一种突变型信号肽、含有该突变型信号肽的重组载体及其在促进非特异性过氧合酶分泌表达中的应用的制作方法

本发明涉及基因工程，具体涉及一种突变型信号肽、含有该突变型信号肽的重组载体及其在促进非特异性过氧合酶分泌表达中的应用。

背景技术：

1、非特异性过氧合酶（unspecific peroxygenase，upo，ec 1.11.2.1）是一类主要来源于子囊菌和担子菌的胞外分泌型血红素硫醇酶，能够以h2o2直接驱动插氧反应，在无需nad(p)h及伴侣还原酶体系的条件下，实现对惰性c-h键的高选择性羟基化与高效氧官能化，在绿色催化及精细化学品合成领域具有重要的应用潜力。具有同样功能的p450单加氧酶，其催化过程中需要烟酰胺辅酶因子nad(p)h作为电子供体，同时伴有辅因子再生系统，其复杂的电子传递链使得反应难以广泛应用。而upo能够直接利用h2o2作为氧供体和电子受体，因而具有更高的实际应用价值。

2、然而，真菌来源的血红素硫醇酶实现异源高效表达一直以来都是制约上述研究的核心瓶颈。选择适合的表达系统用于该类酶基因的重组表达十分关键。目前已经报道可以异源表达upo的表达系统包括毕赤酵母、酿酒酵母、米曲霉及大肠杆菌等。大肠杆菌表达系统虽然构建速度快，但upo作为含有复杂二硫键和高度糖基化特征的真核蛋白，在原核体系中常因缺乏完善的翻译后修饰机制，导致蛋白错误折叠并形成无活性的包涵体。酵母作为真核表达系统，具备完整的翻译后修饰能力与真核分泌表达通路，是真菌来源复杂异源蛋白重组表达的优良底盘细胞。在酵母分泌表达系统中，n端分泌信号肽是调控新生肽链进入分泌通路的核心元件，决定了转位效率、加工效率与分泌通量。大量研究表明，同一目标蛋白在不同信号肽驱动下常表现出数量级差异的分泌水平，信号肽筛选与定向进化是提升upo异源表达效率的重要策略。

3、尽管已有部分upo通过信号肽工程实现了表达提升，例如专利（申请号：cn202410718369，发明名称：一种表达非特异性过氧合酶cciupo的毕赤酵母重组菌株及其应用）公开了通过密码子优化、定向进化后的ev信号肽替换以及促融标签（如trxa）的添加，并结合高拷贝数转化子筛选与发酵条件优化，成功将cciupo的表达量较野生型提高了10倍。然而由于信号肽宿主特异性强，在一种酵母中优化的信号肽移植到另一宿主后分泌效果往往大幅下降甚至失效；此外，针对某一种蛋白优化的信号肽难以推广至其他异源蛋白，即便同源宿主内，不同目标蛋白的理化性质（如分子量、疏水性、折叠速率）也会显著影响信号肽的识别效率与转运动力学。这种“宿主-蛋白”双重依赖性，使得信号肽的设计缺乏普适规则，大幅增加了研发周期与成本。来自candolleomyces aberdarensis的长型upo（cab4upo），其可高效催化维生素d3的25位羟基化反应生成骨化二醇，在药物中间体合成中具有重要应用价值。其在序列长度、糖基化模式及空间构象上与其它upo存在显著差异。此外，cab4upo催化维生素d3羟基化反应需维持其血红素活性中心的正确折叠与翻译后修饰，这对分泌途径中的易位效率与内质网质量控制提出了更高要求。目前，尚未见针对cab4upo的系统分泌表达优化研究报道，其高效异源表达体系的构建仍是制约该酶产业化应用的瓶颈。

4、因此，建立一种适用于cab4upo的、能够提升其分泌表达的信号肽具有重要的研究意义和应用价值。

技术实现思路

1、本发明以分泌的cab4upo活性为指标，通过abts/nbd反应进行检测，经六轮迭代筛选获得定向进化后的最优信号肽lwvaiv sp。

2、本发明提供了一种突变型信号肽，它是以氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型信号肽wt-sp为亲本，将第2位的v突变为l得到突变体v2l-sp。

