一种iPSC衍生的通用型脂肪干细胞的制备方法及其应用

本发明涉及生物医药与干细胞工程，具体而言，涉及一种通过诱导多能干细胞（ipsc）定向诱导分化制备为通用型脂肪干细胞细胞（iadsc）的方法，以及该细胞在医学和科研领域的应用。

背景技术：

1、脂肪组织不仅是能量储存器官，同时也是重要的内分泌和免疫调节器官。脂肪干细胞（adsc）在软组织缺损修复、代谢性疾病治疗及免疫调节等领域具有良好的临床应用前景。然而，目前临床使用的原代adsc存在供体异质性大、体外增殖能力受限以及难以标准化生产等问题。利用诱导多能干细胞（ipsc）体外定向分化获取功能性脂肪干细胞（iadsc），是克服上述瓶颈的有效途径。

2、在现有的ipsc向间充质谱系分化的技术方案中，通常生成的是无谱系特异性的通用型ipsc来源间充质干细胞（imsc）。现有imsc分化体系存在以下技术缺陷：第一，缺乏精准的脂肪谱系锁定机制，导致分化产物呈现异质性；第二，受tgfβ/smad信号通路残留的影响，间充质干细胞细胞普遍存在成骨转录程序（如runx2）的背景性激活，导致其成脂分化效率低，且伴随显著的成骨分化倾向。

3、此外，现有分化方案对骨形态发生蛋白（bmp）信号的调控缺乏时序特异性，常在全程使用单一bmp因子，导致细胞在进入中胚层阶段后无法有效特化为脂肪祖细胞。同时，常规方案中过氧化物酶体增殖物激活受体γ（pparγ）激动剂多在细胞成熟阶段才予以添加，错过了细胞命运决定的关键窗口期。因此，本领域需要一种能够特异性阻断成骨转录程序、精准锁定脂肪谱系的分化方案，以获取纯度高且成脂特异性强的脂肪干细胞细胞。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有ipsc来源间充质干细胞成骨偏向显著、脂肪分化潜能低的技术缺陷，本技术提供一种高纯度、高成脂特异性的ipsc来源的脂肪干细胞细胞（iadsc）的诱导分化方法。

2、为解决上述技术问题，本发明的第一方面提供了一种ipsc衍生的通用型脂肪干细胞的制备方法，具体包括以下步骤：

3、s0：ipsc通用化改造：对ipsc进行hla基因敲除编辑，随后通过单克隆化筛选获得hla敲除的ipsc单克隆株；

4、s1：中胚层定向诱导：在第0天至第4天，使用含有sb431542、人重组骨形态发生蛋白bmp4和抗坏血酸2-磷酸的s1培养基培养步骤s0得到的ipsc，以定向诱导轴旁中胚层并阻断神经/外胚层分化；

5、s2：脂肪祖细胞特化扩增阶段：在第5天至第12天，使用含有sb431542、bmp7、罗格列酮、bfgf和抗坏血酸-2-磷酸的s2培养基培养步骤s1所得的细胞，于第12天收获通用型脂肪干细胞；

6、s3：维持扩增：使用不含bmp4或bmp7、罗格列酮及sb431542的s3维持培养基对步骤s2所得细胞进行传代扩增。

7、在所述步骤s0中，所述hla基因敲除采用crispr/cas9系统，靶向为hla-a、hla-b及hla-c基因的保守外显子区域；所述单克隆化通过有限稀释法结合流式细胞术分选hla阴性细胞群获得，并经sanger测序验证敲除效率≥95%且无脱靶效应。

8、在所述步骤s1中，所述s1培养基包含e6基础培养基和如下终浓度的组分：1-5μmsb431542、20-30 ng/ml 人重组骨形态发生蛋白4bmp4、30-60μg/ml抗坏血酸2-磷酸（aa2p），其中，所述e6基础培养基不含转化生长因子β（tgf-β）及碱性成纤维细胞生长因子（bfgf）；细胞接种密度为1×104cells/cm²。优选地，所述s1培养基包含e6基础培养基和如下终浓度的组分：2μm sb431542、25 ng/ml 人重组骨形态发生蛋白4bmp4、50μg/ml抗坏血酸2-磷酸酯镁盐（aa2p），其中，所述e6基础培养基不含转化生长因子β（tgf-β）及碱性成纤维细胞生长因子（bfgf）；其中，细胞接种密度为1×104cells/cm²左右。

9、在所述步骤s2中，所述s2培养基的基础培养基包含dmem/f12培养基和如下终浓度的组分：1-5 μm的sb431542、20-30 ng/ml的bmp7、0.2-1μm的罗格列酮、10-30ng/ml的bfgf、20-100μg/ml的抗坏血酸-2-磷酸，其中，所述dmem/f12培养基含有10%-20% ksr及1%-5%glutamax。优选地，所述s2培养基的基础培养基包含dmem/f12培养基和如下终浓度的组分：2 μm的sb431542、20 ng/ml的bmp7、0.2μm的罗格列酮、10 ng/ml的bfgf、50μg/ml的抗坏血酸-2-磷酸，其中，所述dmem/f12培养基含有10% ksr及1% glutamax。

10、在所述步骤s3中，所述s3维持培养基包含dmem/f12培养基和如下终浓度的组分：5-50ng/ml的bfgf以及30-60μg/ml的抗坏血酸-2-磷酸，所述dmem/f12培养基含有5%-15%fbs。优选地，所述s3维持培养基包含dmem/f12培养基和如下终浓度的组分：10 ng/ml的bfgf以及50 μg/ml的抗坏血酸-2-磷酸，所述dmem/f12培养基含有10% fbs。

11、通过上述制备方法制备得到的ipsc衍生的通用型脂肪干细胞同样在本身的保护范围内。

12、其中，所述通用型脂肪干细胞的细胞学特征为表面标志物cd73、cd90、cd105及cd44呈共阳性；且cd34、cd45、cd11b、cd19hla-a/b/c及hla-dr呈共阴性；其基因表达特征为脂肪祖细胞特征基因zfp423、fabp4、lpl、pparg高表达；成骨相关基因runx2、alpl、col1a1低表达。

13、进一步地，经14天成脂诱导后油红o染色阳性率为75%-90%。

14、本发明还提出了上述ipsc的衍生的通用型脂肪干细胞在制备用于治疗代谢性疾病或软组织缺损药物中的应用。

15、本发明还提出了上述ipsc的衍生的通用型脂肪干细胞在构建体外脂肪代谢疾病模型或筛选促产热药物中的应用。

16、有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

17、（1）建立bmp时序调控机制：本发明在诱导早期的第0至4天采用bmp4启动中胚层发育，在中期的第5至12天将其特异性替换为bmp7。通过bmp7对脂肪谱系主控因子zfp423的特异性激活作用，规避了全程使用bmp4带来的成骨分化倾向。

18、（2）建立全程tgfβ抑制机制：本发明在细胞命运决定的关键窗口期（第0天至第12天），持续维持2μm浓度的sb431542。该手段持续抑制了tgfβ-smad2/3-runx2成骨转录轴，克服了常规体系中撤除抑制剂后引发的成骨信号反弹问题。

19、（3）建立pparγ低剂量预激活机制：本发明突破性地在脂肪祖细胞特化阶段（第5天）即引入0.2-1μm的亚阈值剂量罗格列酮。该低剂量设计能够提前激活pparγ顺式元件以锁定细胞脂肪分化潜能，同时避免了高浓度（>1μm）引发的提前脂化和干性丢失问题，使分化产物获得稳定的脂肪干细胞身份。