一种基于藻蓝蛋白的全细胞生物传感器及其制备方法和应用

本发明涉及一种基于藻蓝蛋白的全细胞生物传感器及其制备方法和应用，属于分子生物学领域。

背景技术：

1、铜是一种重要的微量营养元素，高浓度时会产生毒性，缺乏铜会导致神经和血液疾病。另一方面，铜也作为杀真菌剂、杀藻剂、杀虫剂和木材防腐剂广泛使用。因此，铜的监测至关重要。目前监测铜使用的如电感耦合等离子体质谱（icp-ms）、光学发射光谱（icp-oes）和火焰原子吸收（faa）等方法虽然灵敏度较高，但是耗时、昂贵并且需要特殊的人员。尽管各种化学和生物传感器解决部分问题，但是这些方法仍然不能区分总铜和生物可利用铜。而在评估污染时，优先事项是量化生物可利用的铜，它的数量可能与总铜存在很大的差异。生物可利用的铜只能通过生物体来测量，这推动了基于转录因子的全细胞铜生物传感器的发展。这种活细胞传感器能吸收并特异性的结合环境中铜并且启动报告元件的转录产生可检测的信号。尽管这类全细胞生物传感器有令人满意的分析参数，但是也受到严重的限制。因为它们需要最佳的营养和生长条件（ph，温度），才能产生适当的信号和重现性。而且信号产生依赖于细菌的生长繁殖以及报告元件的成熟，检测时间往往长达数小时。

2、藻蓝蛋白和铜之间能发生相互作用，并且使得藻蓝蛋白的荧光淬灭，这种淬灭效应是剂量依赖性的，由此已经开发出从生物体中提取的藻蓝蛋白α亚基用于对铜的检测。然而，由于认识到上述的这类基于蛋白质而非细胞的生物传感器的局限性，开发基于细胞系统的生物传感器有更大的优势。并且，不同蓝藻的藻蓝蛋白、藻蓝蛋白的不同亚基之间基因和蛋白质结构存在很大差异，这种结构上的差异必然会导致对铜的响应性能的差异。

3、现有技术中，基于转录因子的铜全细胞生物传感器是利用铜对一种嗜热藻藻蓝蛋白β亚基的荧光淬灭效应实现的，可以称为光灭型；而先前的技术是通过转录调控荧光增强效应实现的，可以称为光开型。也有技术是利用铜可以引起某些荧光蛋白的荧光淬灭效应，从而实现对铜的检测。这项技术本质上是基于蛋白质的而非细胞系统，蛋白质的提取是需要复杂的程序和成本的。而且，藻蓝蛋白β亚基和藻蓝蛋白α亚基、甚至不同蓝藻的藻蓝蛋白β亚基在编码基因序列、蛋白质结构上有较大差异，导致它们对铜的响应存在显著差异。

4、因此，获得对铜具有更好传感性能的特殊分子序列也具有重要的意义。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种基于藻蓝蛋白的全细胞生物传感器及其制备方法和应用。

2、技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供一种全细胞生物传感器，其包括genbank登录号：ba000039的thcpcb、genbank登录号：ay804216的spcpcb、genbank登录号：nc_003272的nocpcb或genbank登录号：wp_009454964的macpcb基因。

3、其中，包括核苷酸序列如seq id no.1~4任一条所示的序列。

4、本发明还提供一种制备所述全细胞生物传感器的方法，包括以下步骤：

5、（1）将所述thcpcb、spcpcb、nocpcb或macpcb基因分别插入表达载体petduet的第一个多克隆位点；且将融合酶编码基因cpcs::ho1::pcya亚克隆到表达载体petduet的第二个多克隆位点，最终构建系列质粒petduet-cpcb-cpcs::ho1::pcya；