3、优选的，以突变体v2l-sp为亲本，将第23位的f突变为w得到突变体v2l-f23w-sp；或将第23位的f突变为y得到突变体v2l-f23y-sp。

4、优选的，以突变体v2l-f23w-sp为亲本，将第4位的k突变为h得到突变体v2l-f23w-k4h-sp；或将第8位的l突变为v得到突变体v2l-f23w-l8v-sp。

5、优选的，以突变体v2l-f23w-l8v-sp为亲本，将第22位的s突变为a得到突变体v2l-f23w-l8v-s22a-sp。

6、优选的，以突变体v2l-f23w-l8v-s22a-sp为亲本，将第7位的a突变为i得到突变体v2l-f23w-l8v-s22a-a7i-sp。

7、优选的，以突变体v2l-f23w-l8v-s22a-a7i-sp为亲本，将第17位的g突变为v得到终代信号肽lwvaiv sp，其氨基酸序列如seq id no.2所示。

8、本发明还提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述任意一项所述的突变型信号肽。

9、本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体包含上述的多核苷酸。

10、本发明还提供了一种重组酿酒酵母菌株，其特征在于：它包含上述的重组载体。

11、本发明还提供了上述突变型信号肽，或上述多核苷酸，或上述重组载体，或上述重组酿酒酵母菌株在提高非特异性过氧合酶或其突变体的分泌表达中的应用。

12、优选的，上述非特异性过氧合酶为cab4upo；上述非特异性过氧合酶突变体为cab4upo-f125m或 cab4upo-f125m-s132i。

13、其中cab4upo、cab4upo-f125m和cab4upo-f125m-s132i即专利（申请号：cn202511631159，发明名称：过氧化物酶cab4upo或其突变体在合成25-羟基维生素d3中的应用以及一种过氧化物酶cab4upo突变体及其用途）公开的序列。

14、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

15、本发明采用六轮迭代定点饱和突变的定向进化策略，针对cab4upo进行渐进式精准优化；终代信号肽lwvaiv sp使cab4upo分泌活性提升约8.5倍，且该提升效果在不同cab4upo突变体上均能稳定重现，证明其具有通用性；本发明还明确了构效关系，明确分泌活性的提升源于h区疏水性增强与酶切位点axa基序优化，为后续改造提供了理论指导。本发明筛选得到的lwvaiv sp在工业酶制剂生产及甾体化合物生物转化中具有较高的应用前景。

1.一种突变型信号肽，其特征在于：它是以氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型信号肽wt-sp为亲本，将第2位的v突变为l得到突变体v2l-sp。

2.根据权利要求1所述的突变型信号肽，其特征在于：它是以突变体v2l-sp为亲本，将第23位的f突变为w得到突变体v2l-f23w-sp；或将第23位的f突变为y得到突变体v2l-f23y-sp。

3.根据权利要求2所述的突变型信号肽，其特征在于：它是以突变体v2l-f23w-sp为亲本，将第4位的k突变为h得到突变体v2l-f23w-k4h-sp；或将第8位的l突变为v得到突变体v2l-f23w-l8v-sp。

4.根据权利要求3所述的突变型信号肽，其特征在于：它是以突变体v2l-f23w-l8v-sp为亲本，将第22位的s突变为a得到突变体v2l-f23w-l8v-s22a-sp。

5.根据权利要求4所述的突变型信号肽，其特征在于：它是以突变体v2l-f23w-l8v-s22a-sp为亲本，将第7位的a突变为i得到突变体v2l-f23w-l8v-s22a-a7i-sp。

6.根据权利要求5所述的突变型信号肽，其特征在于：它是以突变体v2l-f23w-l8v-s22a-a7i-sp为亲本，将第17位的g突变为v得到终代信号肽lwvaiv sp，其氨基酸序列如seqid no.2所示。

7.一种多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸编码如权利要求1-6任意一项所述的突变型信号肽。

8.一种重组载体，其特征在于：所述重组载体包含如权利要求7所述的多核苷酸。

9.一种重组酿酒酵母菌株，其特征在于：它包含权利要求9所述的重组载体。

10.一种权利要求1-6任一项所述突变型信号肽，或权利要求7所述多核苷酸，或权利要求8所述重组载体，或权利要求9所述重组酿酒酵母菌株在提高非特异性过氧合酶或其突变体的分泌表达中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述非特异性过氧合酶为cab4upo；所述非特异性过氧合酶突变体为cab4upo-f125m或cab4upo-f125m-s132i。