸构建体。

23、根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种生产昆虫防治纳米抗体的方法，该方法包括培养细胞。

24、根据本发明的一些实施方式，该方法包括分离纳米抗体。

25、根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种昆虫防治方法，该方法包括使昆虫与纳米抗体、编码纳米抗体的多核苷酸或核酸构建体或表达纳米抗体的宿主细胞接触。

26、根据本发明的一些实施方式，接触包括将纳米抗体直接施加到昆虫。

27、根据本发明的一些实施方式，接触包括将纳米抗体施加到可能与昆虫接触的生物体或表面。

28、根据本发明的一些实施方式，纳米抗体被配制为通过喷雾、灌溉和/或熏蒸递送。

29、根据本发明的一些实施方式，纳米抗体被配制为液体制剂。

30、根据本发明的一些实施方式，纳米抗体被配制为干制剂。

31、根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种植物，其包括纳米抗体或编码纳米抗体的多核苷酸或核酸构建体。

32、根据本发明的一些实施方式，植物是转基因植物。

33、根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种包括纳米抗体的商品产品。

34、根据本发明的一些实施方式，商品产品由权利要求31-32中任一项所述的植物生产。

35、根据本发明的一些实施方式，昆虫选自由蛾、粉虱、蚜虫、椿象、叶蝉、甲虫和蜜蜂组成的组。

36、根据本发明的一些实施方式，昆虫是蛾。

37、根据本发明的一些实施方式，蛾是草地贪夜蛾（spodoptera frugiperda）。

38、根据本发明的一些实施方式，昆虫是粉虱。

39、根据本发明的一些实施方式，粉虱是烟粉虱。

40、根据本发明的一些实施方式，昆虫是蚜虫。

41、根据本发明的一些实施方式，蚜虫是桃蚜。

42、除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管在本发明实施方式的实践或测试中可以使用与本文所述类似或等效的方法和材料，但下面描述了示例性方法和/或材料。如有冲突，以专利说明书（包括定义）为准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，并不一定是限制性的。