一种检测蜜蜂亮热厉螨的组合物、试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及动物卫生，具体涉及一种检测蜜蜂亮热厉螨的组合物、试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、亮热厉螨（tropilaelaps clareae）属于节肢动物门（arthropoda）蛛形纲（arachnida）蜱螨亚纲（acari）寄螨总目（parasitiformes）中气门目（mesostigmata）皮刺螨总科（laelapidae）热厉螨属（tropilaelaps spp），是亚洲地区蜜蜂科（apidae）昆虫的重要害螨，该螨以吸食蜜蜂封盖子的血淋巴为生，引起大量封盖幼虫和蛹变形或死亡，出房工蜂体型畸形和其他生理缺陷，整个蜂群的生产力严重下降，如果控制不力就会导致整个蜂群的死亡。亮热厉螨发育周期短且适应蜜蜂生长发育的条件，种群增长很快，而且可以作为病毒载体，传播蜜蜂病毒病，已成为一种比大蜂螨危害性更大的蜜蜂体外寄生虫。

2、由于亮热厉螨并未对其它地区蜜蜂蜂群造成影响，所以关注度相对较低，基础研究滞后。目前对于亮热厉螨的检测主要采用形态学方法，结合临床症状，通过开盖检查和箱底检查。由于对亮热厉螨各个级型的形态和生活史并不完全清楚，而且成年亮热厉螨出现在寄生蜂群的子脾表面且行动灵活，蜂螨体色与蜡脾颜色接近，易形成体色伪装，增加了亮热厉螨的发现及收集的难度，所以仅靠形态学检查无法准确鉴定。而基于基因组诊断方面的技术目前尚无相关报道，有必要开展相关分子水平诊断计算的探讨， 鉴于此，研究和开发检测蜜蜂亮热厉螨的引物探针组合物及其检测方法，用于蜜蜂亮热厉螨的检测及其与其他蜂螨的鉴别，以及进出口蜜蜂及蜂产品的检疫，对于保障我国养蜂业的发展、生物安全和维护自然生态平衡具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何简单、快速、灵敏和/或特异地检测蜜蜂亮热厉螨（tropilaelaps clareae）。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测蜜蜂亮热厉螨的引物对，所述引物对可为特异性扩增蜜蜂亮热厉螨线粒体细胞色素c氧化酶亚基i（cytochrome coxidase subunit i, coi）基因或含有所述coi基因片段的一对引物，所述coi基因的核苷酸序列可为seq id no.1。atgatctgtcctaattacagcaattctacttttactcagattacccgtcctagctgcagctattactatactcttaactgatcgaaatctaaatacttcattttttgatcctgcaggaggaggagatccaatct

3、进一步地，所述引物对由引物tcl−f和引物tcl−r组成，所述引物tcl−f可为seq idno.2所示的单链dna分子atgatctgtyctaattacagcaa；所述引物tcl−r可为seq id no.3所示的单链dna分子agattggatctcctcctcctg。

4、所述引物tcl−f为正向引物，所述引物tcl−r为反向引物。

5、所述正向引物tcl−f和反向引物tcl−r为特异性扩增蜜蜂亮热厉螨（tropilaelapsclareae）的coi基因的引物对，即用于检测蜜蜂亮热厉螨的特异引物对。

6、本发明还提供了用于检测蜜蜂亮热厉螨的组合物（引物探针组合物），所述组合物可由所述引物对和蜜蜂亮热厉螨特异性探针组成，所述蜜蜂亮热厉螨特异性探针可为与所述coi基因特异结合的单链dna分子cagattaccygtcctagctgcagct。

7、所述探针可为taqman探针，名称为tcl−p。

8、上述组合物中，所述探针tcl−p的核苷酸序列可为seq id no.4。

9、上述组合物中，所述探针tcl−p的5’端标可记荧光基团，3’端可标记淬灭基团。

10、所述荧光基团选自fam、6-fam、vic、hex、trt、cy3、cy5、rox、joe、fitc、tet、ned、tamra、lc red640、lc red705、quasar705或texas red中的至少一种。

11、所述淬灭基团选自tamra、bhq1、bhq2、bhq3、mgb、dabcy1中的至少一种。

12、上述组合物中，所述探针的5’端可标记fam，3’端可标记bhq-1（bhq1）。

13、本发明还提供了用于检测蜜蜂亮热厉螨的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包含所述引物对或本文中任一所述的组合物。

14、进一步地，所述试剂盒还包括pcr扩增所需要的taq dna聚合酶、dntp、pcr缓冲液、mg2+中的一种或多种。

15、所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。

16、进一步地，所述试剂盒还可包括记载有本文中所述检测蜜蜂亮热厉螨的方法的可读性载体。所述可读性载体可为关于实践本发明方法的试剂盒说明书（例如印刷形式的说明书）或在其上已记录了信息的计算机可读的介质（例如软盘、cd等）。

17、本发明还提供了所述引物对，和/或，本文中任一所述组合物的下述任一种应用：

18、a1）在检测蜜蜂亮热厉螨或制备用于检测蜜蜂亮热厉螨的产品中的应用；

19、a2）在检测coi基因或制备用于检测coi基因的产品中的应用；

20、a3）在鉴定或辅助鉴定蜜蜂亮热厉螨中的应用；

21、a4）在制备用于鉴定或辅助鉴定蜜蜂亮热厉螨的产品中的应用；

22、a5）在鉴别区分蜜蜂亮热厉螨和其他蜂螨或制备用于鉴别区分蜜蜂亮热厉螨和其他蜂螨的产品中的应用；

23、a6）在蜜蜂亮热厉螨防控中的应用。

24、本文所述产品可为试剂、试剂盒、芯片或试纸。

25、本发明还提供了非疾病诊断目的的检测蜜蜂亮热厉螨的方法，所述方法可包括使用所述引物对或本文中任一所述组合物对待测样品进行pcr扩增反应，根据pcr扩增产物确定待测样品是否含有蜜蜂亮热厉螨或待测样品是否为蜜蜂亮热厉螨。