6、（2）将步骤（1）中所述系列质粒petduet-cpcb-cpcs::ho1::pcya分别转化至大肠杆菌，并用iptg诱导表达，得到所述全细胞生物传感器。

7、本发明还提供一种检测水中铜离子浓度的试剂盒，其含有所述全细胞生物传感器。

8、本发明还提供所述全细胞生物传感器在制备检测水中铜离子浓度的试剂盒中的应用。

9、本发明还提供所述全细胞生物传感器在检测水中铜离子浓度中的应用。

10、其中，检测全细胞生物传感器在644nm处的荧光发射光谱。

11、其中，所述全细胞生物传感器的od600值为0.2~1。

12、进一步优选地，所述全细胞生物传感器的od600值为0.2~0.6。

13、进一步优选地，所述全细胞生物传感器的od600值为0.2~0.4。

14、其中，所述全细胞生物传感器与铜离子的响应时间为15~150min。

15、全细胞生物传感器可在15min内荧光淬灭率已经达到30%左右，可以缩短时间作为检测的时间点。

16、其中，检测温度为10~55℃。

17、进一步优选地，检测温度为25~55℃。

18、进一步优选地，检测温度为37~55℃。

19、进一步优选地，检测温度为25~42℃。

20、温度为42摄氏度时荧光淬灭率最高，达到60%左右。

21、其中，所述全细胞生物传感器的荧光淬灭率与铜离子的浓度的线性关系：y=0.0217x-0.0525，r=0.9999，其中，y为全细胞生物传感器的荧光淬灭率，x为铜离子的浓度。

22、作用原理：含有铜离子的样品（水样或土壤样品）和本技术制备的全细胞生物传感器孵育之后，在最优的温度和细胞密度中，生物可利用的铜离子透过细胞膜的离子通道进入细胞内，细胞内的藻蓝蛋白cpcb和藻胆色素pcb连接后特异性的结合cu2+，使得pcb和cpcb的相互作用发生变化，触发cpcb荧光的淬灭。样品中生物可利用铜浓度越高，进入细胞的铜离子浓度越高，cpcb相应位点结合的铜离子越多，细胞荧光淬灭越大，直到cpcb的铜离子结合位点被完全饱和。因此，可以建立铜离子浓度和细胞荧光淬灭率之间的线性关系。依据样品淬灭荧光的程度和线性方程计算铜离子浓度。

23、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：1、相对基于转录因子的铜全细胞生物传感器，本发明中的铜全细胞生物传感器不依赖细菌的生长繁殖，铜离子进入细胞直接快速与藻蓝蛋白结合使得藻蓝蛋白荧光淬灭，因此，仅在15 min内完成检测；3、相对于基于蛋白质的生物传感器，本发明不需要通过复杂的程序从生物体中提取蛋白质，细胞直接和铜离子反应，传感器细胞的制备十分简单，成本低廉，再现性好；4、本发明最终所制备的生物传感器细胞灵敏度高（检测限低）、特异性强，具备优异的铜离子检测性能；5、本发明技术效果明显，由于成本低廉，将带来巨大的社会效应。

1.一种全细胞生物传感器，其特征在于，其含有genbank登录号：ba000039的thcpcb、genbank登录号：nc_003272的nocpcb或genbank登录号：wp_009454964的macpcb基因。

2.根据权利要求1所述全细胞生物传感器，其特征在于，其含有cpcb-cpcs::ho1::pcya，所述cpcb-cpcs::ho1::pcya的核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.3或seq idno.4任一条所示。

3.一种制备权利要求1或2所述全细胞生物传感器的方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.一种检测水中铜离子浓度的试剂盒，其特征在于，其含有权利要求1或2所述全细胞生物传感器。

5.权利要求1或2所述全细胞生物传感器在制备检测水中铜离子浓度的试剂盒中的应用。

6.权利要求1或2所述全细胞生物传感器在检测水中铜离子浓度中的应用。

7.根据权利要求5或6所述应用，其特征在于，检测全细胞生物传感器在644nm处的荧光发射光谱。

8.根据权利要求5或6所述应用，其特征在于，所述全细胞生物传感器的od600值为0.2~1。

9.根据权利要求5或6所述应用，其特征在于，检测温度为10~55℃。

10.根据权利要求5或6所述应用，其特征在于，所述全细胞生物传感器的荧光淬灭率与铜离子的浓度的线性关系：y=0.0217x-0.0525，r=0.9999，其中，y为全细胞生物传感器的荧光淬灭率，x为铜离子的浓度。