26、进一步地，上述方法中，所述pcr扩增反应可为实时荧光定量pcr反应。

27、进一步地，上述方法中，所述实时荧光定量pcr反应体系包括：pcr buffer、mgcl2、dntps、引物tcl−f、引物tcl−r、探针tcl−p、dna聚合酶、待测样品dna、ddh2o。

28、进一步地，上述反应体系中，引物tcl−f和引物tcl−r的摩尔比为1:1。

29、进一步地，上述反应体系中，引物tcl−f、引物tcl−r和探针tcl−p的摩尔比为：1:1:1.6。

30、进一步地，上述反应体系中，引物tcl−f和引物tcl−r的终浓度为0.25 μmol/l。

31、进一步地，上述反应体系中，探针tcl−p的终浓度为0.4 μmol/l。

32、进一步地，所述实时荧光定量pcr反应体系可为：2×pcr buffer 10 μl，25 mmol/l mgcl2 2.0 μl，2.5 mmol/l dntps 1.5 μl，10 μmol/l引物tcl−f 0.5 μl，10 μmol/l引物tcl−r 0.5 μl，10 μmol/l探针tcl−p 0.8 μl，5 u/μl dna聚合酶 0.5 μl，待测样品dna2.0 μl，ddh2o 2.2 μl。

33、所述实时荧光pcr反应程序可为：95℃预变性5 min；95℃变性15 s，58℃退火30s，共40个循环，在58℃进行单点荧光检测。

34、进一步地，所述待测样品可为蜂螨、蜜蜂或蜂蜜、花粉等蜂产品。

35、上述方法中，所述根据pcr扩增产物确定待测样品是否含有蜜蜂亮热厉螨或待测样品是否为蜜蜂亮热厉螨的方法可为下述任一种：

36、b1）根据pcr扩增产物中是否含有一个大小为134 bp的dna片段，确定待测样品是否含有蜜蜂亮热厉螨或是否为蜜蜂亮热厉螨：如果pcr扩增产物中含有一个大小为134 bp的dna片段，所述待测样品中含有蜜蜂亮热厉螨或为蜜蜂亮热厉螨；如果pcr扩增产物中不含有一个大小为134 bp的dna片段，所述待测样品中不含有蜜蜂亮热厉螨或不为蜜蜂亮热厉螨；

37、b2）根据pcr扩增产物的扩增曲线和/或溶解曲线确定待测样品是否含有蜜蜂亮热厉螨或是否为蜜蜂亮热厉螨：如果扩增曲线为s型曲线确定待测样品中含有蜜蜂亮热厉螨或为蜜蜂亮热厉螨；如果扩增曲线不为s型曲线，确定待测样品中不含有蜜蜂亮热厉螨或不为蜜蜂亮热厉螨；如果溶解曲线为单峰型曲线确定待测样品中含有蜜蜂亮热厉螨或为蜜蜂亮热厉螨；如果溶解曲线不为单峰型曲线或无峰，确定待测样品中不含有蜜蜂亮热厉螨或不为蜜蜂亮热厉螨；

38、b3）根据pcr扩增产物的ct值确定待测样品是否含有蜜蜂亮热厉螨或是否为蜜蜂亮热厉螨：如果ct值≤35确定待测样品中含有蜜蜂亮热厉螨或为蜜蜂亮热厉螨；如果ct值>35，确定待测样品中不含有蜜蜂亮热厉螨或不为蜜蜂亮热厉螨。

39、上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。

40、上述方法的待测样品可为来自非有生命的人体或动物体的样品，如蜂箱内环境样品、昆虫样品或蜂产品样品。

41、上述方法可用于亮热厉螨的分类鉴定。

42、本发明根据亮热厉螨coi基因片段序列，并通过筛选、比对选取保守序列作为靶目标，再设计和筛选最优引物和探针、优化反应体系和反应条件，通过一系列创造性的劳动获得了一种检测蜜蜂亮热厉螨的引物探针组合物及其检测方法，用于非诊断为目的的蜜蜂亮热厉螨的检测及其与其他蜂螨的鉴别，以及蜜蜂及蜂产品的海关进出口检疫，对于保障我国养蜂业的发展、生物安全和维护自然生态平衡具有重要意义。

43、本发明的技术方案具有以下有益效果：

44、（1）良好的特异性和稳定性：本发明通过大量dna测序和序列比对分析，筛选了蜜蜂亮热厉螨保守序列片段为靶目标；通过对多组引物进行比较后选定的最佳引物，而且还设计并筛选了一条特异性荧光探针，在实时荧光pcr反应过程中可以对靶目标进行双重控制，对蜜蜂亮热厉螨的检测特异性非常强，与其它蜂螨无交叉反应；相对于重组酶聚合酶等温核酸扩增技术，实时荧光pcr引物长度要求短，不易产生引物二聚体，扩增效果更好，具有较好的重复性；

45、（2）灵敏度高：本发明采用taqman-bhq-1探针，因为bhq-1本身不产生荧光，荧光背景低，所以灵敏性更高，再通过对反应体系和反应条件的多次优化，进一步提升其灵敏度，可达到约2.8拷贝/μl；

46、（3）操作简便、快速：实时荧光收集数据，不需要进行电泳检测核酸的扩增情况，整个反应可在1小时内完成。